UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
MURILO PASTORELLO PEREIRA
DESENVOLVIMENTO DE SUBSTRATOS SERS PARA DETECÇÃO DE POLUENTES AMBIENTAIS EMERGENTES
CAMPINAS 2016
MURILO PASTORELLO PEREIRA
DESENVOLVIMENTO DE SUBSTRATOS SERS PARA DETECÇÃO DE POLUENTES AMBIENTAIS EMERGENTES
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Química na área de Química Inorgânica.
Orientador: Prof. Dr. Italo Odone Mazali
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO MURILO PASTORELLO PEREIRA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. ITALO ODONE MAZALI.
CAMPINAS 2016
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação aos meus pais, Mauro e Magaly, e a todos os professores que, de alguma forma, contribuíram para a minha vida escolar e acadêmica.
AGRADECIMENTOS
À minha família, pelo apoio em todos os momentos e sentidos, e especialmente aos meus pais Mauro e Magaly, pelo incentivo, apoio emocional e financeiro, compreensão e paciência. Eu amo vocês!
Ao meu orientador, Prof. Italo Odone Mazali, por todo o conhecimento compartilhado, pelos conselhos e todas as conversas (sobre química ou não), e pela oportunidade de participar de um grupo de pesquisa que me trouxe tantos momentos e resultados positivos, desde a iniciação científica até o final do mestrado. Ao Prof. Fernando Sigoli, e a todos os colegas do Laboratório de Materiais Funcionais: Anerise, Alice, Carla, Charlão, Cris, Dagbau, Emille, Filipe, Gabi, Gilmar, João (presente na maior parte do meu mestrado), Josi, Lanousse, Larissa, Laura, Lidiane, Carol, William, e em especial ao Isaías, Naiara, Bia e Adriana, que, além de colegas, se tornaram amigos próximos e queridos! Vou sentir saudades.
― Agradeço ainda aos que estiveram presentes no laboratório durante a minha iniciação científica, especialmente Juliana, Mathias e Ernesto. Às amigas Thalita, Denise, Fernanda e Vanessa, por todos os bons momentos desde a graduação.
Aos amigos Guilherme, Hugo, Thiago, João, João Flora, Lucas, Fábio, Gustavo e Bruno, por todos os anos de amizade, viagens, festas, conversas e bons momentos!
À Emille e ao Douglas, pelas imagens de TEM, e ao técnico Hugo Loureiro, pelas imagens de SEM, realizadas no IQ-UNICAMP; à Cristine, pelas imagens de HRTEM e medidas de EDS realizadas no LNNano.
Aos funcionários do IQ-UNICAMP: Milene, Claudinha, Sônia e Renata pela ajuda na realização das medidas, e pelas boas conversas.
Aos professores Diego Pereira dos Santos e Daniela Zanchet, pelas contribuições no Exame de Qualificação.
RESUMO
O Espalhamento Raman Intensificado por Superfície (SERS – Surface-Enhanced Raman Scattering) é um fenômeno observado quando uma molécula é adsorvida na superfície de um substrato metálico, fazendo com que a intensidade do seu espalhamento Raman seja amplificada em diversas ordens de grandeza. O presente trabalho teve como objetivo a síntese de nanoestruturas de ouro e prata com morfologias e tamanhos controlados, e sua aplicação como substrato SERS para a detecção de moléculas que vêm sendo classificadas como poluentes ambientais emergentes em ambientes aquáticos. Foram sintetizados nanobastões monometálicos de ouro, e bimetálicos de ouro e prata em uma estrutura caroço-casca, controlando suas dimensões e espessura da casca. Os materiais foram caracterizados pelas técnicas de espectroscopia de absorção (UV-Vis-NIR), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM), e espectroscopia de raios X por energia dispersiva (EDS), e os resultados indicaram a obtenção das nanopartículas com tamanho e morfologia controlados. Os substratos SERS foram preparados através da deposição das suspensões de nanopartículas em placas de vidro funcionalizadas com alcoxissilanos, seguida da deposição da molécula de interesse. Sua caracterização foi feita por espectroscopia de absorção (UV-Vis-NIR) e microscopia eletrônica de varredura (SEM), que mostraram as propriedades óticas e a organização das nanopartículas depositadas, respectivamente. A eficiência dos substratos foi avaliada através de mapeamentos SERS utilizando a molécula sonda 4-aminobenzotiol (4-ABT) a partir de soluções diluídas consecutivamente, até o limite em que as bandas características da molécula pudessem ser observadas nos espectros. As análises foram realizadas utilizando fonte de excitação em 633 nm. O substrato contendo nanopartículas caroço-casca mostrou maior eficiência para a molécula sonda, atingindo o limite de detecção de 1.10-15 mol L-1, e foi então testado na análise das moléculas de poluentes ambientais, o fármaco sulfatiazol, e os pesticidas tiram e paration.
ABSTRACT
Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) is a phenomenon observed when a molecule is adsorbed on the surface of a metallic substrate, leading to an increase in the intensity of the Raman scattering in several orders of magnitude. The present work describes the synthesis of gold and silver nanostructures with controlled morphology and size, and their application as SERS substrates for the detection of molecules that have been classified as contaminants of emerging concern in water resources. Monometallic gold nanorods and core-shell gold-silver nanorods have been synthesized under specific conditions, with control of their dimensions and shell thickness. The particles were characterized by absorption spectroscopy in the UV-Vis-NIR region, transmission electron microscopy (TEM), high-resolution transmission electron microscopy (HRTEM), and energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS), and the results confirmed the production of nanoparticles with well-defined size and morphology. SERS Substrates were prepared by deposition of the nanoparticles onto functionalized glass slides, followed by the deposition of the molecules of interest. The slides were characterized by absorption spectroscopy in the UV-Vis-NIR region, which showed the optical properties of the deposited nanoparticles, and scanning electron microscopy (SEM), that elucidated their dispersion over the surface. The efficiency of the SERS substrates was evaluated by mapping analyses using the probe molecule 4-aminobenzothiol (4-ABT) from consecutively diluted solutions and excitation source at 633 nm, until the characteristic bands of the molecule could no longer be detected in the spectra. The substrates containing core-shell nanoparticles showed higher sensitivity for probe molecule detection, reaching a detection limit of 1.10-15 mol L-1, and were thus employed in the detection of the drug Sulfathiazole, and the pesticides Thiram and Parathion.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
4-ABT 4-aminobenzotiol
APTMS (3-aminopropil)-trimetoxissilano
Au@AgNRs nanobastões caroço-casca de ouro e prata AuNRs nanobastões de ouro
CCD dispositivo de carga acoplada (charge-coupled device) CNPEM Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais
CTAB brometo de cetiltrimetilamônio (cetyltrimethylammonium bromide)
cts contagens
EDS espectroscopia de raios X por energia dispersiva (energy dispersive X-ray spectroscopy)
EM mecanismo eletromagnético
EPA Agência de Proteção Ambiental (Environmental Protection Agency) fcc cúbico de faces centradas (face-centered cubic)
FDTD diferenças finitas no domínio do tempo (fnite-difference time-domain) He-Ne hélio-neônio
HOMO orbital molecular ocupado de mais alta energia (highest occupied molecular orbital)
HRTEM microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (high-resolution transmission electron microscopy)
JCPDS Comitê de Padrões de Difração de Pó (Joint Committee on Powder Diffraction Standards)
LMEOA Laboratório Multiusuário de Espectroscopia Óptica Avançada LNNano Laboratório Nacional de Nanotecnologia
LSPR ressonância de plasmon de superfície localizado (localized surface plasmon resonance)
LUMO orbital molecular não ocupado de mais baixa energia (lowest unoccupied molecular orbital)
MPTMS (3-mercaptopropil)-trimetoxissilano OMS Organização Mundial da Saúde
PDT propanoditiol
PVP polivinilpirrolidona
Ref. referência
rpm rotação por minuto
SEM microscopia eletrônica de varredura (scanning electron microscopy) SERS espalhamento/espectroscopia Raman intensificado(a) por superfície
(surface-enhanced Raman scattering/spectroscopy) SM-SERS SERS de única molécula (single molecule-SERS) TC mecanismo de transferência de carga
TEM microscopia eletrônica de transmissão (transmission electron mcroscopy)
TEM-FEG microscopia eletrônica de transmissão com emissão de campo (transmission electron mcroscopy - field emission gun)
u.a. unidade arbitrária
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas UV-Vis-NIR ultravioleta-visível-infravermelho próximo
LISTA DE SÍMBOLOS
tempo
⃗ campo elétrico oscilante
amplitude de oscilação do campo elétrico
frequência de oscilação do campo elétrico ⃗ momento de dipolo elétrico induzido ̂ tensor de polarizabilidade
deslocamento em relação à posição de equilíbrio
amplitude de vibração de uma molécula
frequência de vibração de uma molécula polarizabilidade na posição de equilíbrio nível vibracional molecular
Intensidade da luz espalhada por uma molécula
fluxo de fótons incidentes em uma molécula
seção de choque do espalhamento Raman
( ) função dielétrica
( ) componente real da função dielétrica
( ) componente imaginário da função dielétrica
⃗ campo elétrico na região externa de uma nanopartícula ⃗ campo elétrico incidente orientado na direção
direção radial em relação a uma esfera , , coordenadas cartesianas
, , vetores unitários raio de uma esfera
constante dielétrica do meio
( ) função dielétrica de uma nanopartícula metálica pH potencial hidrogeniônico
pKa logaritmo negativo da constante de acidez fator de intensificação
intensidade da banda no espectro SERS
intensidade da banda no espectro Raman
concentração da solução depositada em placa de vidro concentração da solução depositada em substrato SERS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Lista de reagentes utilizados no trabalho... 43 Tabela 2. Potenciais-padrão de redução dos íons e complexos de ouro em água...50 Tabela 3. Atribuições das bandas nos espectros Raman e SERS do 4-ABT...70
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação dos processos de espalhamento (A) Rayleigh, e Raman
(B) Stokes e (C) anti-Stokes. ... 23
Figura 2. Exemplo de um espectro Raman mostrando a linha do laser ao centro, e as bandas Stokes e anti-Stokes. Adaptado da Ref. . ... 24
Figura 3. Representação da oscilação da nuvem eletrônica em uma nanopartícula metálica esférica na presença de um campo elétrico incidente. Adaptado da Ref. 36. ... 29
Figura 4. Componentes real (Re[ ]) e imaginária (Im[ ]) da função dielétrica do ouro e da prata em função do comprimento de onda. Adaptado da Ref. 38. ... 30
Figura 5. Representação dos processos fotoinduzidos de transição eletrônica entre os estados eletrônicos do metal e da molécula adsorvida quimicamente. ... 34
Figura 6. Intensificação do campo eletromagnético ao redor de um dímero de nanopartículas de Au de 100 nm de diâmetro, com espaçamento de 0,5 nm, calculada pelo método FDTD. A incidência da radiação é perpendicular ao eixo entre as nanopartículas. Adaptado da Ref. 64. ... 36
Figura 7. Estrutura molecular genérica das sulfonamidas. ... 38
Figura 8. Estrutura molecular do fármaco sulfatiazol. ... 39
Figura 9. Estrutura molecular do fungicida tiram. ... 40
Figura 10. Estrutura molecular do inseticida paration ... 41
Figura 11. Esquema reacional da preparação das sementes de ouro. ... 44
Figura 12. Esquema reacional do crescimento dos nanobastões de ouro. ... 45
Figura 13. Esquema reacional da síntese da casca de prata sobre os AuNRs. ... 45
Figura 14. (A) Estrutura molecular do CTAB e (B) bicamada de CTAB na superfície do nanobastão de ouro (adaptado da Ref. ). ... 49
Figura 15. Ilustração da estrutura cuboctaédrica das sementes de ouro estabilizadas por CTAB. Adaptado da Ref. 107. ... 51
Figura 16. Ilustrações e imagens de TEM do surgimento de planos de truncamento durante o crescimento das sementes de ouro. Adaptado da Ref. 107. ... 52
Figura 17. Estrutura cristalina dos AuNRs e dos ângulos entre as faces para os modelos propostos por (A) Wang e (B) Carbó-Argibay. Adaptado da Ref. 109. ... 54
Figura 18. Espectro de extinção da suspensão de AuNRs. ... 54
Figura 20. Histograma tridimensional da distribuição dimensional dos AuNRs. ... 56 Figura 21. (A-B) Imagens de HRTEM dos nanobastões de ouro. A região ampliada da Figura 21A mostra a medida da distância interplanar. ... 57 Figura 22. Espectros de extinção na região do UV-Vis-NIR dos AuNRs, e das partículas caroço-casca Au@Ag sintetizadas pela adição de diferentes volumes da solução de AgNO3 1 mmol L-1. ... 59
Figura 23. Fotos das suspensões obtidas nas sínteses de AuNRs e Au@AgNRs. . 60 Figura 24. (A-D) Imagens de HRTEM dos Au@AgNRs. A região ampliada da Figura 24B mostra a medida da distância interplanar. ... 61 Figura 25. (A-B) Imagens de mapeamento de composição química dos nanobastões caroço-casca de ouro e prata, e gráficos da distribuição de composição ao longo da (C) Linha 1 e (D) Linha 2 na Figura 25B. ... 62 Figura 26. Estruturas moleculares do (A) MPTMS e (B) APTMS. ... 63 Figura 27. Ilustração da funcionalização do substrato de vidro com alcoxissilanos, com a representação da hidrólise, seguida da condensação. Na última imagem à direita, é mostrado exemplo do vidro funcionalizado com MPTMS. ... 63 Figura 28. Ilustrações da (A) deposição de AuNRs sobre vidro funcionalizado com MPTMS e (B) intercalação das deposições com PDT. ... 64 Figura 29. Espectros de extinção dos substratos contendo AuNRs e Au@AgNRs. A linha vermelha indica o comprimento de onda de excitação do laser utilizado no Raman (632,8 nm). ... 65 Figura 30. Imagens de SEM de um único substrato contendo AuNRs, em diferentes magnificações. ... 66 Figura 31. Imagens de SEM de um único substrato contendo Au@AgNRs, em diferentes magnificações. ... 67 Figura 32. Imagem de SEM dos Au@AgNRs agregados na superfície do substrato. ... 68 Figura 33. (A) Estrutura molecular do 4-ABT, e (B) ilustração da interação das moléculas de 4-ABT com a superfície dos AuNRs depositados sobre o substrato de vidro funcionalizado. ... 69 Figura 34. Espectro Raman do 4-ABT sólido (preto), e espectro SERS do 4-ABT depositado em substrato de AuNRs a partir de solução 10-3 mol L-1 (vermelho). ... 69 Figura 35. Espectros obtidos a partir das médias dos mapeamentos realizados nos substratos (A) AuNRs e (B) Au@AgNRs, preparados a partir de soluções de 4-ABT
em concentrações decrescentes. No detalhe da Figura 35B, é mostrada a ampliação do espectro para a concentração 1.10-15 mol L-1. ... 72 Figura 36. Mapas de 50 espectros SERS para os substratos contendo Au@AgNRs e soluções de 4-ABT (A) 1.10-4 e (B) 1.10-12 mol L-1. Os gráficos estão na mesma escala. ... 73 Figura 37. Espectro Raman do sulfatiazol sólido (linha vermelha) e espectros SERS obtidos a partir de mapeamentos dos substratos contendo solução de sulfatiazol 1.10-3 mol L-1 (linhas pretas). ... 74 Figura 38. Espectro Raman do tiram sólido, e espectros SERS obtidos a partir das médias dos mapeamentos realizados nos substratos preparados a partir de soluções aquosas de tiram em concentrações decrescentes. ... 75 Figura 39. (A) Estrutura molécular do tiram e (B) fragmento do tiram coordenado à superfície metálica de forma bidentada após clivagem da ligação S–S. ... 76 Figura 40. Determinação da intensidade da banda em 560 cm-1 para o espectro da solução de tiram 1.10-3 mol L-1 depositada em placa de vidro, e para a solução 1.10-7 mol L-1 depositada em substrato contendo Au@AgNRs. ... 77 Figura 41. Espectro Raman do paration sólido (linha vermelha) e espectros SERS obtidos a partir de mapeamentos nos substratos contendo solução de paration 1.10-4 mol L-1 (linhas pretas). ... 78 Figura 42. Espectros obtidos a partir de mapeamento na superfície dos substratos contendo Au@AgNRs, sem a deposição de moléculas. ... 79
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 19
2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS ... 20
2.1 Espectroscopia Raman ... 20
2.2 Espectroscopia Raman Intensificada por Superfície (SERS) ... 26
2.2.1 Mecanismo Eletromagnético ... 28
2.2.2 Mecanismo Químico ... 33
2.3 Substratos SERS ... 35
2.4 Poluentes Ambientais Emergentes ... 37
2.4.1 Fármacos ... 38
2.4.2 Pesticidas ... 39
3. OBJETIVOS ... 42
4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 43
4.1 Síntese de nanobastões de ouro (AuNRs) ... 44
4.1.1 Preparação da suspensão de sementes de ouro ... 44
4.1.2 Preparação da solução de crescimento dos AuNRs ... 44
4.2 Síntese de nanobastões caroço-casca de ouro e prata (Au@AgNRs)... 45
4.3 Preparação dos substratos SERS ... 46
4.4 Caracterização ... 46
4.4.1 Caracterização das suspensões de nanopartículas ... 46
4.4.2 Caracterização dos substratos SERS ... 47
4.5 Avaliação da atividade SERS dos substratos ... 47
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 49
5.1 Nanobastões de ouro ... 49
5.2 Nanobastões caroço-casca de ouro e prata ... 57
5.4 Análise de Poluentes Ambientais Emergentes ... 73 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ... 80
1. INTRODUÇÃO
Milhares de produtos químicos artificiais são usados diariamente, sendo que todos apresentam potencial para atingir e contaminar os recursos hídricos por diversas vias.A contaminação ocorre a partir dos resíduos gerados tanto pela sua produção industrial quanto pelo seu consumo na sociedade. Fármacos e outros contaminantes de águas residuais são compostos que têm recebido muita atenção pública e do meio científico em vários países. Apesar de alguns serem encontrados em baixas concentrações, o monitoramento dos recursos hídricos é de extrema importância para garantir a qualidade da água distribuída para a população, evitando riscos à saúde humana 1,2.
Muitas técnicas são usadas para a detecção de moléculas contaminantes ambientais, como a eletroforese capilar e a cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas 3,4. Ambas são técnicas muito eficientes e com alto poder de detecção, mas apresentam limitações, como a necessidade de pré-concentração quando a concentração dos analitos é baixa, e purificação quando a matriz é complexa. Além disso, são relativamente demoradas, pois requerem a coleta, transporte, armazenamento e preparo da amostra. A busca por uma ferramenta analítica altamente sensível, portátil, de baixo custo e que permita a detecção de compostos ao nível de traços, torna-se uma necessidade.
Dentro deste contexto, o presente trabalho propõe o desenvolvimento de um substrato que seja eficiente na detecção de moléculas poluentes em baixas concentrações, utilizando a espectroscopia Raman como ferramenta analítica. Através do uso de nanopartículas metálicas depositadas em vidro, pretende-se desenvolver um substrato a partir do qual a influência do tamanho e composição dessas partículas será avaliada na eficiência de detecção de moléculas selecionadas, visando a obtenção de um sistema que possa ser utilizado em análises de rotina, principalmente na área de controle ambiental.
2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS
2.1 Espectroscopia Raman
A espectroscopia Raman é uma técnica de espectroscopia vibracional, que tem como princípio físico fundamental o espalhamento inelástico da radiação eletromagnética após a interação da sua componente do campo elétrico com a matéria. É uma técnica baseada em uma fonte de radiação monocromática, que tipicamente emprega comprimentos de onda na região do infravermelho próximo até o ultravioleta, passando pela região do visível 5,6. O efeito Raman foi inicialmente observado pelo físico indiano Sir Chandrasekhara Venkata Raman (1888 – 1970) na década de 1920, ao estudar os efeitos de espalhamento da luz em materiais transparentes a ela. Inspirado pelo desejo em explicar fenômenos óticos naturais como a cor azul do mar, Raman e seus colaboradores realizaram diversos experimentos utilizando a luz do sol como fonte de radiação, em equipamentos bastante rudimentares, como telescópios e filtros de cor. O efeito descoberto por eles foi oficialmente publicado em 1928, junto com o primeiro registro espectral realizado para o benzeno. Contudo, previsões teóricas deste fenômeno já haviam sido feitas em 1923 pelo físico austríaco Adolf Smekal, e observações experimentais foram realizadas quase simultaneamente pelos físicos russos Grigorii Landsberg e Leonid Mandelstam 7,8.
Dentre os processos óticos decorrentes da interação da radiação eletromagnética com a matéria, destacam-se a absorção e o espalhamento, sendo o último responsável pelo efeito Raman. O espalhamento da radiação pode ser entendido a partir da interação do campo eletromagnético da radiação incidente com o material, o que promove uma perturbação no sistema. A matéria, apesar de ser essencialmente contínua e, em geral, eletricamente neutra, é formada por distribuições discretas de carga elétrica. Ao incidir no material, o campo elétrico da radiação induz um momento de dipolo que faz com que as cargas oscilem na mesma frequência, e essa movimentação de cargas leva à emissão de ondas secundárias, que se sobrepõem formando a radiação espalhada. A radiação é espalhada em todas as direções, e a sua polarização geralmente é diferente em relação à onda incidente, podendo haver ou não variação na energia 9,10,11.
No espalhamento elástico, o fóton espalhado possui a mesma energia do fóton incidente, processo chamado de espalhamento Rayleigh. Já no espalhamento inelástico, a sua energia pode ser maior ou menor em relação ao fóton incidente, o que está associado à transição entre dois estados. Uma das principais formas de espalhamento inelástico em moléculas é o espalhamento Raman, em que a variação de energia corresponde à diferença entre níveis vibracionais/rotacionais 12.
Considerando uma radiação eletromagnética monocromática, o campo elétrico oscilante que varia com o tempo ( ) é dado pela Equação 1:
(
)
(1)na qual é a amplitude de oscilação do campo, e é a sua frequência. Quando essa radiação incide em uma molécula, ela altera a distribuição da densidade eletrônica, gerando um momento de dipolo elétrico induzido (P), representado pela Equação 2:
⃗ ̂ ⃗
(2)A constante de proporcionalidade, ̂
,
é o tensor de polarizabilidade, que representa a facilidade com que a nuvem eletrônica da molécula é distorcida na presença do campo elétrico em relação à configuração de equilíbrio, gerando o momento de dipolo.Se esta molécula vibra a uma frequência , então o deslocamento em relação à posição de equilíbrio ( ) para um determinado modo vibracional é dado pela Equação 3:
(
)
(3)em que é a amplitude da vibração. Já a polarizabilidade pode ser descrita em
termos da contribuição do modo vibracional por uma expansão em série, como mostrado na Equação 4:
(
)
(
)
(4)
Nesta equação, é a polarizabilidade na posição de equilíbrio, e (∂ /∂ )0 é a taxa
da variação da polarizabilidade com relação à variação de , avaliada na posição de equilíbrio. Para o caso das vibrações moleculares, em que o deslocamento dos átomos em relação à posição de equilíbrio é pequeno, podem-se desconsiderar os termos de maior ordem, aproximando a dependência da polarizabilidade a uma expansão de primeira ordem. Assim, combinando as Equações de 1 a 4, obtém-se:
(
)
(
) (
)
(
)
(
) (
)
(
) (
)
(
)
(
)
(
) (
)
(5)O primeiro termo da Equação 5 se refere ao momento de dipolo oscilante que gera radiação com frequência , ou seja, o espalhamento Rayleigh. Já no segundo termo, correspondente ao espalhamento Raman, a frequência emitida pode ser menor que a frequência incidente ( ), ou maior ( ), chamados de espalhamento Stokes e anti-Stokes, respectivamente 13,14.
A Figura 1 mostra diagramas de níveis de energia que ilustram esses três processos. Na parte inferior da figura, é representado o nível eletrônico fundamental da molécula, com os respectivos níveis vibracionais, enquanto na parte superior, está o primeiro nível eletrônico excitado, também contendo os níveis vibracionais. Na técnica de espectroscopia Raman convencional, a energia da radiação de excitação não é suficiente para levar a molécula para o primeiro estado eletrônico excitado; em vez disso, ela é levada ao chamado estado virtual, representado pela linha
tracejada. Este estado não é solução de uma equação de Schrödinger independente do tempo, não correspondendo a um valor bem definido de energia, e portanto, não representa um estado estacionário do sistema 15.
Figura 1. Representação dos processos de espalhamento (A) Rayleigh, e Raman (B) Stokes e (C) anti-Stokes.
No espalhamento Rayleigh (Fig. 1A), a radiação incidente leva a molécula a um estado virtual, e é espalhada sem sofrer variação na energia, com a molécula retornando ao estado fundamental. No espalhamento Raman do tipo Stokes (Fig. 1B), a molécula é excitada do estado vibracional fundamental
= 0 para um estado virtual, e retorna para o estado vibracional
= 1, sendo que a radiação é espalhada com energia menor em relação à incidente. Essa diferença de energia corresponde à transição
= 0
= 1 de um determinado modo vibracional. De acordo com a lei da distribuição de Maxwell-Boltzmann, à temperatura ambiente, uma pequena fração das moléculas se encontra em estados vibracionais excitados, como
= 1. A radiação incidente leva essas moléculas a um estado virtual que, ao retornarem para o estado fundamental
= 0, provocam o espalhamento da radiação com energia maior do que a incidente, dando origem ao efeito Raman anti-Stokes (Fig. 1C). Para este caso, a diferença de energia também corresponde à frequência do modo vibracional em questão 12.
O espectro Raman de uma molécula apresenta a intensidade do espalhamento em função do deslocamento Raman, expresso tipicamente em número de onda (cm-1), como mostrado na representação da Figura 2. Os valores de deslocamento Raman vistos no espectro são a diferença de frequência entre a radiação incidente e a radiação espalhada, e portanto, correspondem à frequência dos modos vibracionais da molécula. A banda atribuída ao espalhamento Rayleigh, coincidente com a frequência da fonte de excitação, é observada com alta intensidade no centro do espectro. Em valores positivos de deslocamento, são observadas as bandas atribuídas ao espalhamento Raman Stokes, e nos valores negativos correspondentes, ao espalhamento anti-Stokes. Os dois lados diferem somente nas intensidades de espalhamento, sendo as bandas anti-Stokes menos intensas, uma vez que a população de moléculas que se encontram nos estados vibracionais excitados é menor. Para que um modo vibracional de uma molécula seja ativo e observado no espectro Raman, deve ser obedecida a seguinte regra de seleção: a vibração de determinada ligação deve provocar variação na sua polarizabilidade, ou seja, o termo (∂α/∂q)0 da Equação 5 deve ser diferente de
zero 13,14.
Figura 2. Exemplo de um espectro Raman mostrando a linha do laser ao centro, e as bandas Stokes e anti-Stokes. Adaptado da Ref. 16.
Os processos de espalhamento são intrinsecamente fracos em condições típicas, quando comparados à absorção e fluorescência, por exemplo. No fenômeno de espalhamento Raman, a quantidade de luz espalhada por uma molécula considerando todas as direções,
(dada em fótons por segundo), se relaciona com o fluxo de fótons que incide nessa molécula, (dado em fótons cm-2 s-1) através da Equação 6:
(6)
A constante de proporcionalidade, , é a seção de choque para o espalhamento Raman, que é expressa em cm2 e depende da frequência de excitação. A definição geral da seção de choque de uma molécula, para um determinado fenômeno ótico linear, é a área de um feixe homogêneo incidente em que todos os fótons serão efetivamente envolvidos no processo. Quanto maior for o seu valor, maior a interação entre a radiação e a molécula, e portanto, maior a magnitude do processo. Dessa forma, a seção de choque permite comparar a eficiência de fenômenos óticos como a absorção e o espalhamento, uma vez que fornece a relação entre a quantidade de fótons que estarão envolvidos em cada processo. A seção de choque do espalhamento Raman é da ordem de magnitude de 10-29 cm2, enquanto para a absorção, por exemplo, valores típicos variam entre 10-18 e 10-21 cm2 12,17.
Na situação em que a energia do laser está em ressonância com uma transição eletrônica permitida da molécula, ou seja, em que essa energia é suficiente para levar a molécula para um estado eletrônico excitado, o processo é chamado de Raman ressonante 10. Neste caso, a condição de ressonância provoca alterações no tensor polarizabilidade da molécula, o que afeta diretamente a seção de choque do espalhamento. Consequentemente, a intensidade do espalhamento Raman é aumentada em várias ordens de grandeza com relação à técnica Raman convencional. Os modos vibracionais associados aos grupos da molécula responsáveis pela transição eletrônica (como grupos cromóforos) são preferencialmente intensificados no espectro, o que pode reduzir a complexidade espectral para esta molécula 10. Neste contexto, a espectroscopia Raman ressonante é considerada uma técnica de espectroscopia vibrônica, uma vez que
fornece informações das estruturas vibracional e eletrônica da amostra analisada. A seção de choque do espalhamento Raman ressonante é da ordem de 10-24 cm2.
Os espectros Raman são de simples aquisição, e requerem mínima ou nenhuma preparação da amostra. O espectro de uma molécula é bastante característico e funciona como a sua impressão digital, o que permite a identificação de compostos até mesmo em misturas 18. A aplicação convencional da técnica, entretanto, é limitada devido à baixa intensidade do espalhamento Raman, e/ou observação de fluorescência nos espectros para determinados analitos. Além disso, a técnica não apresenta sensibilidade suficiente para a investigação de compostos em baixa concentração, dificultando, por exemplo, sua aplicação para monitoramento ambiental 19. Estes problemas têm sido contornados com o desenvolvimento de metodologias que permitam a intensificação do espalhamento Raman, possibilitando sua aplicação como método analítico 5,19.
2.2 Espectroscopia Raman Intensificada por Superfície (SERS)
O efeito de espalhamento Raman intensificado por superfície (Surface-Enhanced Raman Scattering – SERS) consiste na intensificação do espalhamento Raman de uma molécula em várias ordens de grandeza quando ela está adsorvida na superfície de um metal, ou pelo menos nas suas proximidades (no máximo a 10 nm de distância). Esse efeito decorre, dentre outros fatores, da interação eletromagnética da luz incidente com a chamada ressonância de plasmon do metal 12.
A primeira observação do efeito SERS foi feita em 1974 por Fleischmann et al. 20 ao reportar o espectro Raman intensificado de uma monocamada de piridina adsorvida na superfície de um eletrodo rugoso de prata, cuja rugosidade foi gerada eletroquimicamente por ciclos de oxidação e redução. Os autores observaram uma intensificação na ordem de 106 em relação à molécula não adsorvida, e a atribuíram à grande área superficial do eletrodo rugoso, o que permitiria a adsorção de um maior número de moléculas. Entretanto, em 1977, Jeanmarie e Van Duyne 21 e Albrecht e Creighton 22 constataram que o aumento na intensidade de espalhamento era inconsistente com um simples aumento de área superficial do eletrodo, que, no caso da piridina, levaria a um aumento na concentração de moléculas na ordem de apenas 10 vezes. Eles assumiram, então, que se tratava de um novo fenômeno. Em
1978, Moskovits 23 sugeriu que a grande intensificação no espalhamento Raman observado era resultado da oscilação coletiva dos elétrons em nanoestruturas metálicas, a chamada ressonância de plasmon, essencialmente em cobre, prata e ouro. Ele previu ainda que o mesmo fenômeno seria observado em suspensões coloidais desses metais, recobertas com a molécula do analito em questão.
A partir de então, sucessivos estudos surgiram com o objetivo de comprovar as previsões realizadas anteriormente, e elucidar os mecanismos responsáveis pelo efeito de intensificação observado, buscando o desenvolvimento de novos substratos metálicos 24. Hoje, a técnica é apontada como uma sonda espectroscópica poderosa na detecção de várias moléculas, e sua aplicação é descrita na literatura na detecção de fármacos 25, poluentes ambientais 26, moléculas de interesse biológico 27, como DNA, enzimas e proteínas em geral, entre outras.
A explicação da origem do efeito SERS é dada de forma geral na literatura através de dois mecanismos distintos, porém complementares: o eletromagnético (EM) e o químico, ou de transferência de carga (TC). De maneira geral, o mecanismo eletromagnético está relacionado com a intensificação do campo eletromagnético próximo à superfície do metal, devido a efeitos óticos que surgem da sua interação com a radiação eletromagnética incidente. Este mecanismo é considerado como sendo o de maior contribuição para o efeito de intensificação do espalhamento. Já o mecanismo de transferência de carga sugere a interação química efetiva entre a molécula espalhadora e a superfície metálica, com a formação de complexos de transferência de carga, que causam modificação na polarizabilidade da molécula, levando então à intensificação do espalhamento 17,28. Esses efeitos têm sido amplamente estudados em nanopartículas metálicas, não somente por serem bons espalhadores de radiação, mas também por suas propriedades óticas serem facilmente moduladas 29.
Pesquisas envolvendo nanomateriais têm apresentado grande avanço devido à possibilidade de alterar as propriedades dos materiais conforme seu tamanho é reduzido para a escala nanométrica. Além de apresentarem maior razão área/volume, diferentes propriedades óticas, eletrônicas e magnéticas surgem nestes sistemas em relação aos materiais estendidos, o que permite aplicá-los em diversas áreas, como plasmônica, catálise e sensores óticos 30,31,32. Neste contexto, as nanopartículas metálicas vêm sendo muito exploradas para a aplicação em
SERS, por exibirem o chamado efeito de Ressonância de Plasmon de Superfície Localizado (LSPR).
2.2.1 Mecanismo Eletromagnético
A interação da radiação eletromagnética com nanopartículas metálicas foi descrita por Gustav Mie em 1908 33. A teoria de Mie apresenta uma solução para as equações de Maxwell, que descreve o espectro de extinção de partículas esféricas de tamanho arbitrário, sendo a extinção, a combinação dos fenômenos de espalhamento e absorção 34. A origem do mecanismo eletromagnético para a intensificação do espalhamento em SERS se dá pela interação da radiação incidente com a ressonância do plasmon de superfície da nanopartícula metálica, o que leva à intensificação do campo elétrico local. O termo plasmon foi introduzido na literatura científica em 1956 por David Pines, em um artigo de revisão no qual a seguinte definição foi dada 35:
“As oscilações coletivas dos elétrons de valência se assemelham muito às oscilações eletrônicas de plasma observadas em descargas gasosas. Nós introduzimos o termo ‘plasmon’ para descrever o quantum de excitação elementar associado a essa movimentação coletiva de alta frequência.”
Assim, o plasmon é definido como um quantum que representa os modos de excitação das oscilações da densidade de cargas em um plasma. O plasma, por definição, se refere à movimentação dos elétrons livres em um metal, em relação aos íons positivos fixos, podendo ser chamado, neste caso, de plasma de elétrons livres, ou plasma do estado sólido 12.
Quando a radiação incide sobre as nanopartículas metálicas muito menores que o comprimento de onda desta radiação, o campo elétrico oscilante interage com os elétrons livres de condução do metal e perturba a nuvem eletrônica, de modo que esta é deslocada dos núcleos positivos da rede metálica. A atração coulômbica entre elétrons e núcleos gera uma força restauradora, que promove a oscilação coerente da nuvem eletrônica 12,34. A Figura 3 ilustra a oscilação da nuvem eletrônica na partícula pela atuação do campo elétrico incidente. Essa oscilação
produz um momento de dipolo induzido, que promove a intensificação do campo elétrico na vizinhança da nanopartícula. O campo elétrico acentuado é experimentado por moléculas que eventualmente estejam próximas à sua superfície, e isso leva ao aumento da magnitude dos processos de espalhamento. Esse efeito confere às nanopartículas propriedades que são dependentes do material do qual elas são constituídas, seu tamanho, e geometria. Por ser um fenômeno de superfície, ou seja, que ocorre na interface entre o metal e o meio no qual a nanopartícula está inserida, ele depende ainda da constante dielétrica do meio 36,37.
Figura 3. Representação da oscilação da nuvem eletrônica em uma nanopartícula metálica esférica na presença de um campo elétrico incidente. Adaptado da Ref. 36.
As propriedades óticas dos materiais são caracterizadas pela sua função dielétrica ( ), que são números complexos dependentes do comprimento de onda da radiação incidente, possuindo uma componente real , e uma imaginária , como mostrado na Equação 7.
( )
( )
( )
(7)
A componente imaginária está associada à perda de energia devida à absorção pelo material, em parte relacionada com as transições eletrônicas na estrutura de bandas do metal. Já a parte real é relacionada com o armazenamento de energia pelo material, e consequente espalhamento de radiação, determinando assim a frequência de ressonância do plasmon para nanopartículas metálicas 14,38. A Figura 4 mostra os gráficos das componentes real e imaginária da função dielétrica
da prata e do ouro em função do comprimento de onda. Esses metais apresentam valores negativos para a componente real, e valores baixos e positivos para a componente imaginária na região do visível ao infravermelho próximo, o que permite seu uso para aplicações em plasmônica nessa faixa de comprimentos de onda.
Figura 4. Componentes real (Re[ ( )]) e imaginária (Im[ ( )]) da função dielétrica do ouro e da prata em função do comprimento de onda. Adaptado da Ref. 38.
A magnitude de intensificação do espalhamento Raman em sistemas contendo nanopartículas metálicas depende do campo elétrico local produzido pela ressonância do plasmon. Para determinar esse campo elétrico na parte externa da nanopartícula ( ), utilizam-se as equações de Maxwell aproximadas por equações de Laplace sob determinadas condições. Considera-se uma nanopartícula monometálica esférica, cujo tamanho seja bem menor que o comprimento da radiação incidente, definindo uma aproximação quase estática em que o campo elétrico incidente é considerado constante ao redor da partícula. O campo elétrico total na parte externa da esfera é dado pela Equação 8:
em que ⃗ é o vetor do campo elétrico incidente orientado na direção
é a polarizabilidade do metal, é a distância radial em relação à esfera, , e são as coordenadas cartesianas, e , e são os vetores unitários. O primeiro termo da equação é o campo elétrico incidente na nanopartícula, enquanto o segundo é referente ao campo induzido pelo momento de dipolo (Equação 2) na posição resultante do efeito de plasmon no metal. Considerando ainda que a partícula, de função dielétrica , está dispersa em um meio cuja constante dielétrica é , a solução da equação de Laplace mostra que a polarizabilidade é dada por:
(9)
em que é o raio da esfera, e é dado por:
( ) ( )
(10)
Combinando as Equações de 7 a 10, obtém-se:
⃗
⃗
⃗
(
)
[
( )]
(11)A partir da Equação 11, pode-se avaliar a dependência do campo elétrico produzido ao redor da nanopartícula com as propriedades do metal e do meio externo. Quando a parte real da função dielétrica do metal se aproxima do valor
( )= - , e o valor da componente imaginária é pequeno, a polarizabilidade, associada ao segundo termo da Equação 11, adquire valores altos, o que maximiza o valor do campo elétrico produzido pelo plasmon. Essa condição de ressonância é possível quando a parte real da função dielétrica assume valores negativos na região do visível e infravermelho próximo, e a parte imaginária apresenta valores pequenos, o que é de fato observado para os metais mostrados na Figura 4. Uma vez que a função dielétrica de determinado metal é dependente do comprimento de onda, sua componente real, em conjunto com a constante dielétrica do meio, é
responsável pela determinação do comprimento de onda em que o plasmon será observado 14,34,39,40.
Os metais Au 41, Ag 42, e menos frequentemente Cu 43, são os mais amplamente usados em experimentos SERS, uma vez que suas bandas de absorção do plasmon de superfície se encontram na região do visível e infravermelho próximo, onde geralmente se encontram os comprimentos de onda das linhas de laser mais utilizadas em equipamentos Raman. Como visto na Figura 4, a parte imaginária da função dielétrica do ouro, relativa às transições eletrônicas interbandas, ainda apresenta altos valores abaixo de aproximadamente 600 nm, região em que a prata apresenta grande vantagem em aplicações plasmônicas. Acima dessa região de comprimento de onda, contudo, a absorção do ouro se assemelha à da prata, o que favorece o seu uso devido à maior estabilidade química deste metal.
Na região próxima a 633 nm, comprimento de onda do laser de He-Ne, amplamente utilizado em espectroscopia Raman, a prata ainda apresenta certa vantagem em relação à eficiência na intensificação do campo elétrico comparada ao ouro. Contudo, nanopartículas de prata com morfologia controlada, monodispersidade e boa estabilidade são de difícil obtenção por metodologias de síntese química 44. Este problema pode ser contornado através da preparação de sistemas hierárquicos de nanopartículas, como as estruturas bimetálicas caroço-casca, em que uma nanopartícula de ouro com morfologia bem definida é recoberta com uma camada de prata. As nanopartículas caroço-casca exibem propriedades eletrônicas, óticas e catalíticas que podem ser diferentes das observadas para os componentes individuais, exibindo diversas aplicações 45. No caso de sistemas caroço-casca utilizando prata e ouro, as partículas obtidas podem incorporar a monodispersidade do ouro com as propriedades óticas da prata, fornecendo materiais promissores para a preparação de substratos SERS.
A avaliação das propriedades óticas das nanopartículas metálicas através da aproximação eletrostática descrita acima considera somente que a partícula é muito menor que a radiação incidente. Entretanto, para dimensões típicas até aproximadamente 100 nm, é observada a influência de efeitos de tamanho nas características das bandas de extinção atribuídas ao plasmon. O aumento no tamanho da nanopartícula faz com que as cargas fiquem mais afastadas durante a oscilação do dipolo, e com isso, a força restauradora que atua nessas cargas é
menor. Como consequência, a oscilação ocorre com uma frequência menor, e a banda atribuída ao plasmon dessa partícula será observada em maiores comprimentos de onda no espectro de extinção 46.
Outro fator que exerce influência na posição da banda plasmon e na intensidade do campo elétrico produzido na superfície da nanopartícula é a sua geometria. A geometria tem efeito no padrão de polarização da superfície e, portanto, define o comportamento da ressonância de plasmon. Em partículas anisotrópicas, surgem diferentes simetrias de polarização, e assim, um maior número de bandas pode ser observado no espectro de extinção em relação às partículas esféricas 47.
No caso de nanobastões, a ressonância de plasmon depende da orientação do campo elétrico incidente em relação à partícula, e dessa forma, as oscilações dipolares podem acontecer tanto no sentido transversal quanto no longitudinal em relação ao eixo do bastão 48. Isso faz com que, utilizando uma fonte de radiação não polarizada, duas bandas sejam observadas no seu espectro, uma atribuída à ressonância dipolar do plasmon na direção transversal, e outra, ao plasmon dipolar na direção longitudinal. A posição da banda longitudinal é dependente do comprimento do bastão, pois, novamente, surge o efeito da maior separação de cargas nessa direção em relação à direção transversal, o que faz com que a força restauradora seja menor, e consequentemente, a oscilação tenha menor frequência, sendo observada em maiores comprimentos de onda do que a ressonância de dipolo transversal 49,50.
Em geometrias que possuem extremidades pontiagudas, como as placas triangulares, pentágonos e cubos, quanto menor for a angulação dessas extremidades, maior será o acúmulo e a separação de cargas, e portanto, mais deslocadas estarão as bandas para menores valores de frequência. Além disso, cálculos mostram que, nessas pontas, o maior acúmulo de carga irá produzir a maior intensificação do campo elétrico local 47, consequentemente intensificando o espalhamento.
2.2.2 Mecanismo Químico
A contribuição do mecanismo químico para o efeito SERS pode ser entendida como uma modificação na polarizabilidade da molécula analisada, resultante da formação de um complexo entre essa molécula e a superfície metálica,
ou seja, admite-se que haja ligação química entre os dois componentes. Com isso, essa contribuição não se dá diretamente na intensificação do sinal Raman, mas sim na alteração da identidade e natureza da molécula 51.
A formação do complexo entre a molécula e o metal modifica a estrutura eletrônica das espécies envolvidas. Considera-se, como uma aproximação, que o nível de Fermi do metal esteja localizado entre os níveis ocupados de maior energia (HOMO), e os níveis não ocupados de menor energia (LUMO) da molécula, como representado no diagrama da Figura 5. Quando a radiação incidente está em ressonância com a transição eletrônica entre os níveis da molécula, ocorre o fenômeno de Raman ressonante, discutido anteriormente. Podem ocorrer ainda dois fenômenos de transferência de carga: a transição eletrônica entre o estado fundamental da molécula e o nível de Fermi do metal, ou então entre o nível de Fermi do metal e o estado excitado da molécula. Caso a radiação incidente seja ressonante com a energia necessária para que esses processos de transferência de carga ocorram, isso pode levar ao aumento substancial no tensor de polarizabilidade do complexo, intensificando o sinal SERS 10,14,52.
Figura 5. Representação dos processos fotoinduzidos de transição eletrônica entre os estados eletrônicos do metal e da molécula adsorvida quimicamente.
Com a adsorção química da molécula na superfície do metal, o espectro SERS pode mostrar características distintas em comparação à molécula livre, tanto com relação à posição, quanto à intensidade. Modos vibracionais que antes não eram ativos, ou eram pouco intensos, podem ser vistos intensificados e/ou deslocados.
2.3 Substratos SERS
Nanoestruturas metálicas empregadas na obtenção de espectros SERS podem ser utilizadas na forma de suspensões coloidais de nanopartículas; estruturas metálicas planares, tais como nanopartículas metálicas depositadas sobre uma superfície plana (como vidros, silício, metais, entre outros) na forma de filmes; e também em eletrodos metálicos.
Uma das formas de sintetizar nanopartículas é através dos processos top-down, em que estruturas grandes são sistematicamente reduzidas a componentes menores utilizando padrões ou moldes. As estruturas são obtidas de forma controlada por técnicas como litografia e fotolitografia, dando origem a substratos que têm sido apontados como promissores em SERS, em termos de resposta uniforme, reprodutibilidade e quantificação 53,54. Tais técnicas permitem a preparação de substratos metálicos com padrão pré-definido, com superfície uniforme e modulação do valor da banda plasmon de superfície, porém exigem o uso de equipamentos e técnicas sofisticadas de microfabricação, fazendo com que seu custo seja bastante elevado 55.
Outra forma de preparação envolve os processos conhecidos como bottom-up, que são definidos como sendo a preparação de sistemas maiores a partir de unidades menores, como átomos, moléculas, polímeros, ou até mesmo nanopartículas. A preparação das nanopartículas geralmente envolve processos de redução química ou biológica, com a formação de núcleos e sucessivo crescimento, o que permite bom controle de tamanho e morfologia sob condições específicas 56.
O uso das nanopartículas na preparação dos substratos é bastante explorado na literatura, sendo que diversas abordagens são utilizadas na sua imobilização em superfícies planas. No nosso grupo de pesquisa, placas de vidro funcionalizadas com APTMS, um alcoxissilano que contém um grupo amino terminal, foram utilizadas para realizar a deposição de nanopartículas de prata na obtenção
de substratos SERS 57,58,59. Para a imobilização de nanopartículas de ouro, trabalhos relataram o uso do MPTMS, alcoxissilano que contem o grupo tiol terminal 60,61,62.
O desenvolvimento de dispositivos para aplicação SERS requer como característica importante a geração de hot spots, regiões em que a curta distância (tipicamente 1 a 2 nm) entre duas ou mais nanoestruturas com banda plasmon promove o acoplamento dessa ressonância, o que leva a uma grande intensificação do campo elétrico local 55. Uma única molécula localizada na região do hot spot produz um sinal SERS de mesma intensidade de centenas a milhares de moléculas adsorvidas em regiões onde não há hot spot 63, o que permite alcançar o regime de detecção de uma molécula (SM-SERS – single molecule-surface enhanced Raman spectroscopy). A Figura 6 mostra a intensificação do campo eletromagnético em relação ao campo incidente (que incide na direção perpendicular ao eixo entre as duas partículas), calculado pelo método das diferenças finitas no domínio do tempo (FDTD – finite-difference time-domain), ao redor de duas nanopartículas de ouro com 100 nm de diâmetro e espaçamento de 0,5 nm. O hot spot é representado nas regiões amarelas, onde a intensificação do campo é máxima 64.
Figura 6. Intensificação do campo eletromagnético ao redor de um dímero de nanopartículas de Au de 100 nm de diâmetro, com espaçamento de 0,5 nm, calculada pelo método FDTD. A incidência da radiação é perpendicular ao eixo
Diversas estratégias são utilizadas para a geração de hot spots. Em suspensões coloidais, a agregação das nanopartículas pode ser feita por interações eletrostáticas, através da mudança na força iônica pela adição de sais; em substratos preparados por deposição, podem ser usados métodos físicos de auto-organização, em que um fluxo convectivo é aplicado durante a evaporação do solvente; métodos de preparação por litografia, ou então se pode induzir a agregação pela funcionalização da superfície de deposição ou pelo uso de agentes que se ligam à superfície das nanopartículas 64. Neste contexto, Brolo e colaboradores reportaram o uso da molécula propanoditiol (PDT) na imobilização e intercalação de camadas de nanopartículas de ouro depositadas 65,66, o que leva à sua agregação e consequente geração de hot spots.
Há um grande interesse no desenvolvimento de substratos com alta eficiência para aplicação em SERS, buscando maior aplicabilidade da técnica em diversas áreas, e a sua consolidação como uma ferramenta analítica. Do ponto de vista prático, um bom substrato SERS é aquele que apresenta uma intensificação uniforme e elevada do espalhamento Raman, com reprodutibilidade das medidas e baixo custo de preparação. Com relação à versatilidade de aplicação, diversos trabalhos têm relatado o uso de nanopartículas depositadas em papel, criando sistemas flexíveis com potencial de aplicação comercial em análises de rotina para sistemas químicos e biológicos 67,68. Dentre as vantagens desse tipo de substrato, está o baixo custo, a biodegradabilidade, a possibilidade de produção em larga escala, e a facilidade de transporte em grandes quantidades.
2.4 Poluentes Ambientais Emergentes
Poluentes ambientais emergentes são compostos químicos encontrados em matrizes ambientais e biológicas, que não são comumente monitorados no ambiente e ainda não são contemplados por legislações regulatórias de controle ambiental, mas que são ameaças potenciais à saúde humana e aos ecossistemas, mesmo em baixas concentrações. Esses compostos estão presentes em diversos produtos comerciais que são produzidos em larga escala, principalmente fármacos (antibióticos, anti-inflamatórios, antidepressivos, hormônios), pesticidas, produtos de higiene pessoal, aditivos industriais, além de drogas ilícitas 69,70.
Muitos desses compostos atingem os recursos hídricos através de rejeitos urbanos, quando a sua remoção nas estações de tratamento de esgoto não é eficiente, e também a partir dos efluentes industriais e da agricultura. Com o número crescente de poluentes encontrados em sistemas hídricos, surge a necessidade de se estudar a sua ocorrência, destino e impacto ecológico, além de criar programas de monitoramento para evitar danos ambientais e à saúde 71,72. Com isso, faz-se necessária a utilização de uma técnica analítica sensível, eficiente e versátil para sua detecção e monitoramento. Neste contexto, o desenvolvimento de substratos eficientes à base de nanopartículas metálicas pode permitir a utilização de SERS como técnica analítica de rotina. Além disso, a possibilidade do uso de equipamentos Raman portáteis permite que as análises sejam realizadas em campo.
2.4.1 Fármacos
As sulfonamidas são uma classe de agentes antibacterianos de amplo espectro de atuação que, em doses usuais, apresentam efeito bacteriostático, ou seja, impedem a multiplicação das células bacterianas, retardando o avanço da infecção. Embora a bactéria permaneça viva, a queda na taxa de divisão celular permite que o sistema imunológico do paciente seja capaz de combater a infecção. Em alguns casos, contudo, o tratamento é realizado utilizando altas doses desses fármacos, levando ao efeito bactericida, ou seja, à morte da bactéria. O efeito é baseado na inativação de enzimas envolvidas no processo de produção de ácido fólico das bactérias, o que interrompe a biossíntese de ácidos nucleicos, e consequentemente impede a divisão celular 73.
A Figura 7 mostra a estrutura molecular geral para as sulfonamidas empregadas como agentes antibacterianos. Variando o grupo funcional R ligado ao nitrogênio sulfonamídico, são obtidos compostos com diferentes propriedades físico-químicas e farmacológicas.
O sulfatiazol (4-amino-N-(2-tiazolil)benzenossulfonamida) é um agente antibacteriano comumente utilizado no tratamento de infecções respiratórias e urinárias, e vem sendo apontado como contaminante de ambientes aquáticos ao ser encontrado em resíduos hospitalares e de estações de tratamento de esgoto. A estrutura molecular do sulfatiazol está apresentada na Figura 8.
Figura 8. Estrutura molecular do fármaco sulfatiazol.
A detecção do sulfatiazol pela técnica de SERS foi relatada por Ratkaj e Miljanić 74
. Os autores utilizaram nanopartículas de Au, Ag e Cu em suspensão coloidal, obtendo espectros SERS para uma solução de concentração 9.10-6 mol L-1 (energia de excitação em 785 nm), e também em uma placa de Au, para uma solução 1.10-4 mol L-1 (excitação em 1064 nm).
2.4.2 Pesticidas
O Brasil é um dos maiores produtores e exportadores de produtos agrícolas do mundo. Entretanto, o uso indiscriminado de agroquímicos, tanto em relação à quantidade, quanto ao tipo de pesticida, pode oferecer risco aos trabalhadores rurais, à população em geral e ao meio ambiente 75. Um pesticida é uma substância, ou mistura de substâncias, cujas aplicações são prevenir, destruir, repelir ou reduzir efeitos de pestes que atingem culturas agrícolas. Essas pestes podem ser insetos, roedores, fungos, bactérias, ervas daninhas, ou quaisquer outros organismos nocivos 76.
Amplamente utilizados em todo o mundo como fungicidas, os ditiocarbamatos são agroquímicos organossulfurados utilizados em diversas culturas agrícolas. A ação fungicida destes compostos está relacionada à reação do grupo ditiocarbamato com enzimas das células dos fungos, ou então à sua complexação com metais presentes nessas enzimas, inibindo sua atividade 77.
O tiram (dissulfeto de tetrametilthiuram ou dissulfeto de bis-(dimetiltiocarbamoila)), cuja estrutura molecular está representada na Figura 9, é
um fungicida do grupo dos ditiocarbamatos, extensivamente utilizado como agente protetor de folhas e frutas contra uma grande variedade de doenças causadas por fungos. É também aplicado no tratamento de sementes, principalmente para culturas de milho, algodão, cereais, e vegetais ornamentais 78. Além disso, o tiram é utilizado na indústria de borracha como agente acelerador de vulcanização, e já foi empregado no tratamento de infecções em humanos, como a escabiose, e também como agente antibacteriano, aplicado direto à pele ou incorporado a sabões 79.
Figura 9. Estrutura molecular do fungicida tiram.
A toxicidade causada pela exposição ao tiram pode levar a danos aos olhos e pele, como dermatites de contato, além de problemas no fígado devidos à liberação de dissulfeto de carbono 80,81. Estudos mostraram que ele pode ainda apresentar efeitos mutagênicos 82 e induzir a formação de tumores 83. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o tiram é classificado como moderadamente nocivo à saúde humana 84.
Diversos trabalhos reportaram a detecção do tiram utilizando substratos SERS. Lv et al. 85, Zhang et al. 86, e Zhang et al. 87 detectaram o espectro do fungicida até a concentração de 1.10-7 mol L-1 empregando, respectivamente, asas de cigarra decoradas com nanopartículas de ouro, nanofios de prata depositados em substratos de vidro, e nanopartículas caroço-casca de Au e Ag intercaladas por uma folha de óxido de grafeno. Wang e colaboradores 88 atingiram o limite de detecção de 1.10-9 mol L-1, utilizando microesferas poliméricas recobertas com nanopartículas de prata como substrato.
Na classe dos inseticidas, os compostos em geral são neurotóxicos, atuando no sistema nervoso central dos organismos alvo e causando o envenenamento pela inibição de enzimas específicas. Devido a isso, a toxicidade
da maioria desses compostos não é seletiva, sendo uma ameaça a outras espécies, inclusive a humanos, e por serem lipossolúveis, são facilmente absorvidos pela pele 76. Dentre os inseticidas mais conhecidos, o paration (fosfotioato de O,O-dietil-O-(4-nitrofenila)) é um composto organofosforado utilizado principalmente em culturas de cereais, frutas, legumes, algodão e plantas ornamentais 89. Sua estrutura molecular está representada na Figura 10. Devido à sua alta toxicidade, ele já foi banido ou considerado de uso restrito em diversos países, tendo sido responsável por um grande número de casos de intoxicação em seres humanos 90. Além dos efeitos neurológicos associados ao contato com o paration, a exposição prolongada a este inseticida pode causar genotoxicidade e carcinogenicidade 91,92. Na classificação da OMS, o paration aparece como extremamente nocivo à saúde 84.
Figura 10. Estrutura molecular do inseticida paration
Espectros SERS do paration foram reportados por Han et al. 93 utilizando nanoesferas de sílica encapadas com prata, para as quais o limite de detecção de 1.10-7 mol L-1 foi atingido. Jiang et al. 94 reportaram espectros para a concentração de 1.10-9 mol L-1, empregando como substrato nanobastões de MnO2 decorados
3. OBJETIVOS
O objetivo principal do projeto foi desenvolver um substrato SERS eficiente na detecção de moléculas classificadas como poluentes ambientais, e que possam futuramente ser adaptados para o uso em análises de rotina. A base para a preparação dos substratos foi o uso de nanopartículas com propriedades plasmônicas, visando obter a máxima intensificação do espectro Raman de determinadas moléculas através do efeito SERS. Com isso, busca-se a detecção destas moléculas em soluções bastante diluídas, com a finalidade de, futuramente, empregar os substratos na análise de matrizes ambientais, como água de rios e lagos.
Para isso, foram estabelecidos como objetivos específicos do trabalho:
Sintetizar e caracterizar dois tipos de nanopartículas metálicas com morfologia e tamanho controlados: os nanobastões de ouro, e os nanobastões caroço-casca de ouro e prata;
Empregar as suspensões obtidas na preparação dos substratos através da sua deposição em placas de vidro funcionalizadas com alcoxissilanos.
Avaliar e comparar a eficiência dos substratos através da detecção da molécula sonda 4-aminobenzotiol (4-ABT) pela técnica de SERS.
Empregar o substrato de melhor desempenho, caracterizado pela eficiência em termos do limite de detecção, na análise das moléculas contaminantes selecionadas: o fármaco sulfatiazol, e os pesticidas tiram e paration.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Na Tabela 1, estão listados os reagentes utilizados no projeto, as respectivas marcas e purezas. Todos os reagentes foram utilizados como recebidos dos fornecedores, sem purificação adicional. Em todas as etapas, foi utilizada água deionizada (resistividade 18,2 MΩ cm a 25 ºC), e as vidrarias foram previamente lavadas com água régia (HCl:HNO3 na proporção 3:1).
Tabela 1. Lista de reagentes utilizados no trabalho.
Reagente Marca Pureza (%)
Nome Fórmula química
Ácido clorídrico HCl Synth ≥ 37a
Ácido nítrico HNO3 Synth 65
Brometo de cetiltrimetilamônio C19H42BrN Aldrich ≥ 99
Ácido tetracloroáurico HAuCl4 Aldrich ≥ 49b
Boroidreto de sódio NaBH4 Aldrich 99,99
Nitrato de prata AgNO3 Aldrich ≥ 99
Hidróxido de sódio NaOH Synth 97
Peróxido de hidrogênio H2O2 Synth 29c
Polivinilpirrolidona (PVP - 55000) (C6H9NO)n Aldrich ―
Ácido ascórbico C6H8O6 Aldrich ≥ 99,7
Ácido sulfúrico H2SO4 Synth 98
(3-aminopropil)-trimetoxissilano C6H17NO3Si Acros 95
(3-mercaptopropil)-trimetoxissilano C6H16O3SiS ABCR 97
1,3-Propanoditiol C3H8S2 Aldrich 99 Etanol C2H5OH Synth 99,5 4-aminobenzotiol C6H7SN Aldrich 97 Sulfatiazol C9H9N3O2S2 Fluka 99,9 Tiram C6H12N2S4 Fluka 99,9 Paration C10H14NO5PS Fluka 99,7 a
