Tabela 9. Composição dos ácidos graxos presentes no óleo de algodão.
ÁCIDOS GRAXOS ESTRUTURA Média (%)
Láurico C12:0 ≤ 0,2
Mirístico C14:0 0,6 - 1,0 Palmítico C16:0 21,4 - 26,4 Palmitoleico C16:1 ≤ 1,2
Esteárico C18:0 2,1 - 3,3 Oleico (Ômega 9) C18:1 14,7 - 21,7 Linoleico (Ômega 6) C18:2 46,7 - 58,3 Linolênico (Ômega 3) C18:3 ≤ 0,4
Araquídico C20:0 0,2 - 0,5 Eicosenoico C20:1 ≤ 0,1 Eicosadienoico C20:2 ≤ 0,1
Behênico C22:0 ≤ 0,6
Erúcico C22:1 ≤ 0,3
Docosadienoico C22:2 ≤ 0,1 Lignocérico C24:0 ≤ 0,1
Valores de Referência: Physical and Chemical Characteristics of Oils, Fats, and Waxes - AOCS.
Tabela 10. Determinação do local e da amostra onde foram isolados os fungos filamentosos selecionados do banco de fungos do laboratório.
Fungos Amostra de onde foram isolados Cidade da coleta
P3 Casca de coco Serranópolis de Minas - MG
C435 Fragmento de Jeans em decomposição Diamantina-MG
EA3.3.2 Sementes Diamantina-MG
3.2TA Bagaço cana de açúcar
MB1.1 E MB2.2 Água do Rio Doce Jaíba – ES
EA1.2.1 Folha em decomposição Diamantina-MG
M1.7.1 Casca de árvore Janaúba-MG
Foram coletadas amostras para isolamento de fungos filamentosos provenientes de quatro locais diferentes: banha de porco, borra de café, folhas e terra do pé de jabuticabeira (Plinia cauliflora), e folhas de feijão Andu (Cajanus cajan). As amostras foram coletadas em quantidades consideráveis, de forma asséptica, utilizando luvas cirúrgicas e álcool 70°GL e acondicionadas em frascos de vidro previamente autoclavados e mantidas a temperatura ambiente até o isolamento dos microrganismos.
O isolamento de fungos filamentosos foi realizado em meio de cultivo sólido Aveia (EMERSON, 1941) (Anexo I). Esse meio foi previamente esterilizado, juntamente com placas de Petri, à 120°C e 1,5 atm, durante 30 minutos. Em seguida, o meio de cultivo foi vertido sobre a placa de Petri de forma asséptica, próximo ao bico de Bunsen. Após a solidificação do meio e utilizando pinças previamente autoclavadas, o material coletado foi posto na placa de Petri com aproximadamente 20 mL de meio de cultivo e mantido em estufa bacteriológica à 30°C, sendo analisado a cada 24h.
À medida que os fungos filamentosos foram crescendo, foi realizado o isolamento pontual ao centro de outra placa de Petri contendo o meio sólido de Aveia, utilizando-se palitos de dente previamente autoclavados, sendo mantidos a 30ºC. Durante o isolamento, observaram-se as características macroscópicas morfológica dos isolados quanto à coloração, fundo, pigmentação, textura, superfície, bordas e topografia.
Após a observação dessas características, a identificação dos fungos foi realizada, na qual foram atribuídos números sequenciais para a separação dos mesmos, caracterizados por PJ oriundas do isolamento do pé de jabuticaba e PF das folhas de feijão andu.
4.2 MANUTENÇÃO DE CEPA
As cepas foram mantidas para realização dos experimentos em tubos de ensaio contendo meio Emerson (1941) (Anexo I), previamente autoclavados por 30 minutos a 1,5 atm e 120°C, e após o repique mantidos em estufa bacteriológica à 30oC para o desenvolvimento de cada organismo, após o crecimento os tubos foram armazenados em geladeira a 4ºC.
Elas também foram mantidas em sílica gel (MICHELIN, 2009), onde uma suspensão de esporos foi preparada em 5 mL de solução de leite em pó (200 g/L de água destilada). Dessa suspensão, aproximadamente porções de 1 mL foram adicionados aos tubos de ensaio com tampa e rosca (16 x 100 mm) contendo 6 g de sílica gel de 1 – 4 mm. Estes tubos foram lacrados e armazenados à 4ºC na geladeira, (Figura 10).
Figura 10. Manutenção da Cepa. (A) Fungos filamentosos isolados em potes de plástico contendo meio de Aveia. (B) Suspensão de esporos em sílica gel.
(A) (B)
4.3 MICROCULTIVO
Realizou-se o microcultivo dos fungos isolados de acordo com a técnica de Ridel (LACAZ, 1991) para análise de suas características microscópicas e a possível identificação dos gêneros dos mesmos. Essa técnica consiste na montagem de câmaras de microcultivo, que se baseia numa placa de Petri que contém um papel filtro, uma lâmina e uma lamínula (Figura 11, pág. 48) Após a montagem das câmaras, elas foram submetidas à autoclavagem à 120°C e 1,5 atm durante 30 minutos a fim de serem esterilizadas.
Em ambiente estéril, foi colocado um pequeno pedaço de meio de cultura sólido Batata-Dextrose-Ágar (BDA) Prodimol®, com cerca de 10 mm de espessura, sobre a lâmina. Com a alça de platina foi realizado o inoculo do fungo no meio e nas laterais do meio, e em seguida, colocou-se a lamínula, por fim o papel filtro foi embebido com água destilada, previamente autoclavada, para manter o ambiente úmido e propício ao desenvolvimento do microrganismo.
Ao fim do processo, as placas foram levadas para estufa bacteriológica à 30 °C. Após o
crescimento dos microrganismos, eles foram levados ao microscópio óptico de luz para análise com ampliação de 400 vezes e observação dos isolados.
Figura 11. Câmara de microcultivo.
4.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DO MICRORGANISMO
O MEV foi realizado no Laboratório de Difração de Raios X, AFM e MEV, no Departamento de Química, da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, campus JK, Diamantina-MG. O micélio do fungo foi cuidadosamente fixado em um suporte de amostra (stub), utilizando uma fita condutora dupla face de carbono marca Tedpella®. A morfologia superficial da camada foi examinada utilizando um microscópio eletrônico de varredura da Hitachi modelo TM3000 e as imagens em MEV foram obtidas utilizando uma tensão de aceleração de 15 kV, com ampliações de 1kx, 500x e 250x.
4.5 ANÁLISE DA TEMPERATURA DE CRESCIMENTOS DOS FUNGOS FILAMENTOSOS ISOLADOS
A fim de caracterizar os fungos filamentosos isolados como mesófilos (melhor crescimento entre 30°C e 35°C), termófilos (melhor crescimento entre 45°C e 50°C) e termotolerantes, ou seja, crescem preferencialmente de 30°C a 35°C, mas desenvolvem-se às altas temperaturas (45°C à 50°C), os fungos filamentosos foram submetidos ao teste de temperatura.
Para esse teste, o repique pontual ao centro da placa Petri foi realizado em triplicata no meio de cultivo sólido Aveia (item 4.4.1) e em meio Batata-Dextrose-Ágar (BDA) e posteriormente as placas foram mantidas na estufa bacteriológica com temperaturas variando
de 30°C à 50°C, com variações de 5°C, durante 48h. Para cada temperatura analisada, o raio de crescimento fúngico foi medido, e a taxa de crescimento em centímetros/hora foi calculado (Figura 12).
Figura 12. Determinação do raio do micélio.
4.6 SELEÇÃODE FUNGOS FILAMENTOSOS PRODUTORES DE LIPASES
Para a pré-seleção do fungo filamentoso a ser estudado para a produção de lipases foram utilizados os doze fungos isolados e oito microrganismos do Laboratório de Micologia, Enzimologia e Desenvolvimento de Produtos (LMEDP). Estes foram inoculados em meio de cultura sólido contendo Batata-Dextrose-Ágar (BDA) (20 g/L), peptona (10 g/L), cloreto de sódio (5 g/L), cloreto de cálcio (2 g/L), e Tween 80 (10 mL/L).
Figura 13. Foto representativa do halo enzimático pela liberação de ácidos graxos pelas lipases.
Raio do micélio
Decorrido o tempo de incubação, os halos de atividade lipolítica foram revelados pela adição de solução reveladora (NaOH 0,1 M; fenolftaleína 2%) (item 4.9.1). Os halos de atividade foram identificados pela formação de uma zona clara ao redor da colônia, resultante da acidificação do meio pela liberação de ácidos graxos, contra a coloração rosa no restante do meio. O diâmetro da colônia e o halo de atividade enzimática foram medidos com o auxílio de uma régua milimétrica e utilizados para expressar o crescimento fúngico e a produção de lipase, respectivamente.
O Índice Enzimático (IE) foi expresso pela medida da relação entre o raio do halo enzimático e o raio do crescimento do fungo segundo Hankin & Anagnostakis (1975) (Equação 1):
𝑰𝑬 = 𝒓𝒂𝒊𝒐 𝒅𝒐 𝒉𝒂𝒍𝒐 𝒓𝒂𝒊𝒐 𝒅𝒂 𝒄𝒐𝒍ô𝒏𝒊𝒂 1. Índice Enzimático
Dessa forma, os microrganismos que exibirem os maiores IE nos meios de crescimento são os que possuem maior atividade enzimática extracelular (OLIVEIRA et al., 2006).
Para a solução reveladora (NaOH 0,1M e fenolftaleína 2%) foram dissolvidos 4,0 g de hidróxido de sódio em um pequeno volume de água destilada. Uma segunda solução foi preparada com a dissolução de 2,0 g de fenolftaleína em 40 mL de etanol. Ambas as soluções foram misturadas e o volume foi completado para 100 mL com água destilada.
4.7 INÓCULO
Para os seguintes experimentos foram realizados o inoculo do fungo filamentoso selecionado. As suas culturas foram obtidas mediante inóculo 1,0 mL de solução com esporos ressuspensos em água destilada esterilizada em 25 mL de meio de cultura liquido em erlenmeyer de 125 mL a 30ºC.
4.8 OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO EXTRACELULAR E O MICÉLIO DO FUNGO
Após o crescimento dos fungos, separou-se o micélio do extrato bruto enzimático por filtração à vácuo utilizando um funil de Büchner e papel de filtro Unifil® (12,5 cm de diâmetro).
Após a secagem, o micélio foi pesado em balança analítica, e os extratos brutos foram armazenados em tubos Falcon® de 50 mL e submetidos à medição de volume (mL), pH e a dosagem da atividade enzimática.
4.9 DOSAGEM DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Após decorrido o melhor tempo de inoculo dos fungos filamentosos em estufa a 30ºC os mesmos foram filtrados, pesados e o volume do filtrado foi medido. Em seguida a atividade enzimática sobre o substrato natural das lipases foi quantificada por titulometria. As reações foram realizadas em tubos Falcon de 15 mL contendo o substrato (750 µL de Tween 80 mL, 3,5 mL de Azeite de Oliva, 2,1 mL de tampão) e 700 µL de extrato enzimático bruto. Os tubos contendo apenas os substratos foram inseridos em banho-maria à 50 ºC durante 5 minutos. Após o tempo estabelecido e o equilíbrio da temperatura determinada, inseriu-se o extrato bruto enzimático em cada amostra, respeitando-se o intervalo de tempo de 1 minuto entre uma e outra amostra. A solução de acetona:etanol (Anexo I) foi utilizado para interromper a reação.
Os ácidos graxos produzidos foram titulados com solução aquosa padrão de NaOH 0,02M (Anexo I) usando-se como indicador 2 gotas de solução de fenolftaleína 2% (Anexo I).
Uma unidade de lipase (U) foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar um μmol de ácido graxo por minuto (μmol.min-1), nas condições descritas acima.
Após a titulação das amostras, as atividades lipolíticas foram calculadas segundo a seguinte (Equação 2) (BARON, 2008):
𝐴 = ∆𝑉 ∗ [𝑁𝑎𝑂𝐻] ∗ 𝐹𝐶 𝑡 ∗ 𝑉
2. Atividade lipolítica Sendo:
A = Atividade enzimática (U.mL-1);
ΔV: NaOH consumido na titulação, em mL;
[NaOH]: concentração de NaOH em mol L-1 FC: fator de correção do NaOH;
t: tempo de reação, em minutos (min);
V: volume da solução enzimática (mL);
A determinação da atividade enzimática residual foi calculada de acordo com a (Equação 3):
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙 (%) = 𝑈𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙
𝑈𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 ∗ 100 3. Atividade Enzimática Residual
Onde: Ufinal= atividade enzimática após o período de incubação e;
Uinicial= atividade enzimática antes do período de incubação
4.10 DEFINIÇÃO DO MELHOR MEIO DE CULTURA PARA O CULTIVO DO FUNGO SELECIONADO E ANÁLISE DO TEMPO DE CRESCIMENTO DO MICRORGANISMO PARA PRODUÇÃO DE LIPASE
Foram preparados 25 mL de meio de cultura líquido, contido em frascos Erlenmeyer de 125 mL. Sendo testados os meios líquidos Adams (ADAMS, 1990), Khanna (KHANNA;
1995), Vogel (VOGEL, 1964), M5 (PERALTA; 1990) e SR (RIZZATTI et al., 2001).
Após o preparo do meio de cultura foi realizado o inoculo do microrganismo (item 4.7), sendo mantidos os cultivos durante sete dias a 30ºC, sendo analisado a cada 24. Decorrido o tempo de incubação, foram obtidos o extrato bruto extracelular e o micélio do fungo (item 4.8) e a atividade lipolítica foi determinada (item 4.9).
Figura 14. Imagem representativa da fermentação submersa para produção de lipases pelos fungos filamentosos.
4.11 ANÁLISE DE DIFERENTES FONTES DE NITROGÊNIO DO MEIO DE CULTURA NA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA
A influência da fonte de nitrogênio sobre a produção de lipases foi avaliada, e para isso, após a seleção do meio de cultura padrão e tendo o azeite de oliva Sinhá como fonte de carbono, algumas fontes nitrogenadas foram analisadas a fim de otimizar a produção enzimática, sendo substituída a fonte de nitrogênio original do meio de cultura padrão selecionado, variando a fontes de peptona, KNO3, úreia e suas combinações.
Os controles foram o meio original com a sua fonte de nitrogênio. Foi realizado o inoculo do microrganismo (item 4.7), sendo mantidos os cultivos durante o melhor tempo de crescimento selecionado a 30ºC. Decorrido o tempo de incubação, foram obtidos o extrato bruto extracelular e o micélio do fungo (item 4.8) e a atividade lipolítica foi determinada (item 4.9).
4.12 ANÁLISE DE DIFERENTES FONTES DE SAIS DO MEIO DE CULTURA NA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA
Após escolher a fonte de nitrogênio, o fungo foi cultivado no meio de cultura padrão selecionado modificado, variando a fonte de sais, sendo essas: solução de sais Vogel, solução de sais Khanna e solução de sais CP e variando a combinação entre essas soluções de sais, sendo mantidos em estufa bacteriológica à 30ºC. Foi realizado o inoculo do microrganismo (item 4.7), sendo mantidos os cultivos durante o melhor tempo de crescimento posteriormente.
Decorrido o tempo de incubação, foram obtidos o extrato bruto extracelular e o micélio do fungo (item 4.8) e a atividade lipolítica foi determinada (item 4.9).
4.13 ANÁLISE DO PH INICIAL DO MEIO DE CULTURA NA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA
O pH inicial do meio de cultura padrão selecionado acrescido da solução de sais e de fonte de nitrogênio, foi analisado a fim de se determinar o pH adequado para a produção enzimática. Para isso, preparou-se o meio de cultura, variando o pH de 4,0 a 6,0 com intervalos de 0,5 unidades de pH. Foi realizado o inoculo do microrganismo (item 4.7), sendo mantidos os cultivos durante o melhor tempo de crescimento selecionado a 30ºC. Decorrido o tempo de incubação, foram obtidos o extrato bruto extracelular e o micélio do fungo (item 4.8) e a atividade lipolítica foi determinada (item 4.9).
4.14 ANÁLISE DE DIFERENTES FONTES DE CARBONO
Analisou-se a influência de distintas fontes de carbono, todos na concentração de 1%
(m/v), na produção enzimática. O fungo foi cultivado em meio de cultura padrão selecionado (fonte de nitrogênio, fonte de sais e pH inicial já selecionados posteriormente) variando as fontes de carbono: óleos de canola (Brassica napus L.), dendê (Elaeis guineensis Jacq.), soja (Glycine max (L.) Merr.), milho (Zea mays L.) girassol (Helianthus annuus L.) e algodão (Gossypium hirsutum L.).
Foi realizado o inoculo do microrganismo (item 4.7), sendo mantidos os cultivos durante o melhor tempo de crescimento selecionado a 30ºC. Decorrido o tempo de incubação, foram obtidos o extrato bruto extracelular e o micélio do fungo (item 4.8) e a atividade lipolítica foi determinada (item 4.9).
4.15 CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA
4.15.1 EFEITO DO PH E TEMPERATURA
Caracterizou-se bioquimicamente a lipase quanto ao efeito do pH e da temperatura na atividade enzimática, utilizando-se o planejamento experimental com o objetivo de determinar as melhores condições para a atividade com número reduzido de experimentos.
Usou-se o método de Delineamento Composto Central Rotacional com duas variáveis (DCCR2), totalizando 11 ensaios para investigação de um modelo linear, 3 pontos centrais e 4 ensaios distribuídos rotacionalmente (pontos axiais) a uma distância α do ponto central. O valor de α ortogonal foi 1,41 e os valores estão demonstrados na (Tabela 11) conforme equação.
Avaliou-se simultaneamente os efeitos da temperatura (X1) e do pH (X2), com os valores centrais de pH de 6,5 com intervalo 1,5 e a temperatura variando de 30 ºC (-1) a 80 ºC (+1) com ponto central de 60 oC.
A determinação da atividade enzimática foi realizada de acordo:
𝑋1 = 𝑇−6,5 1,5 𝑒 𝑋2 =𝑝𝐻−60 20
Planejamento fatorial com valores codificados, valores originais X1 = pH e X2 = temperatura.
Tabela 11. Planejamento fatorial.
4.15.2 ESTABILIDADE DA ENZIMA À DIFERENTES TEMPERATURAS
A estabilidade da enzima em diferentes temperaturas foi realizada na faixa de 50ºC a 70ºC, com intervalos de 5ºC, ou seja, 50, 55, 60, 65, 70ºC, a cada 30 minutos até 240 minutos.
A dosagem da atividade enzimática, para cada tubo-referente a cada tempo de cada temperatura foi determinada (item 4.9).
Experimento X1 X2 X1 =( pH) X2 = (T oC)
1 -1 -1 5 40
2 1 -1 8 40
3 0 1 5 80
4 1 1 8 80
5 -1,41 0 4,4 60
6 1,41 0 8,6 60
7 0 -1,4 6,5 32
8 0 1,41 6,5 88
9 0 0 6,5 60
10 0 0 6,5 60
11 0 0 6,5 60
4.15.3 ESTABILIDADE AO PH
A estabilidade da enzima foi analisada em diferentes pHs variando de 4,5; 5,0; 5,5; 6,0;
6,5 e 7,0. Em seguida foram adicionados na proporção (1:1) enzima + tampão a um tubo e mantidos no gelo por diferentes tempos (30 min, 60 min, 90 min, 120 min 180 min. e 240 min).
A dosagem da atividade enzimática, para cada tubo-referente a cada tampão e tempo foi determinada (item 4.9).
4.15.4 ESTABILIDADE A SOLVENTES
A estabilidade a solventes foi determinada incubando-se as amostras em solventes orgânicos, por 24 horas, na proporção 1:1 (extrato bruto/solvente). Os solventes utilizados foram: dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, acetonitrila, etanol, acetona, isopropanol e butanol.
A dosagem da atividade enzimática, foi determinada (item 4.9).
4.16 CARACTERIZAÇÃO FISICO-QUÍMICA DOS ÓLEOS
4.16.1 ÁCIDOS GRAXOS LIVRES (AGL)
Ácidos graxos livres - denomina-se "grau de acidez" à porcentagem de ácidos graxos livres que contém um óleo, foram analisadas em óleos in natura e após hidrolise enzimática.
Foi utilizado o método AOCS Cd 3d-63 (AOCS, 1993).
4.16.2 ÍNDICE DE PERÓXIDOS (IP)
Índice de peróxidos - expressos em milequivalentes de oxigênio ativo contidos em um quilograma de óleo, foi calculado a partir do iodo liberado do iodeto de potássio, operando nas condições indicadas no método proposto pela AOCS Cd 8-53 (AOCS, 1993).
4.16.3 ÍNDICE DE SAPONIFICAÇÃO (IS)
Índice de saponificação - é definido pela quantidade em miligramas de hidróxido de potássio necessária para saponificar 1,0 grama de óleo ou gordura. Foi utilizado o método recomendado pela AOCS Cd 3c - 91 (AOCS, 1993).
4.16.4 MATERIAL INSAPONIFICÁVEL (MINSAP)
Métodos descritos pela AOAC (HORWITZ, 2000) e por (MORETTO & FETT, 2002).
Em um balão de fundo chato pesaram-se 2,00 g do óleo e adicionaram-se 25,0 mL de solução etanólica de hidróxido de potássio 0,5N. Um sistema de refluxo foi adaptado a este balão e a amostra foi aquecida até a ebulição, por um período de 30 min. Em seguida esperou-se o
resfriamento e o conteúdo foi transferido para um funil de separação de 250 mL, adicionou-se 50 mL de éter etílico. Em seguida a fase etérea foi retirada. Este processo foi realizado três vezes, obtendo 150 mL de fase etérea, a mesma foi transferida para pra um funil de separação de 250 mL, adicionou-se 50 mL de água destilada. Após retirar a fase aquosa, adicionou-se 20 mL de hidróxido de potássio 0,5N. Coletou-se a fase aquosa e em seguida a fase etérea foi novamente lavada com água destilada até que não apresentasse mais alcalinidade frente a fenolftaleína. A fase etérea foi transferida para um frasco tarado, após evaporação do solvente, pesou-se o frasco com a amostra até peso constante.
% 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑖𝑛𝑠𝑎𝑝𝑜𝑛𝑖𝑓𝑖𝑐á𝑣𝑒𝑙 =𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 × 100 4. Porcentagem de material insaponificável
4.17 ANÁLISE DOS EXPERIMENTOS
Os experimentos e ensaios foram realizados em duplicata ou triplicata. Os experimentos foram analisados com base na média e no desvio padrão. Para os experimentos de superfície de resposta foi aplicada análise estatística ANOVA pelo teste de Tukey. Para a análise dos experimentos e representação gráfica foram utilizados os programas Microsoft Office Excel 2007, Origin Pro 8.