SCREENING DE FUNGOS FILAMENTOSOS PRODUTORES DE LIPASES

função das biomoléculas e a manutenção das estruturas biológicas. A maioria dos organismos atualmente conhecida pode crescer somente dentro de uma faixa estreita de temperatura.

Entretanto, a existência de ambientes geotermicamente estáveis tem permitido a seleção ou a persistência de microrganismos que não apenas resistem, mas também requerem altas temperaturas para sobreviver.

Organismos que conseguem crescer em temperaturas mais elevadas apresentam vantagens, visto que geralmente produzem enzimas termoestáveis as quais possuem aplicação na indústria, visto que processos biotecnológicos são na maioria das vezes conduzidos em elevadas temperaturas (PALMA, 2002; MCCARTHY et al., 2005). Este termo estabilidade dos fungos tem papel importante na caracterização dos microrganismos, e permite conhecer o quanto os fungos podem crescer frente à variação de temperatura. Aqueles organismos classificados como forma mesófila envolve a maioria dos microrganismos. Vale citar que há alguns microrganismos que podem crescer em temperaturas mais altas, chamados termotolerantes (PELCZAR et al., 1997).

Estudos semelhantes têm sido relatados na literatura, na análise de crescimento em diferentes temperaturas, realizada por Souza em meio BDA de 35˚C a 50˚C, variando a cada 5˚C, concluiu-se que todos os microrganismos isolados são mesófilos porque todos cresceram a 35°C. Treze fungos desenvolvidos a 40˚C, sete cresceram a 45˚C e três fungos se desenvolveram a 50˚C, o que não ocorreu nas análises do autor onde nenhum fungo se desenvolveu a 50°C (SOUZA et al., 2020).

Ordaz et al., (2003) e Belli et al., (2004) observaram resultados semelhantes aos encontrados no experimento pelo fungo 3.2TA, onde ambos observaram o melhor crescimento fungico em linhagens de Aspergillus na temperatura de 30 a 37 ^oC.

No trabalho de Benassi (2018) dos dezesseis fungos filamentosos isolados todos cresceram a 30 ^oC e apenas um a 35 ^oC, sendo observado que a 40 ^oC houve uma queda significativa do crescimento dos fungos e a 45 ^oC 89% dos microrganismos não se desenvoveram. No mesmo trabalho dez fungos provenientes de frações de mandioca em estado de deterioração obtiveram um maior crescimento nas temperatturas de 30 e 35 ^oC, a 40 ^oC apenas dois fungos não cresceram e a 45 ^oC nenhum cresceu.

5.4 SCREENING DE FUNGOS FILAMENTOSOS PRODUTORES DE LIPASES

os únicos dos fungos isolados que apresentaram halo de atividade lipolítica (0,39 cm e 0,24 cm, respectivamente, (Tabela 15).

Dentre os fungos do banco, os que obtiveram maiores halos de crescimento foram 3.2TA (7,18 cm), MB2.2 (6,45 cm) e PH3 (5,91 cm), sendo que o MB2.2 e PH3 não apresentaram halos de atividade lipolítica. Já o fungo 3.2TA apresentou um halo de atividade lipolítica de 0,92 cm, seguido do fungo MT171 (0,31 cm), (Tabela 16, pag. 69).

Pode-se concluir que a maior produção de lipase ocorreu pelos fungos 3.2TA (0,92 cm), PJ12 (0,39 cm), MT171(0,31 cm) e PJ4 (0,24 cm).

Os fungos filamentosos são microrganismos que se destacam devido à sua grande facilidade de cultivo, por secretarem suas enzimas diretamente no meio de produção, não sendo necessária, assim, a ruptura celular para a sua liberação. Adicionalmente, apresentam elevados níveis de produção enzimática, com elevado potencial para inúmeras aplicações industriais (NASCIMENTO et al., 2014).

Para os países que se encontram diante de uma alta biodiversidade, como o Brasil, torna-se fundamental a busca por novas linhagens que produzam enzimas de interestorna-se comercial (VARGAS, 2004; RODEVA et al., 2010). Dessa forma, achou-se necessária a busca de novas linhagens com potencial de produção da enzima lipase.

Tabela 15. Halo de crescimento fúngico (centímetros) e halo enzimático (centímetros) obtidos pelos fungos isolados em meio de cultura sólido contendo azeite.

Fungos Halo de crescimento (cm)

Halo enzimático (cm)

PJ1 1,53 ± 0,01 e - c

PJ2 1,46 ± 0,01 f - c

PJ3 1,25 ± 0,01 g - c

PJ4 1,53 ± 0,03 e 0,24 ± 0,02 b

PJ5 1,11 ± 0,01 h - c

PJ6 6,82 ± 0,02 b - c

PJ7 - i - c

PJ8 7,06 ± 0,03 a - c

PF9 - i - c

PF10 3,33 ± 0,01 c - c

PF11 1,53 ± 0,01 e - c

PJ12 1,97 ± 0,02 d 0,39 ± 0,01 a

Os fungos foram cultivados em meio teste enzimático sólido para lipase (item 4.2) durante quatro dias, em estufa bacteriológica, à 30ºC. O símbolo “–” representa os microrganismos que não cresceram. Foi aplicado o Teste de

Tukey ao nível de 5% de probabilidade. As médias seguidas pela mesma letra na coluna (minúscula) não diferem estatisticamente entre si.

Tabela 16. Halo de crescimento fúngico (centímetros) e halo enzimático (centímetros) obtidos pelos fungos do banco em meio de cultura sólido contendo azeite.

Fungos Halo de crescimento (cm)

Halo enzimático (cm)

PH3 5,91 ± 0,01 c - c

C435 2,96 ± 0,01 d - c

EA332 1,94 ± 0,03 f - c

3.2TA 7,18 ± 0,01 a 0,92 ± 0,01 a

MB 1.1 1,07 ± 0,02 h - c

EA121 1,52 ± 0,03 g - c

MT171 2,08 ± 0,03 e 0,31 ± 0,01 b

MB 2.2 6,45 ± 0,01 b - c

Os fungos foram cultivados em meio teste enzimático sólido para lipase (item 4.2) durante quatro dias, em estufa bacteriológica, à 30ºC. O símbolo “–” representa os microrganismos que não cresceram.

Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. As médias seguidas pela mesma letra na coluna (minúscula) não diferem estatisticamente entre si.

Diversos microrganismos, dentre bactérias, leveduras e fungos, têm a capacidade de produzir e secretar grandes quantidades de lipases (TREVISAN, 2004). TREICHEL e colaboradores (2010) destacam-se alguns microrganismos como fontes de lipase, como os fungos: Penicillium citrinum, Rhizopus homothallicus, Rhizopus oryzae, Aspergillus niger, Geotrichum sp.; as leveduras: Yarrowia lipolytica, Candida sp., Trichosporon asahii; e as bactérias: Pseudomonas sp., Bacillus stearothermophilus, Serratia rubidaea. MAROTTI e colaboradores (2017) listaram espécies de microrganismos do gênero Penicillium capazes de produzir lipases. Dentre estes, destaca-se: espécies P. roqueforti, P. janthinellum, P.

purpurogenum e P. italicum. Enquanto Kleinert (2020) avaliou a levedura utilizando cepas de Y. lipolytica para produção de lipase.

Em um experimento realizado por Colen & Moraes (2006), os autores observaram cepas fúngicas isoladas a partir da Savana brasileira, onde 25 delas apresentaram halos lipolíticos.

LIMA (2004), utilizando o óleo de oliva, selecionou cepas fúngicas e bacterianas onde foram analisadas como boas produtoras de lipase.

Almeida e colaboradores (2018), otimizaram o processo de produção de novas lipases em cultivo líquido, utilizando 4 isolados microbianos onde foi possível concluir que os microrganismos analisados possuem potencial de aplicação em bioprocessos na agroindustriais.

Paludo et al., (2018) analisou 205 linhagens de leveduras da Universidade Federal do Tocantins e foram isoladas de folhas em decomposição coletadas em 3 córregos no município de Taquaruçu. A produção de lipase foi determinada em meio contendo peptona, NaCl, CaCl2, agar e Tween-20. Das 205 linhagens avaliadas, 141 (68,8%) apresentaram resultado positivo para pelo menos uma das enzimas testadas, sendo 83 para lipase (40,5%), 59 para celulase (28,8%), 30 para xilanase (14,6%) e 35 para amilase (17,1%).

Rodrigues et al, 2016 avaliou a atividade lipolítica extracelular de quarenta e um isolados fúngicos em meio sólido MB constituído de peptona, NaCl, CaCl2, ágar e Tween 80 onde dez desses fungos apresentaram atividade.

As lipases apresentam importante potencial biotecnológico. Dentre suas diversas aplicações industriais destacam-se o uso na indústria de detergentes, substituindo com vantagem produtos usados para decompor as gorduras, já que são biodegradáveis e reduzem o uso de água durante o enxágue (BANSODE & RATHOD, 2017; SAMOYLOVA et al., 2019);

na produção de biopolímeros, onde as lipases são usadas como biocatalisadores (GROSS et al,.2001), dispensando o uso de temperaturas altas e reduzindo gastos excessivos com energia;

na produção de biodiesel, atuando como catalisador do processo de transesterificação de óleos vegetais a ésteres (NORJANNAH et al., 2016; ZHANG, 2019); na indústria alimentícia, substituindo produtos químicos na diminuição da turbidez de sucos de frutas, e para conferir sabor e aroma a queijos, na produção de complementos nutricionais (PRIYANKA et al., 2018;

GUIDINI, 2019); na indústria de cosméticos para a produção de surfactantes e novos aromas que são os principais componentes para a fabricação de perfumes e cosméticos (KHAN &

RATHOD, 2015; BELI et al., 2019).

No campo dos biocombustíveis, as lipases têm sido utilizadas como catalisadoras do processo devido à redução do custo energético e o baixo impacto ambiental. Dessa forma, faz-se necessário o estudo de lipafaz-ses produzidas por fungos filamentosos para aplicação biotecnológica.

A seleção de microrganismos produtores de enzimas de interesse biotecnológico mostra-se como uma etapa importante nos processos de pesquisa onde serão empregadas. Sabe-se que cada espécie de microrganismos produz um pool enzimático característico; contudo, a quantidade absoluta e relativa dessas enzimas varia bastante não apenas de uma espécie para outra, mas também entre diferentes linhagens da mesma espécie (MICHELIN, 2009). Portanto, a realização de uma triagem foi de extrema importância para a seleção do microrganismo produtores de lipase, sendo selecionado o fungo filamentoso 3.2TA.