UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
GIORGIO ANTONIOLLI
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DE CHALCONAS E
DERIVADOS COM EFEITO INIBITÓRIO SOBRE ACETILCOLINESTERASE E β-SECRETASE (BACE-1)
CAMPINAS 2018
GIORGIO ANTONIOLLI
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DE CHALCONAS E
DERIVADOS COM EFEITO INIBITÓRIO SOBRE ACETILCOLINESTERASE E β-SECRETASE (BACE-1)
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Química na área de Química Orgânica
Orientadora: Profa. Dra. Wanda Pereira Almeida
O ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO GIORGIO ANTONIOLLI, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. WANDA PEREIRA ALMEIDA.
CAMPINAS 2018
DEDICATÓRIA
Dedico meu trabalho aos meus pais Salete e Carlos, pelo amor e apoio incondicional recebido em todos desafios encontrados na minha vida.
Para todos meus professores, sinceros agradecimentos por todos ensinamentos.
“Na natureza nada se cria, nada se perde, tudo se transforma.” Antoine Lavoisier
AGRADECIMENTOS
A Deus e ao Meu anjo da guarda, meu irmão Gian, que são meus guias, meus protetores e fortalecedores.
Aos meus pais, Salete e Carlos, pelo amor infinito, pela minha educação inicial e pelo apoio que me deram e dão em todos os meus projetos e desejos de vida. Sou muito grato por tudo o que me proporcionam.
A minha orientadora, Wanda Pereira Almeida, pela oportunidade de me aceitar no seu grupo de pesquisa, no Laboratório de Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, num momento difícil de minha vida. Obrigado por todos os ensinamentos e os conselhos e, principalmente, pelo apoio durante essa longa trajetória.
Ao meu pai da Química Orgânica, como sempre digo, o professor José Luiz Piazza, que me ensinou, me apoiou e me orientou em diversos momentos da graduação e pós-graduação.
A todos os professores dos cursos de Química e Ciências Biológicas da Universidade de Caxias do Sul, UCS, que fizeram com que chegasse até o momento em que me encontro agora, mas, principalmente, as professoras e amigas Anna Celia Silva Arruda, Adriana del Carmen Escalona Gower, Ana Maria Coulon Grisa.
Aos amigos e colegas que conheci e sempre compartilho bons momentos: Matias Costa, Renata Parruka, Gisele, Ana Beatriz, Renata Sigrist, Anna Carolina, Bruno, Douglas, Fernanda, Gabriela, Rafael e professora Luciana Gonzaga.
As funcionárias da CPG, Janaína, Izabel e Isabela por toda a ajuda durante o curso. Ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas por fornecer um ambiente com uma ótima infraestrutura.
RESUMO
Chalconas são sistemas constituídos de duas sub-unidades aromáticas ligadas por um sistema carbonílico ,β-insaturado. Esse arranjo estrutural tem possibilitado explorar a sua utilização, em reações de adição conjugada e reduções, como intermediários sintéticos. Além disso, a possibilidade de variação nos substituintes dos anéis aromáticos, tem proporcionado o estudo de série de compostos frente a marcadores biológicos para uma série de patologias, o que é bastante importante em estudos de relações estrutura-atividade. Em nosso laboratório, as chalconas vem sendo utilizadas tanto como intermediários sintéticos, quanto em estudos para avaliar o seu efeito sobre marcadores da doença de Alzheimer, tais como acetilcolinesterase, β-secretase, além da atividade antioxidante. Apesar de suas propriedades serem relevantes, poucos estudos sobre a sua citotoxicidade têm sido descritos. Neste trabalho, realizamos a síntese e caracterização de cinco aminochalconas e sete derivados, para o estudo da sua atividade frente a esses marcadores e do seu efeito a proliferação de células de tumorais e não-tumorais. As chalconas, sendo três delas inéditas, foram sintetizadas em bons rendimentos pela condensação de Claisen-Schmidt (62 a 100%). Os derivados planejados são estruturalmente funcionalizações do grupo amino ligado ao anel aromático, mantendo uma sub-unidade do tipo glicinato. Da série dos aminoésteres, apenas um foi obtido em grau de pureza suficiente para a análise biológica. O aminoéster apresentou atividade comparável à aminochalcona precursora, que foi obtida a partir do 4-clorobenzaldeído. Em relação à citotoxicidade, o estudo utilizando as linhagens celulares Vero (rim de macaco), 3T3 (fibroblasto de camundongo) e M059J (glia), foi realizado pela metodologia MTT. Observou-se que as 2’-aminochalconas apresentavam toxicidade, porém os valores de IC50 foram bem superiores às concentrações efetivas para
inibição enzimática, caracterizando assim um bom índice de seletividade. A interação das chalconas com a glutationa por espectrometria de massas e o estudo in silico das propriedades farmacocinéticas também foram realizados. Somente as chalconas sem o grupo amino formaram adutos, indicando à baixa reatividade da ligação dupla com a glutationa. Em relação ao perfil farmacocinético, a propriedade que aparentemente pode ser problemática é a hidrossolubilidade.
ABSTRACT
Chalcones are systems composed of two aromatic subunits linked by a ,β-unsaturated carbonyl system. This structural arrangement has allowed exploring its use in conjugate addition reactions and in reductions, as synthetic intermediates. Besides that, the possibility of varying the substituents of the aromatic rings has allowed the study of series of compounds against biological markers for a series of pathologies, which is highly important in studies of structure-activity relations. In our laboratory, chalcones have been used both as synthetic intermediates and in studies to evaluate their effect on Alzheimer's disease markers, such as acetylcholinesterase, β-secretase, and antioxidant activity. Although their properties are relevant, few studies on their cytotoxicity have been described. In this work, we performed the synthesis and characterization of five aminochalcones and seven derivatives to study their activity against these markers and their effect on the proliferation of tumor and non-tumor cells. The chalcones, three of them novel, were synthesized in good yields using the Claisen-Schmidt condensation (62 to 100%). The derivatives that were planned are structural functionalizations of the amino group in the aromatic ring, maintaining a sub-unit of the glycinate type. Among the compounds of the amino acid series, only one was obtained in sufficient purity for biological analysis. The aminoester exhibited activity comparable to the precursor aminochalcone, which was obtained from 4-chlorobenzaldehyde. For the cytotoxicity evaluation, the study using the Vero (monkey kidney), 3T3 (mouse fibroblast) and M059J (glia) cell lines was performed using the MTT methodology. It was observed that the 2'-aminochalcones exhibited toxicity, but the IC50 values were well above the effective concentrations for enzymatic inhibition, thus
characterizing a good selectivity index. The interaction of chalcones with glutathione by mass spectrometry and the in silico study of the pharmacokinetic properties were also performed. Only chalcones without the amino group formed adducts, indicating the low reactivity of the double bond with glutathione. Regarding the pharmacokinetic profile, the property that apparently can be problematic is the water solubility.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Aumento significativo do número de casos de demência comparado entre países de
baixa e média renda com países de alta renda [7] ... 22
Figura 2. Principais marcadores neuropatológicos da DA ... 24 Figura 3. Hidrólise da acetilcolina catalisada pela enzima acetilcolinesterase ... 25 Figura 4. Características do envelhecimento não patológico e da doença de Alzheimer baseado
na resposta inflamatória e neurodegeneração ... 27
Figura 5. Estruturas dos compostos em fase clínica para tratamento da DA ... 27 Figura 6. Diferenciação de células nervosas com a DA e saudáveis. Destaque para os círculos
verdes que representam as placas e a indicação da seta mostra células nervosas mortas e prestes a morrer. ©2018 Alzheimer's Association. www.alz.org. All rights reserved. Illustrations by Stacy Jannis ... 29
Figura 7. Representação das placas. Destacando que o círculo vermelho representa o Aβ que
quando unidas formam as placas, mostrada pelo círculo verde; as formas mais nocivas de Aβ talvez sejam os grupos de pequenos pedaços (círculo azul) do que as placas em si, onde tais agrupamentos podem bloquear a sinalização entre células nas sinapses. ©2018 Alzheimer's Association. www.alz.org. All rights reserved. Illustrations by Stacy Jannis ... 30
Figura 8. Comparação de dois cortes transversais de cérebros mostrando a diminuição
(encolhimento) cerebral. ©2018 Alzheimer's Association. www.alz.org. All rights reserved. Illustrations by Stacy Jannis ... 31
Figura 9. Processamento da proteína precursora do amiloide (Adaptado de Kuruva e Reddy)
[68] ... 32
Figura 10. Medicamentos disponíveis usados no tratamento da doença de Alzheimer ... 33 Figura 11. Estrutura dos compostos abordados para a hipótese da proteína tau para tratamento
da DA ... 34
Figura 12. Marcadores neuropatológicos da DA e suas respectivas abordagens para
desenvolvimento de novos fármacos [74] ... 34
Figura 13. Alguns medicamentos que sofreram descontinuação nos últimos 11 anos com
variados efeitos adversos ou falta de eficácia terapêutica ... 35
Figura 14. Estrutura geral de uma chalcona ... 36 Figura 15. Estrutura geral de uma chalcona mostrando a disposição dos quinze carbonos ... 36
Figura 16. Biossíntese de chalconas, precursoras dos flavonoides (Adaptado de Dewick) [82]
... 37
Figura 17. Estruturas de algumas chalconas com importância para agricultura e proteção
vegetal (Adaptado de Diáz-Tielas e colaboradores) [79] ... 38
Figura 18. Estrutura geral de chalconas substituídas pelo grupo di-hidrotriazina, com
espaçadores de diferentes tamanhos (Adaptado de Hui-Li Ng e colaboradores) [91] ... 39
Figura 19. Chalconas com atividade antiproliferativa sobre linhagens tumorais humanas. A:
MCF-7 e TK-10; B: HL60 e Jurkat ... 39
Figura 20. (A) Possibilidade de sofrer diversos tipos de reações e seus respectivos centros
reativos; (B) Variação estrutural nos anéis aromáticos para obtenção de séries de compostos ... ..40
Figura 21. Síntese de chalconas baseada na reação de condensação de Claisen-Schmidt ... 40 Figura 22. Estrutura da aminochalcona com atividade citotóxica para diversos tipos de
linhagens cancerígenas humanas ... 41
Figura 23. 2’-aminochalconas que apresentam atividade antioxidante ... 41 Figura 24. 3-Aminochalcona com potente ação contra diferentes linhagens celulares de câncer
humano ... 42
Figura 25. Derivado de chalcona-rivastigmina com boas avaliações biológicas e com
toxicidade insignificante ... 44
Figura 26. Formação do nitrênio em meio ácido, após bioativação pela acetiltransferase (E1) ... 44
Figura 27. Reação de obtenção das 2’-aminochalconas 1 a 5 ... 49 Figura 28. Proposta mecanística para síntese de 2’-aminochalconas ... 50 Figura 29. Espectro no Infravermelho representativo de uma 2’-aminochalcona (1), destacando
as absorções características ... 51
Figura 30. Estruturas de ressonância referente ao sistema conjugado carbonílico de uma
chalcona, indicando os deslocamentos dos hidrogênios vinílicos ... 51
Figura 31. Espectro de RMN de 1H exemplificando os sinais característicos dos hidrogênios
vinílicos de uma 2’-aminochalcona (1) ... 52
Figura 32. Reação de obtenção das α-cloroamidas 6 a 10 ... 53 Figura 33. Mecanismo da substituição em carbono acila para formação dos derivados amídicos
... 54
Figura 34. Espectro no Infravermelho representativo de uma α-cloro-acetamida (6), destacando
Figura 35. Espectro de RMN de 1H exemplificando os sinais característicos α-cloro-acetamida 6 sintetizada ... 55 Figura 36. Metodologias empregadas para a conversão das α-cloroamidas em aminas (a:
ftalimida, KOH e [bmin]BF4; b: NH4OH e AcOEt; c: glicina, EDC, HOBt e CH2Cl2) ... 54 Figura 37. Reação proposta baseada na síntese de Gabriel ... 56 Figura 38. Mecanismo da primeira etapa da síntese de Gabriel ... 57 Figura 39. Reação proposta baseada na substituição nucleofílica usando hidróxido de amônio
... 57
Figura 40. Reação proposta baseada no acoplamento usando glicina para conversão de amina
em amida ... 58
Figura 41. Mecanismo da reação de acoplamento usando glicina para conversão de amina em
amida ... 59
Figura 42. Reação de obtenção dos aminoésteres de 16 a 20 ... 59 Figura 43. Mecanismo de substituição nucleofílica bimolecular para formação dos
aminoésteres ... 60
Figura 44. Espectro no infravermelho representativo de um aminoéster (17), onde R = 4-Cl,
destacando as absorções características ... 61
Figura 45. Espectro de RMN de 1H exemplificando os sinais característicos do aminoéster 17 sintetizado ... 62
Figura 46. Cromatoplaca da reação da chalcona 5 com alfa-bromoacetato de metila. À
esquerda: chalcona 5, e à direita, mistura reacional. Sistema eluente: AcOEt-Hex 15%, eluição repetida 3 vezes ... 63
Figura 47. Cromatograma do bruto de reação de formação do aminoéster da chalcona 5 ... 63 Figura 48. Espectro de massas da reação, indicando as espécies de razão massa/carga
correspondentes à 2’-aminochalcona 5 (m/z 268,0956) e ao aminoéster (m/z 340,1193), protonados ... 64
Figura 49. Estrutura do tripeptídeo glutationa ... 64 Figura 50. Esquema do ciclo catalítico da glutationa (Adaptado de Almeida, Huber e de
Fatima) [128] ... 65
Figura 51. Fármacos ácido etacrínico e paracetamol com seus respectivos conjugados com a
glutationa ... 66
Figura 52. Formação do aduto de Michael entre GSH e chalconas ... 67 Figura 53. Estruturas de ressonância para uma chalcona não substituída (A) e para uma
Figura 54. Diagrama mostrando as diferenças de energia entre os orbitais moleculares HOMO
do nucleófilo e LUMO de dois eletrófilos (A e B). Destaque para a diferença de energia entre
os orbitais do composto A e do B . ... 70
Figura 55. Orbitais moleculares desocupados de menor energia (LUMO) da chalcona 5 ... 70
Figura 56. Constituição da barreira hematoencefálica [144] ... 75
Figura 57. Reação do MTT com a enzima mitocondrial redutase [146] ... 79
Figura 58. Fotografia da microplaca na qual foram incubados os compostos estudados em células Vero. Os poços cujo meio é mais escuro, correspondem aos que tem a maior quantidade de células viáveis ... 79
Figura 59. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da aminochalcona 1 ... 110
Figura 60. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da aminochalcona 1 ... 111
Figura 61. Espectro de IV (ATR, υmax, cm-1) da aminochalcona 1 ... 112
Figura 62. Espectro de massas de alta resolução (Q-TOF - ESI MS) da aminochalcona 1 .. 113
Figura 63. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) da aminochalcona 2 ... 114
Figura 64. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 125 MHz) da aminochalcona 2 ... 115
Figura 65. Espectro de IV (ATR, υmax, cm-1) da aminochalcona 2 ... 116
Figura 66. Espectro de massas de alta resolução (Q- TOF - ESI MS) da aminochalcona 2 . 117 Figura 67. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da aminochalcona 3 ... 118
Figura 68. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da aminochalcona 3 ... 119
Figura 69. Espectro de IV (ATR, υmax, cm-1) da aminochalcona 3 ... 120
Figura 70. Espectro de massas de alta resolução (Q- TOF - ESI MS) da aminochalcona 3 . 121 Figura 71. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da aminochalcona 4 ... 122
Figura 72. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da aminochalcona 4 ... 123
Figura 73. Espectro de IV (ATR, υmax, cm-1) da aminochalcona 4 ... 124
Figura 74. Espectro de massas de alta resolução (Q- TOF - ESI MS) da aminochalcona 4 125 Figura 75. Espectro de RMN 1H (CDCl 3, 500 MHz) da aminochalcona 5 ... 126
Figura 76. Espectro de RMN 13C (CDCl 3, 125 MHz) da aminochalcona 5 ... 127
Figura 77. Espectro de IV (ATR, υmax, cm-1) da aminochalcona 5 ... 128
Figura 78. Espectro de massas de alta resolução (Q- TOF - ESI MS) da aminochalcona 5 129 Figura 79. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da α-cloroamida 6 ... 130
Figura 80. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da α-cloroamida 6 ... 131
Figura 81. Espectro de IV (ATR, υmax, cm-1) da α-cloroamida 6 ... 132
Figura 82. Espectro de massas de alta resolução (Q- TOF - ESI MS) da α-cloroamida 6 ... 133
Figura 84. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 125 MHz) da α-cloroamida 7 ... 135 Figura 85. Espectro de IV (ATR, υmax, cm-1) da α-cloroamida 7 ... 136
Figura 86. Espectro de massas de alta resolução (Q- TOF - ESI MS) da α-cloroamida 7 ... 137 Figura 87. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da α-cloroamida 8 ... 138 Figura 88. Espectro de RMN 13C (CDCl
3, 100 MHz) da α-cloroamida 8 ... 139 Figura 89. Espectro de IV (ATR, υmax, cm-1) da α-cloroamida 8 ... 140
Figura 90. Espectro de massas de alta resolução (Q- TOF - ESI MS) da α-cloroamida 8 ... 141 Figura 91. Espectro de RMN 1H (CDCl
3, 500 MHz) da α-cloroamida 9 ... 142 Figura 92. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 125 MHz) da α-cloroamida 9 ... 143 Figura 93. Espectro de IV (ATR, υmax, cm-1) da α-cloroamida 9 ... 144
Figura 94. Espectro de massas de alta resolução (Q- TOF - ESI MS) da α-cloroamida 9 ... 145 Figura 95. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) da α-cloroamida 10 ... 146 Figura 96. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 125 MHz) da α-cloroamida 10 ... 147 Figura 97. Espectro de IV (ATR, υmax, cm-1) da α-cloroamida 10 ... 148
Figura 98. Espectro de massas de alta resolução (Q- TOF - ESI MS) da α-cloroamida 10 . 149 Figura 99. Espectro de RMN 1H (DMSO, 500 MHz) do aminoéster 17 ... 150
Figura 100. Espectro de RMN 13C (DMSO, 125 MHz) do aminoéster 17 ... 151
Figura 101. Espectro de IV (ATR, υmax, cm-1) do aminoéster 17 ... 152
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Rendimentos químicos na obtenção das 2’aminochalconas 1 a 5 ... 49
Tabela 2. Rendimentos químicos para a obtenção das α-cloroacetamidas 6 a 10 ... 53
Tabela 3. Rendimentos químicos da obtenção dos aminoésteres 16-20 ... 60
Tabela 4. Resultado da reação de adição de Michael entre chalconas e glutationa ... 68
Tabela 5. Energia do orbitais LUMO para chalconas submetidas à reação de adição de Michael com a glutationa ... 71
Tabela 6. Parâmetros farmacocinéticos calculados para as aminochalconas e derivados ... 76
Tabela 7. Resultado da avaliação do efeito dos compostos sintetizados sobre a proliferação de linhagens celulares, expresso em IC50 (µM) ... 80
Tabela 8. Valores de inibição da AChE pelos compostos de estudo e índice de seletividade em relação ao efeito antiproliferativo de linhagens celulares M059J, Vero e 3T3 ... 81
Tabela 9. Resultados do docking molecular entre os compostos estudados e a AChE ... 83
Tabela 10. Resultados do docking molecular entre os compostos estudados e a BACE-1 (*) ... 84
LISTA DE ABREVIAÇÕES
3T3 Fibroblasto de camundongo
Aβ Peptídeo β-amiloide
AChE Acetilcolinesterase
AcOEt Acetato de etila
ADME Fase farmacocinética
AICD Domínio intracelular da proteína precursora amiloide
Asp Asparagina
BACE-1 β-secretase
BHE Barreira hematoencefálica
Caco-2 Células de epitélio
CCD Cromatografia em coluna delgada
CG-MS Cromatografia gasosa com espectrômetro de massa
ChAT Colinacetiltransferase
CH2Cl2 Diclorometano
DA Doença de Alzheimer
DAIP Doença de Alzheimer de início precoce
DAIT Doença de Alzheimer de início tardio
EDC 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
ESI MS Espectrometria de massas de alta resolução
GSH Glutationa GSSH Dissulfeto oxidada GST Glutationa transferase GPx Glutationa peroxidase Hex Hexano HOBt 1-Hidroxibenzotriazol
HOMO Highest occupied molecular orbital – Orbital ocupado de maior energia
IC50 Concentração inibitória mínima letal para 50% das células IV Espectroscopia no Infravermelho
J Constante de acoplamento
LC-MS Cromatografia líquida com espectrômetro de massa
M059J Células tumorais gliais humanas
MeCN Acetonitrila
MeOH Metanol
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio
PKS Policetídeo sintase
PPA Proteína precursora amiloide
RF Fator de retenção
RMN Ressonância magnética nuclear
SNC Sistema nervoso central
THF Tetraidrofurano
TNF-α Fator de necrose tumoral-α
Trp Triptofano
Tyr Tirosina
UV-vis Espectroscopia no ultravioleta
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 21 1.1 Doença de Alzheimer ... 21 1.1.1 Aspectos gerais ... 21 1.1.2 Marcadores neuropatológicos ... 23 1.1.2.1 Déficit colinérgico ... 24 1.1.2.2 Neuroinflamação ... 25
1.1.2.3 Emaranhados neurofibrilares e proteína tau ... 27
1.1.2.4 Peptídeo β-amiloide ... 29
1.1.3 Tratamento da doença de Alzheimer ... 33
1.1.3.1 Fármacos disponíveis e desenvolvimento de novos candidatos a fármacos .. 33
1.1.3.2 Tratamento não-medicamentoso da doença de Alzheimer ... 35
1.2 Chalconas ... 36
1.2.1 Estrutura geral e biossíntese ... 36
1.2.2 Atividades biológicas ... 37 1.2.3 Síntese ... 40 1.2.4 Aminochalconas ... 41 1.3 Toxicidade ... 42 2 OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS ... 45 2.1 Precedentes ... 45 2.2 Objetivos específicos ... 45 3 METODOLOGIA ... 46
3.1 Obtenção das chalconas e derivados ... 46
3.2 Avaliação da citotoxicidade pelo método MTT [110] ... 46
3.3 Propriedades farmacocinéticas in silico ... 46
3.5 Avaliação da atividade anticolinesterásica ... 47
3.6 Cálculo das energias dos orbitais moleculares de fronteira ... 48
3.7 Estudo de docking molecular ... 48
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 49
4.1 Síntese das 2’-aminochalconas ... 49
4.2 Preparação dos derivados amídicos (derivados da série III) ... 52
4.3 Tentativas de obtenção das aminas 11-15 (derivados da série III) ... 55
4.3.1 Síntese de Gabriel ... 56
4.3.2 Substituição nucleofílica usando hidróxido de amônio ... 57
4.3.3 Acoplamento para conversão de amina para amida usando glicina ... 58
4.4 Obtenção dos aminoésteres 16-20 (derivados da série II) ... 59
4.5 Reação das chalconas com glutationa ... 64
4.6 Energias dos orbitais moleculares de fronteira ... 69
4.7 Estudo in silico das propriedades farmacocinéticas ... 72
4.7.1 Hidrossolubilidade ... 72
4.7.2 Ligação à albumina ... 73
4.7.3 Estabilidade metabólica ... 73
4.7.4 Permeabilidade ... 73
4.7.5 Permeabilidade na barreira hematoencefálica ... 74
4.8 Avaliação da citotoxicidade das aminochalconas, aminoéster e amidas cloradas . 78 4.9 Avaliação da atividade anticolinesterásica e seletividade ... 81
4.10 Estudos de docking molecular ... 82
4.10.1 Estudos de docking molecular dos compostos com a acetilcolineserase ... 82
4.10.2 Estudos de docking molecular dos compostos com a β-secretase ... 83
5 CONCLUSÕES ... 85
6 EXPERIMENTAL ... 87
6.2 Obtenção de 2’-aminochalconas ... 88
6.2.1 Método geral de síntese ... 88
6.2.2 Caracterização dos compostos sintetizados ... 88
6.2.2.1 (2E)-1-(2-aminofenil)-3-(3-clorofenil)-prop-2-en-1-ona (1) ... 88
6.2.2.2 (2E)-1-(2-aminofenil)-3-(4-clorofenil)-prop-2-en-1-ona (2) ... 89
6.2.2.3 (2E)-1-(2-aminofenil)-3-(2,3-diclorofenil)-prop-2-en-1-ona (3) ... 89
6.2.2.4 (2E)-1-(2-aminofenil)-3-[(4-metiltio)fenil]-prop-2-en-1-ona (4) ... 90
6.2.2.5 (2E)-1-(2-aminofenil)-3-(2H-1,3-benzodioxol-5-il)-prop-2-en-1-ona (5) ... 90
6.3 Obtenção de α-cloro acetamidas ... 91
6.3.1 Método geral de síntese ... 91
6.3.2 Caracterização dos compostos sintetizados ... 91
6.3.2.1 2-cloro-N-{2-[(2E)-3-(3-clorofenil)-prop-2-enoil]-fenil}acetamida (6) ... 91 6.3.2.2 2-cloro-N-{2-[(2E)-3-(4-clorofenil)-prop-2-enoil]-fenil}acetamida (7) ... 92 6.3.2.3 2-cloro-N-{2-[(2E)-3-(2,3-diclorofenil)-prop-2-enoil]-fenil}acetamida (8) ... 93 6.3.2.4 2-cloro-N-{2-[(2E)-3-((4-metiltio)fenil)-prop-2-enoil]-fenil}acetamida (9) ... 93 6.3.2.5 2-cloro-N-{2-[(2E)-3-(2H-1,3-benzodioxol-5il)-prop-2-enoil fenil}acetamida (10) ... 94
6.4 Obtenção de α-amino éster ... 94
6.4.1 Método geral de síntese ... 94
6.4.2 Caracterização do composto sintetizado ... 95
6.4.2.1 {2-[(2E)-3-(4-clorofenil)prop-2-enoil]anilino}acetato de metila (17) ... 95
7 REFERÊNCIAS ... 96
1 INTRODUÇÃO 1.1 Doença de Alzheimer 1.1.1 Aspectos gerais
Doenças neurodegenerativas são um problema enigmático e intratável em biomedicina. A doença de Alzheimer (DA) é o exemplo mais comum de doença neurodegenerativa, afetando cerca de 10% dos indivíduos com idade acima dos 65 anos e cerca de 40% dos indivíduos acima de 80 anos [1]. Clinicamente, a DA é detectada por deficiência na memória recente, seguida por outras disfunções relacionadas a processo de linguagem, aprendizado e concentração. Embora a perda de memória recente seja um dos primeiros sintomas detectados, estudos mostram que o processo fisiopatológico se inicia antes de surgirem os primeiros sintomas clínicos [2]. Ainda não há cura para a DA e, devido a uma alta prevalência e incidência continuamente crescente, representa uma grande ameaça à saúde pessoal e ao sistema de saúde. As alterações neuropatológicas no cérebro incluem atrofia progressiva do hipocampo e do córtex, visíveis em exames de imagens [3].
A doença foi descrita pela primeira vez por Alois Alzheimer em 1906, na Alemanha. Hoje em dia, é considerada uma síndrome crônica ou progressiva, caracterizada pela capacidade cognitiva prejudicada além do que poderia ser considerado como uma consequência do envelhecimento natural [4]. A DA é geralmente considerada como um subtipo de demência mais comum, representando entre 60 e 80% dos casos de demência. A prevalência da DA aumenta exponencialmente com a idade, aumentando de 3% entre os 65-74 anos para quase 50% entre aqueles com 85 anos ou mais [5].
Atualmente, 47 milhões de pessoas vivem com demência em todo mundo. Este número deve aumentar para mais de 131 milhões até 2050 [6]. Estima-se mais de 9,9 milhões de novos casos de demência a cada ano em todo o mundo, implicando num novo caso a cada 3,2 segundos [7]. O envelhecimento da população está ocorrendo em todo mundo e essas mudanças não afetam todas as pessoas igualmente. Por exemplo, condições de saúde que são fatores de risco para demência estão aumentando (diabetes) e caindo (acidente vascular cerebral) em países de alta renda [8]. O processo de envelhecimento resulta em mudanças marcantes na estrutura e função do cérebro. O declínio cognitivo e um aumento no risco de doenças neurodegenerativas são uma das principais fontes da carga causada pelo envelhecimento [9]. Algumas das causas são estresse oxidativo, glicação, encurtamento de telômeros, reações colaterais, mutações,
agregação de proteínas, dentre outros [10]. Na Figura 1 podemos observar o aumento do número de casos de pessoas com demência, variando entre os anos 2015 e 2050. O maior crescimento será em países em desenvolvimento.
Figura 1. Aumento significativo do número de casos de demência comparado entre países de baixa e média renda
com países de alta renda [7].
Os sintomas variam entre pessoas com a DA, e as diferenças baseiam-se nas alterações cognitivas típicas relacionadas à idade, sendo os sinais precoces da DA normalmente sutis. Dentre os principais sintomas destacamos perda de memória, que perturba a vida diária, desafios no planejamento de atividades ou solução de problemas, dificuldade em completar tarefas familiares em casa, no trabalho ou no lazer, confusão com o tempo ou lugar, problemas para entender imagens visuais e relações espaciais, problemas com linguagem escrita ou falada; perda de objetos e dificuldade para refazer os passos, na tentativa de encontrá-los, julgamento reduzido ou insatisfatório, retirada do trabalho ou atividades sociais e mudanças de humor e personalidade [11].
O maior fator de risco da DA é o avanço da idade, seguido de histórico familiar. Outros fatores de risco são traumatismo craniano, gênero, depressão, diabetes, hiperlipidemia e fatores vasculares [12].
A DA está dividida em DA de início precoce (DAIP), com manifestação antes dos 60 anos e rápido curso clínico, mostrando recorrência familiar, e DA de início tardio (DAIT), na qual os sintomas clínicos podem ser observados após os 60 anos e com duração que pode superar os dez anos, ocorrendo de forma esporádica [13,14].
Referente ao diagnóstico da doença, na ausência de biomarcadores confiáveis, o exame patológico direto do tecido cerebral derivado de biópsia ou autópsia permanece como único método definitivo para o estabelecimento do diagnóstico da DA [15]. Atualmente, não existem ferramentas diagnósticas ou meios disponíveis para diagnosticar pacientes em fase inicial da DA [16].
A principal característica da DA é o declínio da capacidade cognitiva, incluindo o aprendizado, memória e capacidade de resolução de problemas. Com o avanço da doença, delírios, depressão, agitação e agressividade podem ocorrer [17]. Embora a etiologia da DA não seja clara, vários fatores têm sido associados a esta patologia, tais como: a deposição extracelular de oligômeros e fibrilas do peptídeo β-amiloide (Aβ) [18]; a hiper-fosforilação da proteína [19], seguida de fragmentação e formação de emaranhados neurofibrilares intracelulares; falha na homeostase de metais, principalmente cobre e zinco, levando ao acúmulo dos mesmos no sistema nervoso central [20]; estresse oxidativo e ainda um importante déficit colinérgico. Esta característica multifatorial da doença de Alzheimer resulta na existência de vários alvos para a avaliação de compostos bioativos.
1.1.2 Marcadores neuropatológicos
A doença de Alzheimer tem vários marcadores bioquímicos (Figura 2) e um dos mais estudados é o déficit colinérgico. Em função disso, inibidores de acetilcolinesterase (AChE) são alvo de estudos, uma vez que prolongam a ação da acetilcolina, pelo bloqueio da enzima responsável pela sua hidrólise e consequente término de ação. Atualmente, estes inibidores, tais como galantamina e donepezila são os principais fármacos comercializados para tratar a DA. Entretanto, a resposta entre os pacientes é muito heterogênea e agravada pelo diagnóstico tardio. Assim, a busca por novos agentes anticolinesterásicos continua sendo objeto de pesquisa por vários grupos no mundo inteiro.
Figura 2. Principais marcadores neuropatológicos da DA.
1.1.2.1 Déficit colinérgico
Os déficits cognitivos na DA têm sido amplamente associados à disfunção do sistema colinérgico, consequente à degeneração dos corpos celulares colinérgicos no prosencéfalo basal. Refletindo a perda de inervação colinérgica, reduções na acetilcolinesterase e na colinacetiltransferase (ChAT) foram relatadas em cérebros com a DA [21]. Em pacientes com DA, até 75% da perda de neurônios colinérgicos podem ocorrer no prosencéfalo basal e no septo, resultando numa grande diminuição na ChAT cortical e hipocampal e na diminuição da espessura da rede densa de fibras colinérgicas [22].
A transmissão colinérgica nas regiões do hipocampo, córtex frontal, núcleo basal e amígdala, é responsável por várias funções cognitivas, tais como aprendizado, linguagem, memória e atenção [23]. Os receptores muscarínicos e nicotínicos quando interagem com o neurotransmissor acetilcolina produzem uma variedade de eventos bioquímicos, dando origem aos efeitos colinérgicos [24]. Os receptores nicotínicos participam numa variedade de funções fisiológicas que incluem a regulação da excitabilidade neuronal e liberação de neurotransmissores. São amplamente distribuídos nos sistemas nervosos periférico e central, bem como no sistema imunológico e em vários tecidos periféricos [25]. Tais receptores do tipo α4β2 e α7, que predominam no hipocampo, demonstram estar envolvidos no funcionamento cognitivo, tais como o aprendizado e a memória [26,27]. Já os receptores muscarínicos desempenham um papel central na regulação da memória, aprendizagem e processos cognitivos
[28]. Estão acoplados a proteína G e consiste em cinco subtipos, M1 – M5, que são expressos
em todo cérebro, desempenhando diversos processos funcionais, desde funções de alto nível como atenção, memória, e aprendizagem e processo sensório-motor, até funções de nível inferior como ciclos de sono-vigília e excitação [29].
Na finalização do estímulo no receptor colinérgico, a acetilcolinesterase, que é a catalisadora do processo, é também a enzina hidrolisadora da acetilcolina que forma como produto a colina e o acetato (Figura 3) [30]. A colina pode ser recapturada para o neurônio pré-sináptico com o devido auxílio de um transportador, assim podendo reestabelecer o ciclo colinérgico [31].
Figura 3. Hidrólise da acetilcolina catalisada pela enzima acetilcolinesterase.
Atualmente, dos quatro fármacos usados para tratamento da DA, três deles são para inibição da acetilcolinesterase, a donepezila, a galantamina e a rivastigmina [32]. O desenvolvimento de novos candidatos à fármacos e a maioria das bases de tratamento da DA são baseados na hipótese colinérgica. A tacrina foi retirada do mercado por causa da toxicidade hepática, não se mostrando útil no tratamento do comprometimento cognitivo leve ou na prevenção do declínio cognitivo leve [33].
1.1.2.2 Neuroinflamação
A neuroinflamação é um dos processos neuropatológicos relacionados a DA. Pode ser desencadeada por vários mecanismos biológicos, incluindo o estresse oxidativo e as reações gliais [34]. É um mecanismo de defesa normal, que visa proteger o sistema nervoso central contra patógenos, traumas e toxinas; vias neuroinflamatórias recrutam a micróglia (células imunes residentes no cérebro) e macrófagos periféricos para remover patógenos e promover a sobrevivência neuronal. A neuroinflamação crônica e a ativação glial adversa podem contribuir para a progressão de doenças neurodegenerativas como a DA e a doença de Parkinson [35].
Uma característica patológica comum no cérebro de pacientes com a DA é a presença de glia ativada associada tanto a placas amilóides quanto a depósitos difusos de Aβ. Glias são
ativadas por vários fatores, incluindo Aβ, a cascata do complemento e citocinas. Embora a glia ativada possa estar envolvida no catabolismo da Aβ, a ativação glial induzida pela Aβ também pode ser uma resposta pró-inflamatória que inclui a liberação de citocinas, interleucinas, óxido nítrico (NO) e outras moléculas potencialmente tóxicas [36].
A neuroinflamação crônica pode começar a degradar o tecido e a barreira hematoencefálica, fazendo com que a micróglia ativada libere citocinas pró-inflamatórias para atuar nas células imunológicas periféricas, gerando uma resposta imunológica através da modulação inflamatória. Além disso, a neuroinflamação crônica causa uma liberação sustentada de citocinas, que pode comprometer o tecido cerebral através de efeitos inflamatórios e atróficos no volume cerebral. Esse processo leva à neurodegeneração e déficits cognitivos, que são conhecidos por estarem associados à DA [37]. As citocinas são um exemplo notável do duplo efeito dos mediadores neuroinflamatórios. Citocinas derivadas de astritos, tais como interleucina (IL)-1β e fator de necrose tumoral-α (TNF-α) são geralmente considerados para promover a neurotoxicidade ao passo que outros, incluindo IL-6 e fator de crescimento transformante-β (TGF-p), têm sido implicados em processos neuroprotetores [38,39]
Outro estudo significativo, realizado com animais transgênicos, baseado em modelos da DA, mostrou que astrócitos reativos estavam presentes na região ao entorno das placas, circulando os depósitos peptídeo β-amiloide, funcionando como uma barreira entre o tecido nervoso saudável e as áreas afetadas [40].
A Figura 4 resume as características fisiopatológicas da resposta inflamatória e neurodegeneração da DA [41].
Figura 4. Características do envelhecimento não patológico e da doença de Alzheimer baseado na resposta
inflamatória e neurodegeneração.
O candidato a fármaco Flurizan e o Ibuprofeno são anti-inflamatórios não esteroidais que chegaram, respectivamente, às fases clínicas IV e III, porém, não obtiveram eficácia clínica [42,43,44]. O CHF 5074 e o Azeliragon se encontram em fase clínica II e III, respectivamente, onde o CHF 5074 é um análogo estrutural a estes anti-inflamatórios [45] (Figura 5).
Atualmente, a maioria dos medicamentos experimentais de alvo único que são eficazes em modelos animais de doenças neurodegenerativas não tem sido eficaz em ensaios clínicos da DA [46,47].
1.1.2.3 Emaranhados neurofibrilares e proteína tau
O principal constituinte dos emaranhados neurofibrilares é a proteína tau associada a microtúbulos que se agrupa anormalmente em filamentos helicoidais pareados. A maioria dos estudos descobriu que o acúmulo dos emaranhados neurofibrilares em pacientes com a DA se correlaciona com os parâmetros clínicos de demência [48]. A hiperfosforilação progressiva e a agregação de tau em cérebros com DA correlacionam-se bem com a perda de sinapse e neurodegeneração e podem ser um fator-chave para o declínio cognitivo. Entretanto, os mecanismos subjacentes à agregação de tau e consequente toxicidade celular são desconhecidos [49].
O gene da proteína tau está localizado no cromossomo 17, decodificada apenas por um gene, levando a seis combinações possíveis, ou seja, seis isoformas de tau, podendo ser encontradas principalmente nos neurônios e localizadas principalmente nos axônios. As isoformas são constituídas por entre 352 a 441 aminoácidos [50,51]. Na sua forma nativa, apresenta-se desorganizada, muito flexível e resistente a tratamentos agressivos, como altas temperaturas e tratamentos ácidos, além disso, é uma das proteínas mais solúveis [51].
Na DA, a tau torna-se progressivamente fosforilada em múltiplos locais (hiperfosforilada). Juntamente com as alterações no ambiente local, déficits de chaperonas moleculares, e degradação, este faz com que seja propenso a oligomerização e a formação de filamento helicoidal emparelhado, que eventualmente conduz a emaranhados neurofibrilares [52]. A associação entre a hiperfosforilação das proteínas tau e a DA, pode estar relacionada tanto ao aumento da atividade da cinase quanto à diminuição da atividade da fosfatase. As cinases, responsáveis pela fosforilação, e as fosfatases, responsáveis pela desfosforilação, regulam o grau de fosforilação, onde a forma não fosforilada se liga preferencialmente aos microtúbulos [53,54]. Assim, geralmente, a proteína tau é três a quatro vezes mais fosforilada nos cérebros dos pacientes com DA do que nos cérebros saudáveis [51].
Embora uma grande proporção de tau esteja localizada nos axônios, uma pequena quantidade é fisiologicamente distribuída nos dendritos. A função pós-sináptica da tau permanece mal definida, mas pode estar implicada na plasticidade sináptica [55]. A plasticidade
sináptica está relacionada também com a proteína tau que é capaz de afetar eventos sinápticos, como a depressão de longa duração, que, ao lado da potencialização de longa duração, é uma redução da atividade sináptica que ocorre por um estímulo prolongado, vem sendo apontado como a base do aprendizado e a memória, mesmo apresentando controvérsias [56].
Pesquisadores podem analisar os efeitos da DA quando observam tecido cerebral com o microscópio e percebem que o tecido com a doença apresenta um número bem menor de células nervosas e sinapses do que um cérebro normal e saudável. Além disso, as placas, se agrupam entre as células nervosas e as células nervosas mortas e prestes a morrer contém emaranhados neurofibrilares (Figura 6).
Figura 6. Diferenciação de células nervosas com a DA e saudáveis. Destaque para os círculos verdes que
representam as placas e a indicação da seta mostra células nervosas mortas e prestes a morrer. ©2018 Alzheimer's Association. www.alz.org. All rights reserved. Illustrations by Stacy Jannis.
1.1.2.4 Peptídeo β-amiloide
É amplamente aceito que a deposição de β-amiloide precede a atrofia cerebral e o declínio cognitivo, onde resultados de estudos mostram que 20-40% dos indivíduos cognitivamente normais, com idade entre 60 e 90 anos apresentam altos níveis de deposição de Aβ no cérebro (Figura 7) [57].
Figura 7. Representação das placas. Destacando que o círculo vermelho representa o Aβ que quando unidas
formam as placas, mostrada pelo círculo verde; as formas mais nocivas de Aβ talvez sejam os grupos de pequenos pedaços (círculo azul) do que as placas em si, onde tais agrupamentos podem bloquear a sinalização entre células nas sinapses. ©2018 Alzheimer's Association. www.alz.org. All rights reserved. Illustrations by Stacy Jannis.
A DA começa com um processamento anormal da proteína precursora amiloide (PPA), que, assim, leva ao excesso de produção ou de redução da depuração do Aβ no córtex [58]. Quando se refere a DA autossômica dominante, todas as formas que são conhecidas, envolvem genes que codificam a própria PPA ou codificam subunidades protease (PS1 e PS2) que estão envolvidas na clivagem de Aβ da PPA para gerar peptídeos Aβ amiloidogênicas. Por mecanismos que são desconhecidos, porém, possivelmente como resultados dos efeitos tóxicos dos oligômeros Aβ [59], uma ou mais das formas Aβ levam a uma cascata que é caracterizada pela agregação anormal da proteína tau, disfunção sináptica, morte celular e encolhimento cerebral (Figura 8) [60].
Figura 8. Comparação de dois cortes transversais de cérebros mostrando a diminuição (encolhimento) cerebral.
©2018 Alzheimer's Association. www.alz.org. All rights reserved. Illustrations by Stacy Jannis.
A proteína amiloidogênica que se acumula na DA é Aβ e existe em várias formam que resultam da clivagem sequencial da PPA pela enzima BACE-1 (também denominada β-secretase) e γ-secretase. O início precoce da DA está associado a mutações no substrato PPA ou no sítio catalítico da γ-secretase, presenilina. Essas mutações levam a depósitos de Aβ, e depósitos semelhantes ocorrem em pacientes com DA de início tardio, foi assumido que mecanismos semelhantes estavam em jogo, apenas ausente o link causal genético subjacente. Consequentemente, foram desenvolvidos compostos para tratar a DA de início tardio, inibindo γ-secretase (por exemplo, semagacestat e avagacestat) e β-secretase (por exemplo, verubecestat e atabecestat) [61,62].
A PPA é uma glicoproteína do tipo transmembrana que está presente nos neurônios e nas células da glia e contém 695 a 770 aminoácidos. Apresenta um grande ectodomínio N-terminal, um único domínio transmembrana e uma cauda citoplasmática curta [63,64]. As enzimas α, β, γ-secretases estão envolvidas na clivagem da PPA que geram peptídeos de tamanhos diferentes (Figura 9). Na via não-amiloigogênica (que também é chamada de clivagem normal), a PPA é quebrada pela α-secretase e libera os fragmentos sPPA α, que é solúvel e liberado para o meio extracelular, e C83, que é correspondente a região C-terminal.
O fragmento C83 é quebrado pela γ-secretase produzindo os fragmentos P3 e domínio intracelular da PPA (AICD) [65].
Na via amiloidogênica, a mutação no gene da PPA, que codifica a proteína precursora β-amiloide e/ou das presenilina do complexo -secretase [62], que o processamento produz o Aβ. A hidrólise começa com a ação da enzima β-secretase e forma os fragmentos sPPA β e C99. Seguindo o processo, o fragmento C99 é quebrado pela -secretase novamente, gerando o fragmento AICD e peptídeos menores, se diferenciando entre 39 a 43 aminoácidos [65]. Desses resíduos, o fragmento que possui 42 aminoácidos apresenta propriedade de agregação e é considerado como o mais tóxico [66]. É encontrado na forma de monômeros, dímeros e oligômeros, que podem ser organizados em protofibrilas e fibrilas [67,68].
Figura 9. Processamento da proteína precursora do amiloide (Adaptado de Kuruva e Reddy) [68].
O peptídeo amiloide em suas diferentes formas está intimamente ligado com a DA e pode acarretar o comprometimento da atividade colinérgica, o estresse oxidativo, a desregulação da homeostase de cátions metálicos, a neuroinflamação e a hiperfosforilação da proteína.
1.1.3 Tratamento da doença de Alzheimer
1.1.3.1 Fármacos disponíveis e desenvolvimento de novos candidatos a fármacos
A medida que a população mundial envelhece, é esperado um aumento significativo do número de indivíduos afetados. De modo geral, a DA afeta a população idosa, que, como fator importante, há um aumento da expectativa de vida da população. Por se tratar de uma doença grave e sem cura, os fármacos atuais não atuam em todas as fases da doença e são paliativos, sendo que, o arsenal terapêutico ele é limitado. A partir desses aspectos, há um crescente busca por novos candidatos a fármacos para o tratamento da DA.
Atualmente, nenhum dos tratamentos farmacológicos disponíveis para a DA retarda ou interrompe o dano e a destruição dos neurônios que causam os sintomas da doença e tornam a doença fatal. Os medicamentos para tratamento da DA melhoram temporariamente os sintomas, que aumentam a quantidade de substâncias químicas chamadas neurotransmissores no cérebro [2].
Os fármacos disponíveis com evidência clínica para pacientes com a DA (Figura 10) são os inibidores de AChE que são a donepeliza, a rivastigmina e a galantamina, onde esses são usados nos estágios leve a moderada. Outro medicamento é a memantina, que é um antagonista do receptor NMDA (N-Metil-D-Aspartato), que foi aprovado para os estágios de moderada a grave, e previne a morte celular neuronal excessiva [69,70].
Figura 10. Medicamentos disponíveis usados no tratamento da doença de Alzheimer.
A epotilona D, que é um estabilizador de microtúbulos, apresentou bons resultados em modelos animais para a DA, porém, teve seu estudo interrompido em 2013, quando se encontrava em fase I [71]. Hoje em dia, apenas o TPI 287, que atua como estabilizador da proteína tau, se encontra em fase clínica I [72]. Apenas o TRx0237, que é um inibidor de agregação da proteína tau, continua sendo investigado e se encontra na Fase III, sendo
pesquisado com um grupo de pacientes com classificação de DA branda ou moderada [73] (Figura 11).
Figura 11. Estrutura dos compostos abordados para a hipótese da proteína tau para tratamento da DA.
Os principais alvos são as enzimas AChE, β e γ-secretases, compostos que inibem a hiperfosforilação da proteína tau e agonistas nicotínicos. Existem muitos outros tipos de marcadores neuropatológicos da DA e estão indicados na Figura 12.
Figura 12. Marcadores neuropatológicos da DA e suas respectivas abordagens para desenvolvimento de novos
Mais de duzentos compostos chegaram a ensaios clínicos de fase II desde 2003, no entanto, nenhum novo medicamento foi aprovado para o tratamento da DA. A maioria dos ensaios clínicos de fase II que terminam com um resultado positivo não têm sucesso na fase III, que, muitas vezes, é devido a efeitos adversos graves ou falta de eficácia terapêutica [74]. Alguns exemplos de medicamentos (Figura 13) que sofreram descontinuação no status de julgamento são idalopirdine (serotoninérgico – antagonista do receptor 5-HT6), encenicline
(resposta à acetilcolina – agonista α7nAChR), Alzhemed TM (inibidor da ativação microglial),
dentre outros [74].
Figura 13. Alguns medicamentos que sofreram descontinuação nos últimos 11 anos com variados efeitos adversos
ou falta de eficácia terapêutica
1.1.3.2 Tratamento não-medicamentoso da doença de Alzheimer
Um aspecto crucial que apenas recentemente recebeu uma acentuada atenção diz respeito às possibilidades claras de prevenção de doenças ou pelo menos o atraso no início da doença, que, muitas vezes, podem ser alcançadas através de mudanças simples no estilo de vida [75]. Cabe destacar que é imprescindível uma vida saudável para acarretar uma menor probabilidade de desenvolver qualquer tipo de doença, inclusive o destaque para as demências, em geral. O exercício é um exemplo excelente, que foi comprovado, onde quando praticado pelo menos três vezes por semana e pode estar associado a um menor risco para DA e demência [76]. Ensaios clínicos dos efeitos de vários exercícios sobre a prevenção da DA sugerem que o exercício físico de longo prazo com uma intervenção cognitiva multicomponente pode melhorar a função cognitiva em pacientes com a DA [77].
1.2 CHALCONAS
1.2.1 Estrutural geral e biossíntese
Chalconas são moléculas cuja estrutura é formada por dois anéis aromáticos ligados por um sistema carbonílico ,β-insaturado, conforme representado na Figura 14.
Figura 14. Estrutura geral de uma chalcona.
As chalconas também são encontradas na natureza [78], correspondendo a flavonoides de cadeia aberta com estrutura de quinze carbonos dispostos numa configuração de C6-C3-C6
[79]. Na Figura 15 podemos observar um exemplo de chalcona natural, a licochalcona E, com a estrutura característica, sendo que esta exibe uma citotoxicidade potente para linhagens tumorais humanas e células endoteliais, além de potencial anti-inflamatório para reduzir inflamação da pele [80,81].
Figura 15. Estrutura geral de uma chalcona mostrando a disposição dos quinze carbonos.
As chalconas são exemplos relativamente simples de moléculas nas quais um precursor cinamoil-CoA (C6C3) da via do chiquimato é usado como um substrato para o sistema
PKS (policetídeo sintase). Se a 4-hidroxicinamoil-CoA é condensada sucessivamente com três unidades de malonil-CoA, uma cadeia 1,3-dicarbonilada é formada. Essa cadeia pode então ser dobrada de duas maneiras, permitindo a ocorrência de ciclizações de Claisen, mediadas por enzimas do grupo chalcona sintase, que ciclizam o mesmo substrato de maneiras diferentes. O anel heterocíclico de seis membros característico da maioria dos flavonoides, como, por
exemplo a naringenina, é formado pelo ataque nucleofílico do oxigênio fenólico à posição β do sistema carbonílico α,β-insaturado (Figura 16). Uma outra forma de cilização leva ao resveratrol [82,83].
Figura 16. Biossíntese de chalconas, precursoras dos flavonoides (Adaptado de Dewick) [82].
1.2.2 Atividades biológicas
Chalconas têm recebido destaque principalmente em função de suas propriedades biológicas têm sido descritas na literatura [84,85] como por exemplo, atividade antifúngica [86], antibacteriana [87], anti-inflamatória [88], anti-câncer [89], leishmanicida [90] e tripanomicida [91] dentre outras, de importância na agricultura [79]. Esses compostos têm também características importantes para área de química medicinal: facilidade para sintetizar e baixo custo. Destaca-se também a possibilidade de obtenção de série de compostos, à medida que os substituintes do anel aromático são modificados, permitindo a realização de estudos de relações estrutura-atividade.
A aplicação prática prospectiva de chalconas como reguladores de crescimento de plantas e agentes de defesa ecologicamente corretos na agricultura e produção vegetal é de grande importância. Esses metabólitos secundários apresentam numerosas atividades biológicas e, consequentemente, existem muitas possibilidades na agricultura [79]. Na figura 17, evidenciam-se diferentes estruturas e atividades biológicas de chalconas com importância para agricultura e proteção vegetal.
Figura 17. Estruturas de algumas chalconas com importância para agricultura e proteção vegetal (Adaptado de
Diáz-Tielas e colaboradores) [79].
Devido a ampla aplicabilidade de chalconas, foram relatados outros compostos com atividade anti-câncer. Um exemplo interessante foi a obtenção de derivados de chalconas para atuar como ligantes para duas proteínas-alvo: a di-hidrofolato redutase (DHFR) e a tioredoxina redutase (TrxR). Esses derivados foram formados pela união entre 4,6-diamino-1,2-diidro-1,3,5-triazina e chalconas (Figura 18), através de cadeias diéteres flexíveis de variados comprimentos [92]. Esses compostos apresentaram maior atividade citotóxica contra células de carcinoma de mama de origem humana.
Figura 18. Estrutura geral de chalconas substituídas pelo grupo di-hidrotriazina, com espaçadores de diferentes
tamanhos (Adaptado de Hui-Li Ng e colaboradores) [92].
Outra pesquisa interessante foi a investigação de séries de 6-quinolinil-chalconas com inibição para células cancerosas. Os compostos na Figura 19A, apresentaram boa atividade contra linhagens celulares MCF-7 (mama) e TK-10 (renal). Observou-se também, que derivados dessas séries, foram potentes sobre outros tipos de linhagens celulares, as células leucêmicas (HL60 de leucemia promielocítica humana) e a linhagem imortalizada humana de linfócito T (células Jurkat), observados na Figura 17B [93].
Figura 19. Chalconas com atividade antiproliferativa sobre linhagens tumorais humanas. (A) MCF-7 e TK-10; B:
As chalconas são intermediários sintéticos versáteis, uma vez que sua estrutura apresenta alguns centros reativos, conforme representado na Figura 20, permitindo-se a preparação de derivados. Quando essas modificações são acrescidas de variações na natureza eletrônica de substituintes do anel aromático e do seu padrão de substituição, é possível obter muitos compostos estruturalmente variados. Essa possibilidade de obter série de compostos é uma contribuição bastante importante para estudos das relações estrutura-atividade, cujos resultados são importantes no processo de desenvolvimento de compostos bioativos e fármacos.
Figura 20. (A) Possibilidade de sofrer diversos tipos de reações e seus respectivos centros reativos; (B) Variação
estrutural nos anéis aromáticos para obtenção de séries de compostos.
1.2.3 Síntese
Esses compostos têm também características importantes para área de química medicinal: facilidade para sintetizar e baixo custo.
Chalconas podem ser sintetizadas facilmente em laboratório por reações de condensação catalisadas por base, entre um aldeído aromático e uma cetona aromática, com diferentes padrões de substituição permitindo a obtenção de compostos com uma grande variedade
estrutural. Essa reação é conhecida como reação de condensação de Claisen-Schmidt (Figura 21) [94].
1.2.4 Aminochalconas
Conforme discussão precedente, a grande maioria das chalconas apresenta atividade biológica. Neste grupo, encontram-se as aminochalconas que vem sendo estudadas em nosso laboratório e em outros grupos de pesquisa. Estudos apontaram que a aminochalcona (Figura 22) apresentou atividade citotóxica potente para diversos tipos de linhagens de células cancerígenas humanas, tais como, mama, colorretal e eritromieloblastoide. A citotoxicidade elevada dessa aminochalcona é relativa à apoptose precoce comum em células cancerígenas devido a interação com os receptores de TNF-α [95].
Figura 22. Estrutura da aminochalcona com atividade citotóxica para diversos tipos de linhagens cancerígenas
humanas.
Aminochalconas que apresentam o grupo funcional hidroxila apresentam, de modo geral, atividade antioxidante. Os compostos representados na Figura 23, foram avaliados com os métodos de ensaio de eliminação de superóxido e teste de eliminação de radicais DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil), onde o composto com dois grupos hidroxilas exibiu uma atividade antioxidante muito elevada em comparação aos outros compostos (IC50 = 4,9 ± 1 µM).
Para os compostos com a presença de uma hidroxila (IC50 = 38,6 ± 1 µM) e de duas hidroxilas
(IC50 = 37,1 ± 1 µM), tornam-se bons candidatos para a atividade de eliminação de superóxidos
[96].
Figura 23. 2’-aminochalconas que apresentam atividade antioxidante.
Estudos interessantes sugeriram que uma aminochalcona (Figura 24) com o grupamento amino na posição 3, possui atividade antiproliferativa potente contra as linhagens celulares de carcinoma hepatocelular humano de fígado (HEPG2) e de carcinoma do cólon (HCT116), além
de apresentar outras potentes atividades inibidoras contra linhagens celulares de câncer humano [97].
Figura 24. 3-Aminochalcona com potente ação contra diferentes linhagens celulares de câncer humano.
1.3 TOXICIDADE
Apesar de apresentarem uma gama de atividades, a toxicidade de chalconas vem sendo pouco estudada [98].
Para uma possível aplicação futura de chalconas, ou qualquer outro composto, como candidato a fármaco é importante avaliar sua toxicidade.
O teste de toxicidade in vitro tem por finalidade determinar a dependência da concentração da ação tóxica de compostos químicos, ou seja, sua potência tóxica em nível celular. Essas informações são cruciais para: (i) avaliar a atividade citotóxica de substâncias químicas ou a potência de agentes citostáticos e citoprotetores; (ii) estabelecer relações de classificação de toxicidade e estrutura-atividade; (iii) explorar e caracterizar modos de ação e vias de toxicidade; (iv) extrapolação quantitativa dos ensaios in vitro para os in vivo (quantitative in vitro to in vivo extrapolation – QIVIVE), que relaciona concentrações in vitro com equivalente humano em doses por uso da modelagem biokinetik reversa [99].
Métodos que são mais comuns para a detecção da citotoxicidade ou viabilidade celular são o ensaio de vazamento de lactato desidrogenase (LDH), ensaio de proteína, vermelho neutro e o ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT) [100].
Estudos de toxicologia avaliam toxicidades potenciais de um candidato a medicamento e determinam como a terapia medicamentosa pode ser gerenciada para minimizar o risco do paciente. Nos últimos anos, estudos de toxicidade foram realizados apenas durante a fase de desenvolvimento clínico. No entanto, a toxicidade continua sendo uma das principais causas de atrito do candidato a fármaco durante o desenvolvimento clínico e pré-clínico [101]. Muitos
medicamentos já foram retirados de mercado, durante o uso clínico, porque apresentaram toxicidade na população. Ensaios in silico e in vitro podem ajudar a indicar toxicidades potenciais durante a descoberta de novos candidatos a fármacos.
Uma das principais causas de toxicidade de fármacos é a bioativação metabólica. Na maioria dos casos, o metabolismo serve como uma função importante de modificar quimicamente os compostos para torna-los mais polares e, assim, mais facilmente eliminado na bile e na urina. O intermediário reativo ou metabólito pode ser um eletrófilo que se liga covalentemente a nucleófilos biológicos como, por exemplo, proteínas e DNA. O aduto resultante não funciona normalmente e pode causar mutação no DNA, o que pode levar ao câncer. Modificações de proteínas podem provocar uma resposta imune. Muitas vezes, essas reações ocorrem no fígado, levando à hepatotoxicidade, mas os metabólitos reativos também podem causar danos nos locais distais [101].
Os ensaios in vitro estão sendo cada vez mais aplicados para avaliação da toxicidade. Esta estratégia permite estudar um maior número de compostos, mecanismos específicos de toxicidade e baixo custo com compostos e, também, reduz o uso de animais [101].
No contexto desse trabalho, decidiu-se avaliar a toxicidade de compostos por citotoxicidade que é a morte de células viáveis pelo composto por um determinado teste. Essa abordagem analisa diversos mecanismos pelos quais o composto pode impedir o funcionamento normal da célula e desencadear morte celular. Os hepatócitos são vantajosos para ensaios de citotoxicidade porque tanto o composto que passará pelo teste como os seus metabolitos podem causar toxicidade [101].
Chalconas e derivados apresentam diversos relatos de inúmeros casos de grande atividade citotóxica [102,103,104]. Uma pesquisa interessante foi a síntese e a avaliação de derivados de chalconas contendo grupos carbamoila, também presentes no anticolinesterásico rivastigmina. O composto representado na Figura 25 é um exemplo dessa série e que inibiu tanto a acetilcolinesterase quanto a butirilcolinesterase, com valores de IC50 ligeiramente
melhor que a do fármaco disponível, a rivastigmina, usada para tratamento da DA. Além disso, bloqueia a ação de espécies reativas de oxigênio em células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) e mostrou baixa toxicidade na linhagem SH-SY5Y [105].
Figura 25. Derivado de chalcona-rivastigmina com boas avaliações biológicas e com toxicidade insignificante.
No contexto desse trabalho, a possível toxicidade de aminochalconas foi considerada. O grupo amino ligado ao anel aromático pode sofrer reações de N-oxidação mediadas por oxidases do sistema citocromo P450 (CYP450) e flavina-mono-oxidase (MAO), levam a formação de hidroxilaminas, que por sua vez podem ser acetiladas e, posteriormente formar um íon arilnitrênio. Esse íon é capaz de se ligar covalentemente a nucleófilos biológicos, desencadeando a formação de tumores (Figura 26).
2 OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS 2.1 Precedentes
O nosso laboratório vem realizando uma série de estudos com chalconas e derivados, desde 2008. Esses estudos tinham inicialmente o objetivo de sintetizar e investigar o efeito antifúngico desses compostos [106,107]. Mais recentemente, novas chalconas com diferentes padrões de substituição, incluindo as do presente projeto, foram sintetizadas e avaliadas quanto ao seu efeito sobre algumas enzimas envolvidas na biossíntese ou degradação de marcadores neuropatológicos da DA. Nesse contexto, destacam-se a acetilcolinesterase (AChE) e a β-secretase, sendo que a primeira promove a hidrólise da acetilcolina e a segunda, atua no processamento da PPA, contribuindo para aumentar o déficit colinérgico e o aumento da deposição de estruturas oligoméricas do Aβ, respectivamente. Assim, inibidores dessas enzimas são potencialmente candidatos a fármacos para o tratamento da DA.
As chalconas estudadas em nosso laboratório apresentaram resultados bastante promissores como inibidores da AChE [108] e da BACE-1 [109]. Entretanto, nenhum estudo de citotoxicidade foi realizado.
Assim, nesse projeto propusemos o estudo da citotoxicidade de chalconas e derivados, com diferentes padrões de substituição.
2.2 Objetivos específicos
Para que esse objetivo fosse atingido, os seguintes objetivos específicos foram planejados:
(a) sintetizar e caracterizar 2’-aminochalconas e derivados N-funcionalizados;
(b) avaliar a citotoxicidade das chalconas bioativas e derivados, frente a linhagens celulares não-tumorais e tumorais;
(c) avaliar o efeito dos compostos sintetizados sobre a AChE; (d) estudar o perfil farmacocinético in silico;
3 METODOLOGIA
3.1 Obtenção das chalconas e dos derivados
As chalconas foram obtidas pela condensação de Claisen-Schmidt [94] entre um aldeído substituído e a 2-aminoacetofenona, na presença de NaOH, utilizando metanol ou etanol. Uma reação de substituição nucleofílica e substituição em carbono acílico foram as estratégias usadas na funcionalização do nitrogênio anilínico.
3.2 Avaliação da citotoxicidade pelo método MTT [110]
Os ensaios de citotoxicidade foram realizados com as linhagens celulares M059J (glioblastoma humano grau IV – ATCC-CRL-2366), Vero (fibroblasto rinal de macaco verde africano, Cercopithecus aethiops – ATCC-CCL-81) e NIH-3T3 (fibroblasto de camundongo – ATCC-CRL-1658), na densidade de 1 x105 céls/mL, por poço, em meio RPMI 1640. Os ensaios foram realizados no Labiotec da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Unicamp. As placas de 96 poços foram incubadas a 37 °C, em estufa umidificada com 5% de CO2, por 24 h. Após esse
período, a troca de meio foi realizada e os compostos foram adicionados em triplicata, com um gradiente de concentração de 3,125 a 200 𝜇g.mL−1. Após 24 h de incubação, o meio foi removido e cada poço foi lavado três vezes com 0.1 mL de PBS pH 7,4 e, após a lavagem, 0,2 mL do meio RPMI 1640 contendo o corante MTT (brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio), na concentração de 0.5 mg.mL−1 foi adicionado. A placa foi novamente incubada por 3h na temperatura de 37 ºC. Após esse período, o meio foi removido e 0,2 mL de etanol foi utilizado para solubilizar o meio. As placas foram agitadas por 10 min e a absorbância para cada poço foi medida, utilizando-se o espectrofotômetro ELx800 Absorbance Microplate Reader (BioTek, USA), em 570 nm.
Para o cálculo do IC50 (concentração inibitória mínima letal para 50% das células), as
concentrações foram transformadas em μM e plotadas com os correspondentes percentuais de inibição. O cálculo foi realizado no programa Origin 8.1.
3.3 Propriedades farmacocinéticas in silico
Para a previsão das propriedades farmacocinéticas in silico, as estruturas tridimensionais dos compostos foram desenhadas com o programa Corina, versão online (https://www.mn-am.com/online_demos/corina_demo), que atribui às estruturas tridimensionais comprimentos de ligação e ângulos predefinidos dependendo do tipo de ligação, do tipo de átomo e do estado
