“Júlio de Mesquita Filho”
Faculdade de Odontologia de Araraquara
KAHENA RODRIGUES SOLDATI
INFLUÊNCIA DO TABAGISMO NOS NÍVEIS DE CATELICIDINA E ALFA-DEFENSINAS NO FLUIDO GENGIVAL DE PACIENTES COM PERIODONTITE
CRÔNICA
Araraquara
“Júlio de Mesquita Filho”
Faculdade de Odontologia de Araraquara
KAHENA RODRIGUES SOLDATI
INFLUÊNCIA DO TABAGISMO NOS NÍVEIS DE CATELICIDINA E ALFA-DEFENSINAS NO FLUIDO GENGIVAL DE PACIENTES COM PERIODONTITE
CRÔNICA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Odontologia – Área de concentração em Periodontia, da Faculdade de Odontologia de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista – UNESP, para obtenção do título de Mestre em Odontologia.
Orientadora: Profa. Dra. Daniela Leal Zandim-Barcelos
Araraquara
Soldati, Kahena Rodrigues
Influência do tabagismo nos níveis de catelicidina e alfa-defensinas no fluído gengival de pacientes com periodontite crônica / Kahena Rodrigues Soldati .-- Araraquara: [s.n.], 2016.
79 f. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia
Orientadora: Profa. Dra. Daniela Leal Zandim Barcelos
1. Peptídeos catiônicos antimicrobianos 2. Catelicidinas 3. Alfa-defensinas 4. Periodontite crônica 5. Nicotina I. Título
Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley C. Chiusoli Montagnoli, CRB-8/5646 Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP
INFLUÊNCIA DO TABAGISMO NOS NÍVEIS DE CATELICIDINA E ALFA-DEFENSINAS NO FLUIDO GENGIVAL DE PACIENTES COM PERIODONTITE
CRÔNICA
DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE
Comissão julgadora
Presidente e orientadora: Profa. Dra. Daniela Leal Zandim-Barcelos 2o Examinador: Prof. Dr. Joni Augusto Cirelli
3o Examinador: Profa. Dra. Flávia Aparecida Chaves Furlaneto Messora
Kahena Rodrigues Soldati
Nascimento: 14/02/1990 – Ribeirão Preto – São Paulo
Filiação: José Clóvis de Sousa Soldati Ana Lucila Rodrigues
2007-2010: Curso de Graduação em Odontologia
Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto – USP
2011-2013: Curso de Pós-Graduação em Implantodontia
Fundação Araraquarense de Ensino e Pesquisa em Odontologia – FAEPO
2014-2016: Curso de Pós-Graduação em Odontologia
Nível: Mestrado, Área de Concentração: Periodontia
Dedico este trabalho aos meus pais,
José Clóvis de Sousa Soldati e Ana Lucila Rodrigues, com todo meu amor e gratidão. Vocês são meus guias aqui na Terra, e estaremos juntos por toda a eternidade. Sou grata pelo incentivo e apoio em todas as minhas escolhas e decisões.
A Deus, por estar sempre ao meu lado.
Aos pacientes desta pesquisa, pela confiança depositada.
À minha orientadora, Profa. Dra. Daniela Leal Zandim-Barcelos, pela confiança e oportunidade de trabalhar ao seu lado, pela dedicação e por contribuir para o meu crescimento profissional e pessoal.
À minha amiga-irmã Lívia Jacovassi Tavares, pelo seu jeito único de se preocupar comigo, e ao Luiz Guilherme Freitas de Paula, por serem sempre tão atenciosos.
Ao Romerito Lins da Silva, pela amizade, pelo companheirismo, e por nunca ter faltado em nenhum instante.
Ao Jonleno Coutinho Pitombo, pela amizade e por toda sua ternura. À Dayane de Almeida Brandão, pela amizade. Você fará falta!
À Giovana Anovazzi Medeiros e Marcell Medeiros, pela paciência e todo o aprendizado. À Sabrina Aquino e Guilherme Oliveira, pela imprescindível contribuição neste trabalho. Ao Cláudio Marcantonio e Lélis Gustavo Nícoli, que, no momento mais decisivo, me apoiaram e incentivaram o meu ingresso no Mestrado.
Ao meu irmão Bruno Soldati, por ser o meu oposto, e assim me completar. À minha tia Marlene, por todo carinho e pelos sábios conselhos.
À minha tia Cristina, por sempre torcer e vibrar por mim. À Maitê, por estar sempre tão presente em nossas vidas.
À Madalena Reis de Araújo, pelos seus ensinamentos diários de vida.
Às minhas amigas desde sempre, e para sempre: Ana Catherine, Ana Laura, Camila, Gisela, Juliana, Marina, Nicole, Thauana e Tamara, que, de uma forma muito especial, me ofereceram todo o apoio quando mais precisei.
Cominotte, Mauricio Andres Tinajero Aroni, Mayara Terenzi e WilfreDo Escalante Otarola. A todos os demais amigos da Pós-Graduação, pelo prazeroso convívio.
À Isabella Manzolli e Suleima Ferreira, por toda competência e dedicação.
Aos professores e funcionários do Departamento de Diagnóstico e Cirurgia e do programa de Pós-Graduação em Odontologia da FOAr, que sempre estiveram dispostos a me ajudar. À Diretoria da FOAr-UNESP, pelas condições oferecidas para a realização do Curso de Pós-Graduação.
“
Agradeço todas as dificuldades que enfrentei; não fosse por elas, eu não teria saído do lugar. As facilidades nos impedem de caminhar. Mesmo as críticas nos auxiliam muito.”Faculdade de Odontologia da UNESP; 2016.
Resumo
Os peptídeos antimicrobianos são componentes da resposta imune inata, que apresentam propriedades imunomodulatórias adjuntas às propriedades antimicrobianas e, portanto, podem ter um papel chave na susceptibilidade ou resistência a doenças na cavidade oral. O propósito deste estudo foi investigar a influência do tabagismo sobre os níveis dos peptídeos antimicrobianos, alfa-defensinas (HNP 1-3) e LL-37, no fluido crevicular gengival de pacientes com periodontite crônica, e avaliar a relação destes peptídeos com saúde e doença periodontal. Um total de 40 pacientes com periodontite crônica, sendo 20 fumantes e 20 não fumantes, e 20 pacientes periodontalmente saudáveis foram incluídos no estudo. Os parâmetros clínicos avaliados foram: profundidade de sondagem, sangramento à sondagem, nível clínico de inserção, índice de placa visível e índice de sangramento gengival. Amostras de fluido crevicular gengival foram coletadas com tiras de papel absorvente e o volume mensurado com Periotron. Nos pacientes com periodontite crônica, foram coletadas amostras de sítios sadios e doentes. A quantificação da LL-37 e HNP 1-3 foi realizada pela técnica ELISA sanduíche. Os níveis de LL-37 e HNP 1-3 foram menores tanto nos sítios sadios como nos sítios doentes de pacientes fumantes em comparação com os não fumantes, sendo essas diferenças significativas exceto para os níveis de LL-37 nos sítios sadios (p<0,05). Os sítios doentes dos pacientes fumantes e não fumantes com periodontite crônica mostraram níveis mais elevados de LL-37 e menores níveis de HNP 1-3 do que os sítios sadios destes pacientes (p<0,05 e p<0,001, respectivamente). Os sítios sadios dos pacientes fumantes com periodontite crônica demonstraram uma significativa redução nos níveis de HNP 1-3 em relação aos sítios sadios dos demais grupos (p<0,05). Baseado nos nossos resultados pode-se concluir que o tabagismo interfere negativamente na expressão dos peptídeos antimicrobianos, reduzindo os níveis de LL-37 e HNP 1-3 no fluido crevicular gengival de pacientes com periodontite crônica. Além disso, foi verificado que os sítios que apresentam sinais clínicos de periodontite crônica demonstram um aumento nos níveis de LL-37 e uma redução dos níveis de HNP 1-3 em relação aos sítios com saúde periodontal.
Palavras-chave: Peptídeos catiônicos antimicrobianos. Catelicidinas. Alfa-defensinas. Periodontite crônica. Nicotina.
crevicular fluid of patients with chronic periodontitis [Dissertação de Mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2016.
Abstract
Antimicrobial peptides are components of the innate immune response that have immunomodulatory properties adjuncts to the antimicrobial properties and, therefore, may have a key role in susceptibility or resistance to diseases in the oral cavity. The purpose of this study was to investigate the influence of smoking on the levels of antimicrobial peptides, alpha-defensins (HNP 1-3) and LL-37 in the gingival crevicular fluid of patients with chronic periodontitis, and evaluate the relationship of these peptides with health and periodontal disease. A total of 40 patients with chronic periodontitis, 20 smokers and 20 non-smokers, and 20 periodontally healthy patients were included in the study. The clinical parameters evaluated were probing depth, bleeding on probing, clinical attachment level, visible plaque index and gingival bleeding index. Samples of gingival crevicular fluid were collected with absorbent paper strips and the volume measured on Periotron. In patients with chronic periodontitis, samples of healthy and diseased sites were collected. The quantification of LL-37 and HNP 1-3 was carried out by sandwich ELISA tecnique. The levels of LL-LL-37 and HNP 1-3 were lower both in healthy sites such as diseased sites in smokers compared to non-smokers, those with significant differences except for the LL-37 levels in healthy sites (p<0.05). Diseased sites of smokers and non-smokers with chronic periodontitis patients showed higher levels of LL-37 and lower levels of HNP 1-3 than healthy sites for these patients (p<0.05 and p<0.001, respectively). The sites of healthy smokers with chronic periodontitis demonstrated a significant reduction in the level of HNP 1-3 compared to healthy sites of the other groups (p<0,05). Based on our results we can conclude that smoking interferes negatively on the expression of antimicrobial peptides, reducing the levels of LL-37 and HNP 1-3 in the gingival crevicular fluid of patients with chronic periodontitis. Furthermore, it was found that sites which show clinical signs of chronic periodontitis demonstrate an increase in LL-37 levels and reducing levels of HNP 1-3 in relation to the sites with periodontal health.
Keywords: Cationic antimicrobial peptides. Cathelicidins. Alpha- defensins. Chronic periodontitis. Nicotine.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APC: Células apresentadoras de antígenos
CCL: Ligante quimiocina (motive C-C)
CCR: Receptor quimiocina (motivo C-C)
CD4+: Grupamento de diferenciação 4
CD8+: Grupamento de diferenciação 8
CXCL: Receptor quimiocina (motivo C-X-C)
DNA: Ácido desoxirribonucléico
ERK1/2: Quinase reguladora do sinal extracelular 1/2
FPR: Receptores para peptídeos formilados
FCG: Fluido crevicular gengival
G-CSF: Fator estimulador de crescimento de colônias de granulócitos
hBD: Beta-defensina humana
hCAP18: Proteína antimicrobiana catiônica humana de 18 kDa
HIV: Vírus da Imunodeficiência
Ig: Imunoglobulina
IL: Interleucina
IPV: Índica de placa visível
ISG: Índice de sangramento a sondagem
JNK: Jun quinase nuclear
KLH: Hemocianina do molusco keyhole limpet
LL-37: Catelicidina humana
MAPK: Proteína quinase ativada por mitógeno
mBD: Beta-defensina murina
mRNA: Ácido ribonucléico mensageiro
NADPH: Fosfato de dinucleótido de nicotinamida adenosina
NCI: Nível clínico de inserção
NK: Células Natural Killer
PCR: Reação de polimerase em cadeia
PS: Profundidade de sondagem
TNF: Fator de necrose tumoral
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 16
2.1 Peptídeos antimicrobianos - Estrutura e localização na cavidade oral ... 16
2.2 Peptídeos antimicrobianos - Propriedades imunomodulatórias ... 20
2.3 Peptídeos antimicrobianos e a doença periodontal ... 25
2.4 Peptídeos antimicrobianos e sua participação em outras doenças ... 30
3 PROPOSIÇÃO ... 34
4 MATERIAL E MÉTODO ... 35
4.1 População de estudo ... 35
4.2 Exame clínico periodontal ... 36
4.3 Coleta de amostras de fluido crevicular gengival ... 36
4.4 Construçãoda curva padrão para Periotron ... 37
4.5 Preparo das amostras e quantificação dos peptídeos antimicrobianos ... 39
4.6 Análise Estatística ... 39
5 RESULTADO ... 41
5.1 Tamanho da amostra ... 41
5.2 Características demográficas dos grupos ... 41
5.3 Dados clínicos da condição periodontal ... 42
5.4 Quantificação dos peptídeos antimicrobianos ... 45
6 DISCUSSÃO ... 53
7 CONCLUSÃO ... 60
REFERÊNCIAS ... 61
ANEXO A ... 76
1 INTRODUÇÃO
A periodontite é uma doença inflamatória crônica caracterizada pela destruição dos tecidos periodontais de suporte, que pode levar à perda dentária (Albandar4, 2005). Bactérias periodontopatogênicas, predominantemente bactérias Gram-negativas anaeróbicas, presentes no biofilme dental e seus produtos bacterianos são considerados os fatores etiológicos responsáveis pelo início da reação inflamatória que causa a destruição tecidual. No entanto, fatores locais, sistêmicos e genéticos podem influenciar a resposta imune-inflamatória à infecção bacteriana (Nunn99, 2003; Albandar4, 2005; Heitz-Mayfield60, 2005). A periodontite é, portanto, considerada uma doença multifatorial cuja manifestação clínica e progressão pode ser influenciada por fatores e determinantes de risco (Nunn99, 2003; Albandar4, 2005).
Dentre os fatores de risco já estabelecidos para a doença periodontal, destaca-se o tabagismo (Bergstrom, Preber17, 1994; Albandar4, 2005; Heitz-Mayfield60, 2005). Os efeitos negativos do cigarro mostram-se ser dose-dependente (Calsina et al.29, 2002) e dados da literatura demonstram que pacientes fumantes apresentam um aumento na prevalência e severidade da doença periodontal, assim como uma maior prevalência de perda dentária e edentulismo total (Dietrich et al.42, 2015). Além de induzir alterações na microbiota oral (Haffajee, Socransky55, 2001), evidências científicas mostram que o fumo altera a resposta do hospedeiro, incluindo as funções vasculares, atividade de neutrófilos e monócitos, expressão de moléculas de adesão, produção de anticorpos, assim como a produção de citocinas e mediadores inflamatórios (Barbour et al.8, 1997; Palmer et al.102, 2005; Ryder112, 2007). No entanto, o mecanismo de ação específico do fumo relacionado à ocorrência e à severidade da doença periodontal ainda não está totalmente esclarecido.
Componentes da resposta imune inata como os peptídeos antimicrobianos, podem ter um papel chave na susceptibilidade ou resistência a doenças na cavidade oral. Além de exibirem atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, fungos e vírus encapsulados (Weinberg et al.139, 1998; Zasloff145, 2002; Hancock et al.56, 2006), os peptídeos antimicrobianos são quimioatraentes para células fagocitárias e mastócitos, podem induzir mediadores inflamatórios e a degranulação de mastócitos, além de regularem eventos inflamatórios iniciais e aumentarem a imunidade adaptativa. De maneira geral, o sistema imune inato trabalha em conjunto com o sistema imune adaptativo, permitindo que o hospedeiro contenha, retarde ou impeça o crescimento microbiano imediatamente após uma infecção. Assim, os peptídeos antimicrobianos são
importantes para a manutenção do balanço entre saúde e doença no complexo ambiente da cavidade oral, sendo as defensinas e catelicidina LL-37 os peptídeos mais conhecidos e estudados da cavidade oral (Selsted, Quellette118, 2005).
Na cavidade oral, o epitélio é o primeiro tecido que fica em contato com o cigarro e seus produtos. Entretanto, pouco é conhecido sobre o efeito do cigarro nas células epiteliais gengivais e na resposta imune inata. Mahanonda et al.83 (2009) verificaram in vitro que o extrato da fumaça do cigarro pode modular a função das células epiteliais do tecido gengival humano suprimindo a expressão de beta-defensina 2 (hBD 2) e aumentando a produção de IL-8. Este mecanismo imune-modulador do cigarro poderia, então, ser considerado um possível mecanisno associado à ocorrência e severidade da doença periodontal em pacientes fumantes. Alterações nos níveis salivares da catelicidina LL-37 também foram observadas por Takeuchi et al.124 (2012) em pacientes fumantes. Uma correlação negativa foi encontrada entre os níveis salivares de LL-37 e cotinina sugerindo que o tabagismo ou a longa exposição ao tabaco pode resultar em redução dos níveis de LL-37 na cavidade oral e aumentar o risco de periodontite. Uma acentuada redução na produção de LL-37 também foi verificada em pacientes com doenças sistêmicas, incluindo a síndrome de Kostmann, síndrome de Papilon-Lefèvre e neutropenia. Essa redução nos níveis de LL-37 poderia aumentar a susceptibilidade à periodontite levando a um aumento da sua prevalência nestes pacientes (Putsep et al.110, 2002; de Haar et al.37, 2004; Karlsson et al.69, 2007).
De maneira geral, o desequilíbrio da homeostasia oral provocado pela supressão de peptídeos antimicrobianos poderia favorecer a invasão de patógenos periodontais e aumentar o processo de inflamação crônica que é característico da periodontite. Levando em consideração o papel fundamental dos peptídeos antimicrobianos na resposta imune do hospedeiro e a maior incidência e severidade da doença periodontal em pacientes fumantes, propomos o presente estudo com a seguinte hipótese principal: toxinas derivadas do fumo reduzem a expressão de peptídeos antimicrobianos como as catelicidinas e alfa-defensinas, afetando a interação microbiota-hospedeiro nas doenças periodontais.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Peptídeos antimicrobianos - Estrutura e localização na cavidade oral
O sulco gengival é a única estrutura anatômica a qual por uma face encontra-se revestida por um tecido duro, a superfície dos dentes, e pela outra por um tecido mole, o epitélio da margem gengival livre. Aproximadamente 700 espécies bacterianas são passíveis de colonização no sulco gengival, em quantidades variadas, desde 103 em sulcos sadios até 108 em bolsas periodontais (Aas et al.1, 2005). O epitélio gengival atua como uma barreira física ao biofilme bacteriano, provendo assim a primeira linha de defesa contra infecções. A barreira física é composta por contínuas camadas de células epiteliais especializadas que desempenham muitas funções fisiológicas, incluindo a prevenção da entrada de microrganismos.
Nos mamíferos, a defesa contra agentes agressores é constituída pela resposta imune inata seguida pela resposta imune adaptativa. Além da barreira física, a imunidade inata é composta por células especializadas, como leucócitos e células natural killer (NK), proteínas mediadoras da inflamação, como as do sistema complemento, substâncias antimicrobianas e citocinas. Ao passo que, a resposta adaptativa é induzida pela ativação de linfócitos em resposta a antígenos evidenciados pelas células apresentadoras de antígenos (APCs), como as células dendríticas (Hoffmann et al.62, 1999). Esses elementos que resultam na resposta imunológica podem ser produzidos pelo epitélio, por neutrófilos do sulco gengival e glândulas salivares (Komatsuzawa et al.74, 2007).
Os peptídeos antimicrobianos são importantes componentes da reposta imune inata. Eles apresentam um amplo espectro de ação antimicrobiana contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas presentes no sulco gengival, assim como fungos e vírus encapsulados (Weinberg et al.139, 1998; Zasloff145, 2002; Hancock et al.56, 2006), sendo, portanto, considerados antibióticos endógenos. Apresentam estruturas catiônicas que agem associando-se às estruturas aniônicas bacterianas, como o LPS em bactérias Gram-negativas e o ácido lipoteicóico em bactérias Gram-positivas provocando, posteriormente, a ruptura da membrana microbiana (Marshall86, 2004).
Dentre os principais peptídeos pesquisados pela sua capacidade antimicrobiana, pode-se citar a catelicidina e as defensinas. Esses dois peptídeos são pertencentes a duas
famílias estruturalmente distintas de peptídeos antimicrobianos. As defensinas são uma classe de peptídeos antimicrobianos produzida por muitos organismos eucariotos, incluindo os mamíferos, os insetos e as plantas (Izadpanah, Gallo67, 2005). São pequenos peptídeos catiônicos, com cerca de 30 a 40 aminoácidos de comprimento, que, em geral, contêm três pontes dissulfeto estabilizando uma estrutura comum anfipática, uma região hidrofílica, separada de uma região hidrofóbica (Izadpanah, Gallo67, 2005). As defensinas podem ser produzidas por células epiteliais de superfície de mucosa e por leucócitos contendo grânulos, incluindo neutrófilos e células NK (Oppenheim et al.101, 2003). Encontram-se expressas em humanos de diferentes formas e apresentam-se tanto em tecidos sadios como em tecidos inflamados (Komatsuzawa et al.74, 2007).
As duas principais subfamílias de defensinas humanas, denominadas alfa (HNPs) e beta-defensinas (hBDs), são diferenciadas pela localização das pontes de dissulfeto, pelo comprimento dos aminoácidos e também pelas diferentes células que as expressam (Selsted, Harwig119, 1989; Tang, Selsted125, 1993). As HNPs são subdvididas em seis diferentes tipos, que podem ser sintetizados por neutrófilos (peptídeos neutrofílicos humanos 1-4 – HNP 1-4), ou pelas células de Paneth presentes na mucosa do intestino (defensina humana 5 e 6– HD 5 e HD 6). As HNP 1-4 são sintetizadas como precursores, clivadas proteoliticamente, gerando uma defensina catiônica madura que é estocada em grânulos azurófilos, presentes nos neutrófilos, e depois liberada (van Wetering et al.136, 1999; Lundy et al.82, 2005).
Assim como as HNPs , as hBDs são constituídas por três pontes de dissulfeto, diferenciando-se estruturalmente pelo espaçamento e emparelhamentos dos resíduos de cisteína (Lehrer79, 2004). Caso numeremos as seis cisteínas presentes nas HNPs, as três pontes de dissulfeto seriam representadas pelo segmento CI-CVI, CII-CIV, CIII-CV, enquanto que para as hBDs seriam representadas por CI-CV, CII-CIV, CIII-CVI. O fato das cisteínas 5 e 6 estarem sempre próximas, torna a estrutura dessas duas subfamílias muito semelhantes (Selsted, Harwig119, 1989; Hill et al.61, 1991; Tang, Selsted125, 1993; Zimmermann et al.149, 1995). As hBDs apresentam uma sequência ligeiramente mais longa, constituída por uma região helicoidal. As hBDs são produzidas pelas células epiteliais de uma variedade de tecidos e órgãos, incluindo pele, traquéia, sistema urogenital, fígado, pâncreas e outros (Dale et al.36, 2001; Dale, Fredericks35, 2005; Kohlgraf et al.73, 2010). A primeira evidência de hBDs na cavidade oral de mamíferos foi descrita por Schonwetter et al.116 (1995). A partir de então, diversos pesquisadores têm mostrado a presença destas defensinas na cavidade oral de humanos (Mathews et al.87, 1999; Sahasrabudhe et al.113, 2000; Dale et al.36, 2001; Dunsche et al.47, 2002). As hBDs estão expressas na gengiva, língua, glândulas salivares e mucosa,
podendo ser encontradas na saliva e fluido gengival crevicular. Apesar da identificação genômica de diferentes hBDs em humanos, aproximadamente 28 tipos de hBDs, as hBDs 1, 2 e 3 são as mais estudadas e caracterizadas (Kohlgraf et al.73, 2010). As HNPs, por sua vez, estão expressas nos tecidos orais e glândulas salivares, e estão presentes na saliva e fluido gengival crevicular.
Embora tenham sido encontradas cerca de 30 tipos de catelicidina em mamíferos, apenas uma foi identificada em humanos até hoje, a LL-37/hCAP18 que primeiramente apresenta-se como uma proteína antibacteriana catiônica humana de 18 kDa(hCAP18). Nos neutrófilos, os hCAP18 são armazenados nos grânulos secundários, outro tipo de grânulo citoplasmático especializado, que contêm agentes antimicrobianos. O aminoácido número 37 da alfa hélice da extremidade C-terminal desta proteína precursora é clivado, formando o peptídeo LL-37, que é a forma ativa e madura da catelicidina. Enquanto as defensinas apresentam uma estrutura terciária intricada, o peptídeo LL-37 apresenta uma forma linear semelhante a uma estrutura alfa helicoidal (Ramanathan et al.111, 2002; Zaiou, Gallo144, 2002; Komatsuzawa et al.74, 2007). A Figura 1 ilustra as estruturas dos peptídeos antimicrobianos.
Fonte: Figura adaptada de Mojsoka e Jenssen94, 2015
A catelicidina foi primeiramente identificada por Sorensen et al.122 (1997) em neutrófilos e mais tarde mostrou-se presente no epitélio escamoso (Frohm et al.51, 1999) , na superfície de células epitelilais das vias respiratórias, células serosas e mucosas das glândulas
Figura 1 – Classes estruturais dos peptídeos antimicrobianos A) Estrutura folha-β da
alfa-defensina; B) Estrutura folha-β da beta-defensina ; C) Estrutura α-hélice da catelicidina humana – LL-37
submucosas (Bals et al.6, 1998) , em queratinócitos de células inflamadas (Frohm et al.50, 1997) e em populações específicas de linfócitos e monócitos (Agerberth et al.2, 2000). A LL-37 apresenta atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de microrganismos patogênicos e neutraliza a bioatividade do lipossacarídeo (Larrick et al.77, 1995). Em releção à sua expressão na cavidade oral, a LL-37 pode ser detectada na língua, mucosa bucal, epitélio gengival e glândulas salivares (Dale et al.36, 2001; Devine40, 2003; Hosokawa et al.65, 2006).
As defensinas e a LL-37 estão localizadas em diferentes sítios do tecido gengival. Enquanto as hBDs são fracamente expressas nas células indiferenciadas do epitélio juncional, as HNPs e a LL-37 estão presentes em altas concentrações em neutrófilos do sulco gengival (Dale et al.36, 2001; Dale, Fredericks35, 2005; McCormick, Weinberg88, 2010). Os neutrófilos são os tipos celulares predominantemente observados tanto no sulco gengival como no fluido crevicular gengival (FCG) (Dixon et al.44, 2004). Dessa maneira, o epitélio juncional é protegido pelas HNPs e a LL-37, liberadas por neutrófilos, enquanto as camadas mais diferenciadas do epitélio são protegidas pelas hBDs. Segundo Dixon et al.44 (2004), o deslocamento de neutrófilos do tecido conjuntivo para o sulco gengival seria mediado pela diferença de gradiente de IL-8 produzida pelas células epiteliais frente a uma invasão bacteriana. Posteriormente, esses neutrófilos iniciam o processo de fagocitose dos microrganismos que compõem a placa bacteriana (Dixon et al.44, 2004) e a liberação de LL-37 e defensinas no sulco gengival (Yang et al.141, 2004).
As hBDs 1 e 2 estão localizadas no epitélio estratificado suprabasal e nas camadas mais externas do epitélio, adjacentes à região de formação da placa na superfície dental e no epitélio sulcular inflamado, o que é consistente com a formação da barreira epitelial (Dale et al.36, 2001). As hBD 1 e 2 não são detectadas no epitélio juncional. Enquanto a hBD 2 está localizada nos estratos mais diferenciados do epitélio oral (granuloso e espinhoso), a hBD 3 está localizada no estrato basal menos diferenciado, nos queratinócitos, células de Langerhans e células de Merkel, sugerindo que a hBD 3 pode facilitar a comunicação entre os tecidos gengival e conjuntivo, servindo como elo de ligação entre as respostas imune inata e adaptativa (Lu et al.81, 2005; Hosokawa et al.65, 2006).
Na cavidade oral, além do epitélio gengival, as propriedades das beta-defensinas também têm sido estudadas na polpa dental, inclusive nos odontoblastos (Dommisch et al.46, 2005). Foi sugerido que as hBDs desempenham seu papel junto a defesa inata do hospedeiro, na polpa dental, auxiliando na formação, manutenção e reparo da dentina, além da síntese de colágeno e controle na invasão de infiltrados extracelulares.
2.2 Peptídeos antimicrobianos - Propriedades imunomodulatórias
A resposta do hospedeiro contra a invasão bacteriana resulta na expressão de inúmeras proteínas mediadoras pró-inflamatórias, como citocinas, quimiocinas e peptídeos antimicrobianos. Muitos estudos mostram que as defensinas e as catelicidinas compartilham de algumas funções e propriedades que contribuem para a resposta imune, servindo como uma ponte entre a imunidade inata e a adaptativa. HNPs e hBDs, assim como a LL-37, apresentam propriedades imunomodulatórias adjuntas às propriedades antimicrobianas (Yang et al.141, 2004; Jenssen et al.68, 2006). Estas funções são tanto diretas, atuando como agentes quimioatrativos por células imunologicamente ativas, quanto indiretas, ao agir como quimiocina ou induzindo a produção de quimiocinas pelas células epiteliais orais ou outros tipos de células residentes.
Quanto às propriedades antimicrobianas destes peptídeos, sobre bactérias, fungos e vírus, além de se associarem às membranas celulares de microorganismos alvo, resultando em sua desestabilização e consequente ruptura, os peptídeos antimicrobianos atuam sobre alvos intracelulares, inibindo a síntese de ácidos nucléicos, atividades enzimáticas e a síntese da parede celular (Brogden25, 2005)
Mediante estímulos contínuos de patógenos, e em adição à sua ação antimicrobiana sobre os agentes agressores, os peptídeos antimicrobianos agem recrutando leucócitos ou induzindo a expressão de quimiocinas ou citocinas como CXCL8 (IL-8), CCL2 e IFN- α. Deste modo, indiretamente recrutam células efetoras como neutrófilos, monócitos, macrófagos, células dendríticas imaturas e células T (Lai, Gaallo76, 2008). Como exemplo deste efeito indireto, pode-se citar o efeito quimiotático das HNPs, HNP 1 e HNP 2, para monócitos (Territo et al.127, 1989), e das HNP 1-3 para células CD4+ e CD8+ (Yang et al.142, 2000). Enquanto as hBDs recrutam células dendríticas imaturas e células T de memórias CD4+CD45RO+ através da interação com o receptor CCR6 (Yang et al.143, 1999), a LL-37 tem a capacidade de atrair neutrófilos, monócitos, e células T ao se ligarem a receptores FPR (Yang et al.141, 2004).
Zhang et al.146 (2009) documentaram em um estudo in vitro a capacidade da LL-37 de induzir a migração e quimiotaxia de neutrófilos através da molécula FPR1 (De et al.38, 2000). Além disso, foi constatado que a LL-37, presente em concentrações de 20 µg/mL, pode estimular os neutrófilos a sintetizarem CXCL8 pró-inflamatória, ligantes ao p38 MAPK e ERK 1/2 (Zheng et al.148, 2007; Zhang et al.147, 2008). Sabe-se que essa quimiocina, quando
ativa a via CXCR2, induz a quimiotaxia não apenas de neutrófilos, mas também de outros granulócitos, além de estimular os neutrófilos à fagocitose. Por outro lado, Lee et al.78 (2009) sugerem que a LL-37 tem o poder de inibir SAA (Soro amilóide A), indutor da produção de CXCL8, resultando em uma drástica inibição na atividade de ERK e p38 MAPK. Por sua vez, a inibição do CXCL8 resulta no bloqueio da produção de proteínas presentes na fase aguda da inflamação (Lee et al.78, 2009).
Zheng et al.148 (2007) relataram que além de ativar neutrófilos na liberação de antagonistas dos receptores de IL-1 (IL-1Ra), antagonista natural de IL-1β, a LL-37 induz um aumento dose-dependente na expressão gênica de HNP1-3. Também foi observado que a liberação extracelular de HNP 1-3 por neutrófilos resultou da estimulação da LL-37 (Zheng et al.148, 2007). A LL-37 foi relacionada do mesmo modo à produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS) por neutrófilos, processo o qual é mediado por uma flavoenzima, como a NAPDH, e por meio do aumento da concentração intracelular de Ca2+ (Zheng et al.148, 2007).
Já em monócitos, a catelicidina LL-37 ativa receptores FPR-2, acionando monócitos a desencadearem uma alteração conformacional monocística β1 e β2 para permitir sua adesão (Wantha et al.138, 2013). Muitos estudos sugerem que a catelicidina age diretamente, estimulando monócitos tanto a produzir como liberar citocinas e quimiocinas que podem modular a intensidade da inflamação.
Bowdish et al.22 (2004) assim como Mookherjee et al.92 (2009) demonstraram que alguns genes que codificam quimiocinas essenciais para o recrutamento celular para o sítio de inflamação como CXCL1, CXCL8, CCL2 e CCL17 apresentavam-se expressos em monócitos estimulados pela LL-37. Enquanto Bowdish et al.22 (2004) detectaram que a LL-37 não aumenta a expressão de RNAm de algumas citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β e IL-6, Mookherjee et al.92 (2009) afirmaram que ela pode causar um aumento na transcrição da codificação de genes como IL-10 e IL-19.
Niyonsaba et al.97 (2005) avaliaram o efeito das hBDs 1, 2, 3 e 4, e da LL-37 sobre a secreção de IL-18 por queratinócitos. Foi encontrada uma produção aumentada de IL-18 pelos queratinócitos estimulados, da mesma forma que esses peptídeos aumentaram significativamente a expressão de RNAm da IL-18. Também foi observado que as hBDs 2, 3, 4 e LL-37 ativaram os receptores p38 MAPK e ERK1/2, mas não o JNK, o qual seria o mecanismo de escolha para secreção de IL-18. Portanto, pelo fato da IL-18 estar envolvida nas funções de células T como Th1 e Th2, esses resultados sugeriram um novo mecanismo de ação dos peptídeos antimicrobianos sobre a resposta imune inata e adaptativa, assim como seu papel sobre a patogênese de algumas doenças e a secreção de IL-18 (Niyonsaba et al.97, 2005).
A IL-18 é um membro da família da IL-1 originalmente descoberta na Propionibacterium acnes, que apresenta as mesmas propriedades modulatórias dos Inteferons γ (IFN-γ), incluindo a indução de citocinas para células Th1 eTh2, citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas, bem como a produção de IgE e IgG1 (Hoshino et al.63, 1999; Hoshino et al.64, 2000).
Chertov et al.33 (1996) evidenciaram a mediação entre a resposta imune inata e adaptativa, através do poder de atração das células T também pelas HNPs, assim como o C3d da cascata complemento, que apresenta o poder de amplificar a secreção de células B por anticorpos específicos (Dempsey et al.39, 1996). Smith et al.121 (2010) apontaram as HNPs como indutoras na produção de IL-8 e leucotrieno B4 tanto em macrófagos como em células epiteliais.
A ação das defensinas sobre células dendríticas e linfócitos T presume que ambas, HNPs e hBDs, contribuem para indução da imunidade antimicrobiana adaptativa. A atividade imunopotencializadora das HNPs foi investigada, através de injeções intraperitoniais, em camundongos, de HNP 1-3 associadas a KLH, uma hemocianina encontrada na hemolinfa de uma espécie de molusco, Megathura crenulata, que apresenta propriedades anti-tumorais, ou a antígenos idiopáticos de linfoma de células B, resultando não somente no aumento significativo de IgG sérica, mas também no aumento da resistência contra agentes tumorais (Tani et al.126, 2000). Estudos in vitro comprovaram que o papel sobre o efeito imunopotencializador varia entre as HNPs (Brogden et al.26, 2003), enquanto as hBDs podem promover resposta imune humoral. Ao associarem mBD 2 e mBD 3 a fragmentos específicos de linfoma de células B, e administrá-los como vacinas de DNA para imunização de camundongos, foi possível observar além da potencialização da resposta imune humoral, um desenvolvimento de imunidade tumoral (Biragyn et al.19, 2001; Biragyn et al.18, 2002).
Os peptídeos antimicrobianos também estão associados a importantes eventos estimulatórios para o reparo cicatricial no hospedeiro. Koczulla et al.72 (2003) comprovaram que a LL-37, mediada por receptores FPR-1 presentes nas células endoteliais, induz a angiogênese. Foram realizadas aplicações de LL-37 na membrana corioalantóica de ovos de galinha, assim como em coelhos, resultando em uma neovascularização. Além de ativar diretamente as células endoteliais, a LL-37 pode ocasionar um aumento na proliferação e formação da estrutura de novos vasos em células endoteliais cultivadas. Além disso, Heilborn et al.59 (2003) retrataram o papel da catelicidina LL-37 no processo de re-epitelização de feridas na pele. Durante a cicatrização in vivo foram encontrados altos níveis de hCAP18 no filtrado inflamatório e foi notada a sua migração para o epitélio que envolvia a ferida. Em
úlceras crônicas, os níveis encontrados foram mais baixos, assim como a imunoreatividade do hCAP-18/LL-37 apresentava-se ausente no epitélio circundante à ferida. Sendo assim, essas observações sugerem que os peptídeos antimicrobianos apresentam um papel duplo durante a cicatrização, além de matar as bactérias, eles podem estimular um grupo de fenômenos para o reparo tecidual do hospedeiro.
De maneira geral, os peptídeos antimicrobianos regulam a proliferação de células epiteliais, aumentam a fagocitose por macrófagos, são quimioatraentes para monócitos, macrófagos, linfócitos T, células dendríticas imaturas e mastócitos, induzem a produção de citocinas pró-inflamatórias, suprimem a produção de citocinas pró-inflamatórias para antígenos microbianos específicos, ativam e promovem a degranulação de mastócitos, regulam o sistema complemento, inibem a produção de glucocorticóides, e aumentam a resposta imune adaptativa (Kohlgraf et al.73, 2010; McCormick, Weinberg88, 2010). Assim, os peptídeos antimicrobianos funcionam como uma ponte entre imunidade inata e adaptativa. Todas estas funções atuam em favor da resolução da infecção e reversão da inflamação potencialmente prejudicial, além de complementar o efeito antimicrobiano direto. As diferentes funções dos peptídeos antimicrobianos na defesa do hospedeiro estão resumidas na Tabela 1.
Tabela 1 - Atividades imunomodulatórias dos peptídeos antimicrobianos.
Peptídeo
antimicrobiano Tipo
Atividade relevante para imunidade
In vitro In vivo
Alfa-defensinas HNP 1-3 Atividade antimicrobiana Atividade antiviral Atividade quimiotática Promoção fagocitose Degranulação de mastócitos Estimula a produção de citocinas e quimiocinas
Regula ativação complemento Inibição do receptor ACTH e produção de glucocorticóide
Recrutamento de células imunes Indução de citocinas
Aumento da resposta imune humoral e celular (Ag-específica)
Confere resistência à invasão bacteriana
Beta-defensinas hBD 1-4 hBD 2
Atividade antimicrobiana Atividade quimiotática através CCR6
Degranulação de mastócitos Estimula a produção de citocinas e prostaglandinas
Indução da maturação de células dendríticas através TLR4 (apenas mBD 2)
Aumento da resposta imune humoral e celular (Ag-específica)
Confere resistência à invasão bacteriana
Catelicidina LL-37 Atividade antimicrobiana Atividade quimiotática Promoção fagocitose Estimula a produção de quimiocinas Degranulação de mastócitos Neutralização endotoxina bacteriana Efeito antibacteriano Estimula angiogênese
Estimula re-epitelização de feridas na pele
Abreviações: HNP 1-3, alfa-defensinas humanas derivadas de neutrófilos 1-3; hBD 1-4, beta-defensinas humanas 1-4; mBD 2, beta-defensina 2 de rato; LL-37, catelicidina humana LL-37
2.3 Peptídeos antimicrobianos e a doença periodontal
O início e a progressão da doença periodontal estão relacionados à colonização do sulco gengival por microrganismos específicos e sua subsequente proliferação subgengival. Esses organismos incluem Aggregatibacter actinomycetemcomitans e os membros do denominado “complexo vermelho” das bactérias periodontopatogênicas (Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola) (Borrell, Papapanou20, 2005). Uma efetiva resposta do hospedeiro contra essas bactérias é primeiramente mediada por neutrófilos e é caracterizada pelo influxo desses neutrófilos para o sulco gengival (Garant52, 2003).
Hosokawa et al.65 (2006) realizaram um estudo tanto in vivo como in vitro, com o propósito de analisar a expressão dos peptídeos antimicrobianos LL-37, hBD 2 e hBD 3, no tecido gengival de pacientes com doença periodontal. Foram obtidas amostras de tecido gengival inflamado de 13 pacientes que apresentavam doença periodontal que apresentavam profundidade de sondagem (PS) > 3mm, com idade entre 32 a 58 anos, e amostras de tecido gengival sadio de 10 pacientes, com PS ≤ 3mm, com idade entre 25 e 72 anos. Por meio de análise imuno-histoquímica, foi possível notar apenas a expressão da LL-37 em neutrófilos e não das defensinas, as hBDs 2 e 3. Além disso, foi verificado que a catelicidina apresentava-se em níveis mais elevados nos tecidos inflamados do que no tecido gengival sadio, onde pouca ou praticamente nenhuma expressão foi constatada. Entretanto, as células epiteliais gengivais expressaram os três peptídeos investigados, indepedentemente da presença ou ausência de inflamação nesses tecidos. Houve uma correlação positiva entre os níveis de LL-37 e a profundidade do sulco gengival. O estímulo das células epiteliais com bactérias periodontopatogênicas (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens, Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia), induziu a expressão de hBD 2 e LL-37. No entanto, em neutrófilos isolados do sangue periférico foi notada apenas síntese de LL-37 e não de hBD 2 em resposta aos estímulos bacterianos. Assim, os achados deste estudo mostraram que as beta-defensinas apresentam expressão distinta da LL-37 sobre os tecidos gengivais inflamados, provendo duas diferentes vias da resposta imune inata no contexto da doença periodontal.
Puklo et al.109 (2008) investigaram os níveis de LL-37 e HNP 1-3 no FCG de pacientes com periodontite severa relacionando-os com a presença de bactérias periodontopatógenas específicas nesses sítios doentes. Foi possível detectar HNP 1-3 em todas as amostras, sendo
que nos pacientes com periodontite crônica foi detectada uma alta concentração (73,92 μg/μL), enquanto nos pacientes com periodontite agressiva foi verificada uma concentração moderada (17,64 μg/μL) em relação aos pacientes controles (1,20 μg/μL). Em relação à LL-37, 36% dos 14pacientes com periodontite agressiva e 18% dos 17 pacientes com periodontite crônica não expressaram LL-37 no FCG. Em 22% dos 9 pacientes periodontalmente saudáveis não foi possível detectar a presença de LL-37. A diferença dos níveis destes peptídeos entre os grupos avaliados foi estatisticamente significante. Os níveis de mieloperoxidase apresentaram uma correlação negativa com os níveis de HNP 1-3 encontrados em pacientes com periodontite crônica, o que pode significar baixa concentração de neutrófilos. Logo, foi sugerida a existência de outras fontes de origem para a HNP 1-3, como os linfócitos e monócitos. Também foi sugerido que a diferença nas concentrações destes peptídeos avaliados, pode ser causada pela variação da flora presente na placa dental das diferentes doenças. Nas amostras em questão foram encontrados números expressivos de P. gingivalis em sítios que apresentavam periodontite crônica e um número inferior em sítios que apresentavam periodontite agressiva. No entanto, resultados opostos foram obtidos para a bactéria A. actinomycetemcomitans, reforçando estudos anteriores (Bragd et al.23, 1987; Schacher et al.115, 2007) os quais associam a presença dessa bactéria a sítios com destruição severa. Foi concluído que essas duas espécies bacterianas podem exercer efeitos divergentes sobre a produção local de alfa-defensina. De acordo com os resultados encontrados, foi sugerido que a catelicidina LL-37 pode ser considerada um importante contribuinte para a defesa inata do hospedeiro em periodontites severas. Também pôde-se concluir que a catelicidina é uma molécula chave da imunidade inata nos tecidos tanto periodontais como gengivais em humanos, embora o seu papel de proteção pode não estar relacionado com a atividade bactericida. Em regiões da bolsa periodontal que apresentam hipóxia, onde há uma supressão da atividade antibactericida dependente de oxigêncio, a ação da LL-37 e HNP 1-3 tendem a ser sinergética.
Turkoglu et al.132 (2010) investigaram os níveis de HNP 1-3 no FCG de pacientes que apresentavam doenças periodontais. Dos 77 pacientes recrutados, 20 apresentavam periodontite crônica, 18 eram portadores de periodontite agressiva generalizada, 20 possuíam gengivite e 19 não apresentavam doença periodontal. A coleta do FCG nos pacientes com periodontite crônica e periodontite agressiva generalizada foi realizada em sítios que apresentaram PS ≥ 6mm e nível clínico de inserção (NCI) ≥ 5mm. Nos pacientes que apresentavam gengivite, a coleta foi realizada em sítios com sangramento a sondagem e sem perda de inserção clínica, enquanto nos pacientes sem doença periodontal a coleta foi feita em
sítios que apresentavam PS < 3mm, sem perda de inserção clínica e sangramento a sondagem. A concentração de HNP 1-3 encontrada no fluido crevicular de todos os grupos foi semelhante e não houve correlação entre o os níveis de HNP 1-3 encontrados com os parâmentros clínicos avaliados. Tendo em vista que nenhum aumento dos níveis de HNP 1-3 foi observado nos sítios que apresentavam doença periodontal, concluiu-se que a falta desse peptídeo antimicrobiano pode ser considerado um importante co-fator para a doença periodontal.
Turkoglu et al.134 (2011) avaliaram os níveis proteicos do peptídeo antimicrobiano, hCAP-18/LL-37, bem como a expressão do RNAm em tecidos gengivais que apresentavam diferentes doenças periodontais. Foi detectada a expressão de hCAP-18/LL-37 em 66,7% das amostras avaliadas dos 10 pacientes com periodontite crônica, em 37,5% dos 10 pacientes com periodontite agressiva e apenas em 20% dos 10 pacientes sem doença periodontal. Foi também verificadaa presença de altos níveis de hCAP-18/LL-37 tanto no epitélio como no tecido conjuntivo de pacientes com periodontite crônica em relação aos pacientes sem doença periodontal, por meio de análise imuno-histoquímica. Por outro lado, os níveis de hCAP-18/LL-37 encontrados no tecido gengival de pacientes com periodontite agressiva generalizada foram irrelevantes quando comparados aos níveis encontrados em pacientes sem doença periodontal. Assim, foi sugerido que o hCAP-18/LL-37 desempenha um importante papel na resposta imune do hospedeiro nas doenças periodontais, e sua deficiência local em pacientes com periodontite agressiva generalizada pode contribuir para a rápida destruição dos tecidos periodontais, que é uma característica clínica dessa doença.
Takeuchi et al.124 (2012) avaliaram a concentração de LL-37 em 69 pacientes portadores de doença periodontal crônica e correlacionaram os níveis deste peptídeo com os parâmetros clínicos periodontais. Foi possível constatar altas concentrações de LL-37 na saliva de pacientes que apresentavam sítios com PS e NCI ≥ 5 mm, onde concomitantemente foi detectada a presença da bactéria T. denticola. No entanto, nos pacientes com doença periodontal que apresentavam altos níveis de cotinina (≥8 ng/mL) na saliva, a concentração de 37 encontrava-se em níveis mais baixos. Com esses achados, o aumento nos níveis de LL-37 em sítios que apresentam severa destruição periodontal foi associado à resposta imune inata contra as bactérias periodontopatógenas que atuam como um mecanismo de defesa no tecido periodontal. No entanto, a LL-37 sozinha demonstra não ser suficiente no combate a essas bactérias. A correlação negativa entre os níveis de LL-37 e cotinina sugerem que o fumo e a exposição à fumaça do cigarro levaram a uma diminuição nos níveis de LL-37, resultando assim em um aumento do risco de periodontite.
Makeudom et al.84 (2014) mensuraram os níveis de hCAP18/LL37 no FCG de pacientes com doença periodontal e compararam aos níveis encontrados em pacientes sem doença periodontal, determinando a correlação entre os níveis de hCAP18/LL-37 e sulfato de condroitina (CS), principal glicosaminoglicana encontrada tanto no cemento como no osso alveolar. Um total de 76 indivíduos foram avaliados, sendo que 19 pacientes apresentavam gengivite, 16 eram portadores de periodontite crônica, 16 apresentavam periodontite agressiva e 25 não apresentavam doença periodontal. Foram encontrados níveis significativamente maiores de hCAP18/LL-37 em sítios de pacientes portadores tanto de periodontite crônica como de periodontite agressiva quando comparados à pacientes com gengivite e pacientes sem doença periodontal. Os valores de hCAP18 foram correlacionados aos níveis de CS. Além dos altos níveis de hCAP18/LL-37 encontrados em pacientes com doença periodontal crônica e agressiva, foi possível associá-los à presença de CS na periodontite crônica, mas não na periodontite agressiva. Como o CS é considerado um marcador ósseo catabólico, a presença de altos níveis deste marcador reflete um aumento de reabsorção óssea em lesões de periodontite. Assim, os resultados obtidos sugerem distintas origens imunopatogênicas para as periodontites crônica e agressiva. Propõe-se que o aumento de CS como reflexo da reabsorção do osso alveolar, está associado ao aumento da inflamação do tecido periodontal como mostrados pelos níveis de hCAP18/LL-37 na periodontite crônica, ao passo que a destruição óssea severa e rápida presente na periodontite agressiva não está relacionada com os níveis de inflamação presente nos tecidos periodontais. Em um recente estudo, Wang et al.137 (2015) investigaram a presença de hBDs no tecido gengival de pacientes com doença periodontal crônica e pacientes periodontalmente saudáveis e relacionaram os níveis desse peptídeo com a presença subgengival de bactérias e sua periodontopatogenicidade. Os parâmetros clínicos de 54 participantes foram avaliados, sendo 25 pacientes diagnosticados com periodontite crônica e 29 pacientes sem doença periodontal. Foram realizadas biópsias gengivais para mensuração da expressão relativa de hBD 1, hBD 2 e hBD 3 através de PCR em tempo real. Também foi feita quantificação das bactérias presentes, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum e Tannerella forsythia presentes no biofilme subgengival. Não foi encontrada diferença significativa na expressão do gene da hBD entre os grupos de pacientes periodontalmente saudáveis e pacientes com periodontite crônica. A bactéria T. Denticola foi detectada em todos os participantes, enquanto F. nucleatum e T. forsythia foram detectadas em todos os pacientes com periodontite crônica e em 86,21% e 51,72%, respectivamente, dos voluntários sem doença periodontal. P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans foram
detectadas em 24,14% e 17,24%, respectivamente, do grupo periodontalmente saudável e em 84% e 12%, respectivamente, do grupo com periodontite crônica. A prevalência de todas as bactérias, exceto A. actinomycetemcomitans, foi significativamente maior no grupo dos pacientes com periodontite crônica do que no grupo de pacientes saudáveis (p<0,05). Uma significante correlação negativa foi observada entre a presença total de bactérias e os níveis de hBD 2, especialmente no grupo de pacientes sem doença periodontal. Este resultado sugere que as beta-defensinas podem desempenhar um papel importante ao limitar a adesão bacteriana no estágio inicial da periodontite.
A produção reduzida de peptídeos antimicrobianos observada em pacientes com doenças sistêmicas, como a Síndrome de Kostmann, Síndrome Papillon-Lefèvre e neutropenia, poderia também aumentar a suscetibilidade à periodontite, levando a um aumento em sua prevalência (Putsep et al.110, 2002; de Haar et al.37, 2004; Karlsson et al.69, 2007).
Pütsep et al.110 (2002) analisaram amostras de neutrófilos, plasma e saliva de 6 pacientes portadores da Síndrome de Kostmann, uma neutropenia congenital severa, com o intuito de investigar a presença de defensinas e LL-37 e correlacioná-las à presença de doença periodontal. Os níveis dos peptídeos nestes pacientes também foram comparados aos níveis encontrados em 22 pacientes sem doença periodontal. Foi possível detectar em pacientes portadores da síndrome uma deficiência de LL-37 e uma redução de até 30% na concentração de HNP. Nem no plasma assim como na saliva foi detectada a catelicidina nesses pacientes. Em um paciente que foi submetido a transplante de medula óssea, concentrações quase normais de LL-37 foram detectadas. Todos os pacientes que apresentavam a síndrome também apresentavam doença periodontal severa, exceto o paciente submetido ao transplante de medula óssea.
Carlsson et al.30 (2006) avaliaram a condição periodontal de quatro pacientes pertencentes a uma família portadora de Síndrome de Kostmann. Destes pacientes, três apresentavam doença periodontal apesar da contagem absoluta normal de neutrófilos e de cuidados profissionais com saúde bucal. Estes pacientes também apresentavam deficiência de peptídeos antibacterianos derivados de neutrófilos. Um paciente apresentava mutação no gene da elastase neutrofílica e apresentava doença periodontal severa com perda de 15 dentes permanentes e um paciente, que foi submetido ao transplante de medula óssea, não apresentava doença periodontal. Após todas as análises, os autores concluíram que o nível normal de contagem absoluta de neutrófilos não é suficiente para manutenção da saúde bucal em pacientes com Síndrome de Kostmann. Como os neutrófilos são importantes para a
primeira linha de defesa da imunidade inata, a deficiência de peptídeos antibacterianos como a LL-37 pode explicar pelo menos em parte a presença de doença periodontal crônica nos pacientes avaliados. Nestes pacientes o cuidado profissional torna-se fundamental apesar do tratamento com fator estimulador de crescimento de colônias de granulócitos (G-CSF) e de níveis normais de contagem absoluta de neutrófilos para prevenção da progressão da doença periodontal. Assim, o papel dos peptídeos antibacterianos na patogênese da doença periodontal precisa ser melhor investigado.
De maneira geral, os peptídeos antimicrobianos, em especial as defensinas e catelicidinas, encontram-se presentes no tecido periodontal e evidências científicas têm comprovado seu importante papel na resposta imune inata do hospedeiro. Esses peptídeos possuem variadas funções, incluindo atividade antimicrobiana direta contra microrganismos, assim como mediação entre resposta imune inata e adaptativa. Pode-se prever que uma melhor compreensão de como os peptídeos antimicrobianos são regulados e sua função irá eventualmente conduzir a novos diagnósticos, prevenção e / ou estratégias terapêuticas para as doenças periodontais.
2.4 Peptídeos antimicrobianos e sua participação em outras doenças
Uma variedade de doenças da pele humana, como psoríase e dermatite atópica,têm demonstrado expressão ou síntese anormal de peptídeos antimicrobianos (Izadpanah, Gallo67, 2005). Alguns fatores físicos podem facilitar a colonização de S. aureus em casos de dermatite atópica, incluindo a ruptura do extrato córneo, reduzido teor de lipídios da pele, pH mais alcalino da superfície da pele e aumento na deposição de fibronectina e fibrinogênio. No entanto, os pacientes com psoríase ou dermatite atópica, têm a função de barreira da pele alterada. Porém, pacientes que são psoríaticos são mais resistentes a infecções de pele do que pacientes saudáveis. Cerca de 30% dos pacientes que apresentam dermatite atópica dispõem de infecções bacterianas e viróticas na pele, comparados a apenas 7% de pacientes com psoríase (Grice et al.53, 1975).
A suscetibilidade de pacientes com dermatite atópica para infecções foi elucidada por Ong et al.100 (2002), quando descobriram que esses indivíduos apresentavam produções de LL-37 e hBD 2 suprimidas durante a inflamação. Foram avaliadas as expressões das proteínas LL-37 e hBD 2 em amostras de biópsias realizadas da pele de pacientes com psoríase, pacientes com dermatite atópica e pacientes saudáveis. Em todas as análises realizadas foram encontradas abundante presença tanto de LL-37 como de hBD 2 na epiderme
de todos os paciente que apresentavam psoríase. Ao contrário de pacientes com dermatite atópica, que apresentaram baixas evidências desses peptídeos, tanto em lesões cutâneas agudas como crônicas. A combinação de LL-37 e hBD 2 apresentou uma atividade antimicrobiana sinergética, efetivamente matando S. aureus. Nomura et al.98 (2003) também compararam lesões cutâneas de paciente tanto com psoríase como com dermatite atópica e confirmaram as altas concentrações de peptídeos no filtrado inflamatório de pacientes psoríaticos, e em pacientes com dermatite atópica baixa expressão de catelicidina e hBD 2.
A pele de pacientes com psoríase responde da mesma forma como qualquer outro paciente saudável a inflamações, sintetizando maior quantidade de peptídeos antimicrobianos, mas a pele de pacientes com dermatite atópica não. Essa incapacidade em sintetizar peptídeos antimicrobianos pode ser motivada pela supressão causada pelas citocinas para Th2, as quais apresentam-se em altos níveis na dermatite atópica, já que os queratinócitos em cultura parecem perder a habilidade de aumentar a expressão de hBD 2 quando expostos a IL-4 ou IL-13.
Além do mais, os peptídeos que são normalmente expressos nos queratinócitos pela inflamação apresentam uma relevante atividade antimicrobiana contra S. aureus, vírus herpes simples e vírus vaccinia (Howell et al.66, 2004). Como esses organismos são particularmente patogênicos para pacientes com dermatite atópica, a deficiência de LL-37 e hBD 2 nos pacientes que possuem menor resistência a infecções dessa origem, mostra que a ausência de peptídeos pode explicar a susceptibilidade desses pacientes com dermatite atópica à infecções. Além de sua atividade antimicrobiana, pode-se ressaltar a atividade antiviral dos peptídeos antimicrobianos. Tanto a HNP1 como a hBDs 2, 3 e a LL-37 apresentam atividade antiviral contra o vírus da Imunodeficiência (HIV-1) (Chang et al.32, 2005; Seidel et al.117, 2010; Barlow et al.9, 2014). A hBD 3 interage com importantes glicoproteínas presentes no HIV-1, como a gp120, durante a infecção e ambos, tanto a hBD 2 como a hBD 3, promovem uma supressão da quimiocina C-X-C, ligante do receptor 4 envolvido no processo de infecção do HIV-1 (Seidel et al.117, 2010).
Barlow et al.9 (2014) envidenciaram a proteção celular causada pela LL-37 contra a ação do HIV-1 in vitro, além de sua capacidade de suprimir a atividade de transcrição reversa do HIV-1. Porém, ainda existem várias controversas em relação à expressão de defensinas e a infecção por HIV. A partir de um estudo coorte, Hardwick et al.57 (2012) avaliaram pacientes portadores do HIV-1. Altos níveis de hBD foram encontrados, contudo esses níveis não resultaram em baixa carga viral e não melhoraram a resposta imunológica dos pacientes. Na verdade, o inverso foi observado sugerindo que as propriedades imunomodulatórias das
defensinas podem ser subvertidas durante a infecção do HIV-1. Uma explicação para esse resultado aparentemente paradoxal foi que essas altas concentrações de hBD podem ter promovido um aumento no recrutamento de células que expressam o CCR6, os quais são altamente tolerantes à infecção por HIV-1, amplificando assim o foco de infecção de HIV-1.
Além da sua atividade contra o HIV-1, a HNP 1 também apresentou uma relevante atividade antiviral contra o adenovírus, sorotipo 5, sendo capaz de ligar-se ao capsídeo desse vírus (Smith, Nemerow120, 2008). Hazrati et al.58 (2006) também enfatizaram a atividade antiviral das HNP 1-3 só que no combate ao vírus herpes simples-1, por intermédio de sua ligação à glicoproteína B. Assim como sua capacidade em inibir a replicação do vírus Influenza A, apontada por Salvatore et al.114 (2007). Também foi identificada propriedade da LL-37 contra o vírus Influenza A, ligando-se à membrana até o rompimento (Tripathi et al.130, 2013).
Alguns estudos avaliaram a presença de peptídeos em pacientes portadores da síndrome de Sjögren, uma doença auto-imune de causa desconhecida que afeta as glândulas lacrimais e salivares causando secura nos olhos e boca (Peluso et al.105, 2007). A alta incidência tanto de cárie quanto de doença periodontal nesses pacientes pode ocorrer em virtude da redução dos níveis de peptídeos antimicrobianos na cavidade oral. Em algumas terapias, como o uso de pilocarpina para auxiliar na normalização do fluxo salivar, pode regularizar a concentração dessas proteínas (Peluso et al.105, 2007).
Peluso et al.105 (2007) investigaram o efeito da pilocarpina sobre os peptídeos salivares e no perfil das proteínas em pacientes portadores da síndrome de Sjögren. Após análise, foi encontrado que, previamente à administração de pilocarpina, as amostras de pacientes com síndrome de Sjögren apresentavam baixos ou até mesmo níveis indetectáveis de proteínas salivares. Após administração de pilocarpina, houve um aumento na expressão de cerca de 30% das proteínas, atingindo valores similares aos observados no grupo de pacientes saudáveis. A pilocarpina praticamente restabeleceu os níveis de proteínas no pacientes com síndrome de Sjögren. Foram detectados altos níveis de HNP 1 e de hBD 2 na saliva de pacientes que apresentavam a síndrome de Sjögren, bem como foi notada uma correlação entre a presença desses peptídeos e a presença de inflamação oral nesses indivíduos.
Kawasaki et al.70 (2003) também relataram uma significante expressão gênica de hBD 2 em células do tecido epitelial de pacientes portadores da síndrome de Sjögren. Esses resultados enfatizam que a hBD 2 pode ser considerada um indicador de inflamação presente nos pacientes portadores da síndrome de Sjögren, podendo resultar em altos níveis de citocinas como IL-1, IL-6 e TNF-α (Fox et al.49, 1994; Tishler et al.128, 1999).
Nos mamíferos, em resposta a uma infecção, diferentes peptídeos antimicrobianos são sintetizados simultaneamente. Mesmo com o seu amplo espectro, cada peptídeo possui sua especificidade, direcionada a determinados fungos, vírus e bactérias positivas ou gram-negativas. A ausência de um peptídeo não será imediatamente letal mas pode manifestar um defeito característico na resposta antimicrobiana.
3 PROPOSIÇÃO
Os objetivos deste estudo foram:
Investigar a influência do tabagismo sobre os níveis dos peptídeos antimicrobianos, HNP 1-3 e LL-37, no fluido crevicular gengival de pacientes com periodontite crônica.
4 MATERIAL E MÉTODO
O protocolo deste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos (CEP) da Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP sob o número CAAE 01394712.5.0000.5416 (Anexo A).
4.1 População de estudo
Para o presente estudo, 60 indivíduos foram recrutados na Clínica de Periodontia da Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP. Estes pacientes foram esclarecidos sobre os objetivos do estudo e assinaram o Termo de Consentimento Livre Esclarecido (TCLE) consentindo em participar do mesmo (Apêndice A). Dos indivíduos selecionados, 40 foram diagnosticados com periodontite crônica de moderada a severa, incluindo 20 pacientes fumantes e 20 pacientes nunca fumantes, e 20 não apresentavam doença periodontal. Assim, três grupos distintos foram constituídos: sem doença periodontal, periodontite fumante e periodontite não fumante.
Os pacientes com doença periodontal, deveriam apresentar no mínimo 15 dentes naturais e pelo menos 4 sítios com PS ≥ 4 mm (Takeuchi et al.124, 2012), sangramento à sondagem (SS), e nível clínico de inserção NCI ≥ 5mm (Brancatisano et al.24, 2011), com exceção dos terceiros molares. Pacientes fumantes deveriam fumar regularmente pelo menos 10 cigarros/dia pelo período mínimo de 5 anos e pacientes nunca fumantes nunca deveriam ter fumado (Buduneli et al.27, 2005; Buduneli et al.28, 2009). Os pacientes sem doença periodontal deveriam apresentar no mínimo 24 dentes naturais, PS ≤ 3 mm, ausência de perda de inserção, índice de placa visível (IPV) e índice de sangramento gengival (ISG) ≤ 15%. Todos os participantes deveriam apresentar boas condições de saúde geral.
Os critérios de exclusão do estudo foram: presença de condição sistêmica com reconhecida interferência no processo saúde/doença periodontal, presença de desordem imunológica, realização de tratamento periodontal nos últimos seis meses, utilização de antibióticos e anti-inflamatórios esteróides ou não-esteróides nos últimos três meses, pacientes gestantes, lactantes ou que fazem uso de hormônios (Turkoglu et al.132, 2010).
4.2 Exame clínico periodontal
O exame clínico periodontal dos pacientes foi realizado por um único investigador, previamente treinado e calibrado. Para calibração do examinador o parâmetro clínico profundidade de sondagem foi mensurado em seis dentes (16, 21, 24, 36, 41 e 44), de acordo com o índice de Ramfjord, em um total de 6 pacientes (36 sítios/paciente) em duas ocasiões distintas com um intervalo de 7 dias. Os dados foram submetidos à análise de concordância Kappa. O valor obtido, k=0,91, demonstrou um excelente índice de concordância intra-examinador.
Para determinação da condição periodontal dos pacientes, os seguintes parâmetros clínicos foram avaliados,IPV e ISG (Ainamo, Bay3, 1975), PS, SS e NCI. O IPV e ISG foram avaliados em quatro sítios por dente (mesial, distal, vestibular e lingual), enquanto os demais parâmetros foram avaliados em seis sítios por dente (mésio-vestibular, vestibular, disto-vestibular, mésio-lingual, lingual e disto-lingual) em todos os dentes, excluindo-se os terceiros molares. A sondagem dos dentes foi realizada com uma sonda periodontal milimetrada Carolina do Norte (Hu-friedy®, Chicago, IL, EUA).
4.3 Coleta de amostras de fluido crevicular gengival
Amostras do FCG foram coletadas de sítios sadios (n=5) e doentes, com periodontite,(n=5) dos paciente portadores de periodontite crônica (Dommisch et al.45, 2005; Brancatisano et al.24, 2011) e de sítios sadios nos pacientes com ausência de doença periodontal (n=5). A seleção dos sítios foi realizada de forma aleatória em dentes distintos e não adjacentes. Estas amostras foram coletadas por um único examinador um dia após a realização dos exames clínicos (Turkoglu et al.132, 2010).
Sítio sadio: sítio com ausência de sangramento marginal (ISG = 0), PS ≤ 3 mm, com ausência de sangramento a sondagem e perda de inserção clínica.
Sítio doente: sítio com presença de sangramento marginal, PS e NCI ≥ 5mm com evidência de sangramento a sondagem.
Para a coleta do FCG, a placa supragengival foi removida com gaze estéril e os sítios selecionados foram isolados com roletes de algodão e gentilmente secos com jato de ar. Tiras
