ANÁLISE DE DIFERENTES FONTES DE CARBONO

Foram utilizados óleos de oliva (Olea europaea L.), de canola (Brassica napus L.), dendê (Elaeis guineensis Jacq.), soja (Glycine max (L.) Merr.), milho (Zea mays L.) girassol (Helianthus annuus L.) e algodão (Gossypium hirsutum L.). Os meios de cultura Adams e preparados com 0,1% de fonte de nitrogênio (úreia, extrato de levedura e peptona), solução de sais CP+Khanna, pH inicial 4,0 e foram complementados com 1% de cada um dos tipos de óleos. As culturas foram incubadas a 30°C em estufa bacteriológica de forma estacionária por 72 horas.

De acordo com a (Tabela 21) as melhores atividades frente a fontes de carbono foram em óleo de oliva (4,47 U mL-1) seguido do milho (4,40 U mL-1). O óleo de oliva foi a melhor fonte de carbono.

Tabela 21. Efeito de diferentes fontes de carbono na produção de lipases.

Fonte de Carbono Atividade enzimática (U totais) Azeite de oliva 4,47 ± 0,01 a

Canola 4,30 ± 0,02 c

Milho 4,40 ± 0,02 b

Soja 4,31 ± 0,03 c

Dendê 3,61 ± 0,01 d

Girassol 3,66 ± 0,02 d

Algodão 4,26 ± 0,02 c

O fungo foi inoculado em meio Adams contendo ureia+peptona+extrato de levedura como fonte de nitrogênio, sais CP+Khanna, pH inicial de cultivo 4,,0 mantido por três dias, à 30 °C, de forma estacionária em estufa

bacteriológica. Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5 % de probabilidade. As médias seguidas pela mesma letra na coluna (minúscula) não diferem estatisticamente entre si.

A produção de lipases pode ser influenciada pelo tipo e concentração das fontes de carbono e nitrogênio, pH do meio, temperatura e concentração de oxigênio dissolvido no caso do bioprocesso submerso (SHARMA et al., 2001). A fonte de carbono é um componente do meio de cultura que tem grande influência na produção enzimática; é ela que induz ou inibe a produção e secreção de determinadas enzimas. A fonte de lipídios influencia tanto no crescimento do microrganismo como na indução da produção de lipases. Objetivando testar a influência de diferentes óleos como fonte de carbono e indutor da produção de lipases pelo fungo estudado, realizou-se um experimento utilizando óleos de origens diferentes nos meios de cultura.

É um fator mais importante para a expressão dessas enzimas. As fontes de carbono atuam tanto como fonte de energia e também como meio indutor (SHARMA et al., 2001;

KUMAR et al., 2011; COLLA et al., 2012).

Em estudos semelhantes realizados por Ellaiah e colaboradores (2004), o azeite de oliva foi utilizado para a produção de lipases por células livres e imobilizadas de Aspergillus niger.

Foram testadas concentrações de 0 a 1,25% de azeite de oliva, sendo as maiores atividades enzimáticas obtidas na concentração de 1% da fonte de carbono, tanto pelas células livres como pelas imobilizadas. Já D’Annibale e colaboradores (2006) estudaram a utilização de efluentes do processo de extração de azeite de oliva como substratos para a produção de lipases. Foram testados vários microrganismos, dentre os quais Aspergillus oryzae, A. niger, Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Penicillium citinum, Rhizopus arrhizus e R. oryzae. O microrganismo que apresentou os melhores resultados foi C. cylindracea, o qual foi estudado como modelo. A produção de lipases foi afetada pela adição de fontes de carbono suplementares como o azeite de oliva e os óleos de soja e milho, na concentração de 3,0 g L^-1. A adição do azeite de oliva aumentou a atividade enzimática de 1,24 para 9,0 U mL^-1, enquanto que a adição dos óleos de milho e soja resultou em atividades de 6,42 e 6,34 U mL^-1, respectivamente.

A literatura mostra que fontes de carbonos lipídicas são essenciais para o crescimento do fungo e também para obter um alto rendimento de lipases (SHARMA, et al. 2001). Vários autores reportam a produção de lipases por fungos e bactérias em cultivo submerso suplementado com óleo de oliva, sendo que alguns trabalhos mencionam azeite de palma, Tween 20 e 40, trioleína e tripalmitina, óleos de soja, algodão, girassol e milho como fonte de carbono para a produção de lipases microbianas. Uma boa produção de lipases foi obtida de Cordyceps brongniartii quando este foi incubado em meio contendo óleo de canola, milho e

gergelim, A. niger teve melhor atividade específica quando cultivado em meio suplementado com óleo de gergelim, girassol e azeite de dendê e Penicillium purpurogenum teve melhor crescimento em óleo de macaúba, soja e girassol (VICI, 2008).

Vários isolados de Botryosphaeria spp. apresentaram crescimento em diferentes óleos vegetais, entre eles babaçu, canola, algodão, girassol e azeite de oliva (MESSIAS, et al. 2009).

Rahman e colaboradores (2006) testaram a influência de diferentes óleos e de triglicerídeos sintéticos na produção de lipase pela bactéria Pseudomonas sp, obtendo como melhor resultado o cultivo em meio suplementado com óleo de oliva 0,5%. LIMA e colaboradores (2003) estudaram o uso de óleo de oliva, soja, milho e girassol, obtendo maior produção de lipases por P. aurantiogriseum com óleo de oliva.

A fonte de carbono exerce grande influência na produção enzimática, sendo capaz de induzir ou inibir a secreção de lipase. A fonte de lipídios influencia tanto no crescimento do microrganismo como na indução da produção de lipases. Óleos de origens diferentes apresentam composições e concentrações distintas de ácidos graxos (SHARMA, et al. 2001).

Comparando a composição dos ácidos graxos presentes em cada óleo com sua atividade enzimática pode-se observar que a maior atividade foi no óleo de oliva, que possuem em sua composição o ácido oleico (C18:1) como ácido graxo majoritário. A maior atividade enzimática pode ser explicada pelo fato do ácido oleico ter ligação dupla no carbono nove. Pois de acordo com Cortez e colaboradores (2017), a atividade está relacionada sobre determinada região do triacilglicerol para as lipases ácido graxo específicas, elas catalisam a hidrólise de ésteres cujos ácidos graxos são de cadeia longa insaturada, contendo dupla ligação cis no carbono 9 conforme.

YANG et al. 2005, ZENG et al. 2006 e WANG et al.2008, observaram que os diferentes efeitos dos óleos na produção de lipase por R. oryzae e Rhizopus arrhizus são causados pelos ácidos graxos presentes em sua composição, e a produção da enzima está relacionada aparentemente com a quantidade de ácido oleico presente em cada óleo, o que foi observado no presente trabalho. A utilização de óleos refinados como substrato no meio de cultivo aumentou a atividade catalítica das células íntegras, e dentre diversos óleos testados, o óleo de oliva foi o que promoveu atividades lipolíticas mais elevadas.

A maioria dos óleos analisados possuem em sua composição o ácido oleico e o linoleico como majoritários. O óleo de milho obteve atividade de 4,40 U mL^-1, a segunda melhor atividade de acordo com a análise estatística, esse fato pode ser explicado pelo ácido linoleico (C18:2) ser o ácido majoritário em sua composição.

A menor atividade enzimática obtida foi com o óleo de dendê (3,61 U mL-1), esse fato

(C16:0). Entretanto, sua presença pode aumentar o nível de atividade lipolítica. Por outro lado, há microrganismos que preferem, por exemplo, óleo, triacilgliceróis ou qualquer outro indutor como ácidos graxos, do que fontes de carbono simples como açúcares, para a produção da enzima. Deste modo, as fontes de carbono lipídicas podem ser consideradas essenciais para a obtenção de um alto rendimento em lipase (ZAREVÚCKA, 2012).

Andrade e colaboradores 2014, avaliaram o efeito dos óleos vegetais de soja, de girassol, de linhaça, castanha-do-pará e de oliva sobre o crescimento celular e a atividade lipolítica de Mucor circinelloides. Todos os óleos favoreceram as variáveis respostas, sendo os valores máximos obtidos quando foi utilizado o óleo de oliva. Segundo os autores, estes resultados podem estar relacionados à alta proporção de ácido oleico (70%) no óleo de oliva.

Maia e colaboradores (2001) utilizando um meio de cultura consistindo de 0,11% de MgSO4.7H2O, 0,001% de FeSO4, 0,015% de ZnSO4, 0,015% de NaCl, 0,015% de KH2PO4 e 0,3% de NaNO3, avaliou a influência de óleos vegetais (0,5%) e trioleína (0,5%) como fonte de carbono em um processo de Fermentação Submersa. O agente fermentador avaliado foi o fungo Fusarium Solani e melhor atividade lipolítica foi obtida quando utilizado o óleo de gergelim (0,88 U/mL).