* Estratégias e aplicações da Espectrometria de Massas

(1)

Workshop: Avanços na Engenharia de Proteínas e Peptídeos 13h às 17h

Dra. Lucilene Delazari dos Santos UNESP, Campus Rio Claro, SP.

(2)

História da Espectrometria de Massas

1886- Descoberta do Íon- Goldstein

1910- Primeiro Espectro de Massas – JJ Thomson- Ne

1918- Primeiro Espectrômetro de Massas- Dempster

(3)

• Uma poderosa técnica analítica:

– Medir massa molecular de compostos – Identificar compostos desconhecidos – Quantificar compostos

– Revelar a estrutura de moléculas

– Determinar modificações pós traducionais em

proteínas

(4)

• Detectar e identificar substâncias proibidas em atletas;

• Monitorar pacientes durante uma cirurgia;

• Determinar a composição de espécies encontradas no espaço;

• Localizar depósitos de petróleo;

• Monitorar processos de fermentação;

• Detecção de dioxinas em peixes;

• Determinar danos em genes;

• Estabelecer composição elementar de material semi condutor.

(5)

•

Informação de massa molecular – Com precisão

•

Identificação de proteínas usando massa molecular de peptídeos trípticos

•

Informação Estrutural

•

Sequenciamento de peptídeos

•

Identificar modificações pós-traducionais (fosforilação, glicosilação e pontes de sulfeto)

Análise de Biomoléculas –

(6)

• Uma pequena quantidade de amostra é vaporizada e

injetada no espectrômetro de massa;

• A amostra é então ionizada;

• Os íons formados podem ser positivos ou negativos; • Fragmentos neutros não são detectados;

• Os íons são então separados de acordo com sua razão

m/z;

– m = massa; z = carga

• Os íons são então detectados.

(7)

• Requer métodos para:

– Obter amostras na fase gasosa;

– Formar íons;

– Separar os íons de acordo com sua

razão m/z

– Detectar os íons formados

(8)

Como um espectrômetro de massas trabalha? Inlet Ionização Analyzer Separação Ion Detection Detecção

Análise dos dados

Source + 1330 1330 1330 134013401340 135013501350 100 100 100 75 75 75 50 50 50 25 25 25 0 0 0 Introdução da amostra • Sólida • Liquida • Gasosa Ions detectados Formação de íons Espectro de massas

(9)

• Cromatografia Líquida

– LC/MS - termicamente instáveis, compostos de

alto PM

– LC/MS adequado para proteínas e peptídeos – Técnica “on-line”

• Sondas de inserção direta

– Amostras colocadas em uma sonda e inseridas – Amostras podem misturadas a uma matriz

• Cromatografia Gasosa

– Amostras precisam ser voláteis

(10)

(11)

Métodos suaves de ionização

Fonte de íons

Ionização por elétron (EI) Ionização química (CI) MALDI Métodos agressivos de ionização

(fragmentos podem nao ser detectados)

Eletronspray (ESI)

(12)

Fonte de íons

Ionização por elétron (EI) Ionização química (CI) MALDI Eletronspray (ESI) Métodos suaves de ionização Métodos agressivos de ionização

(13)

(14)

•A matriz absorve energia do laser o que causa sua

volatilização junto com a volatilização da amostra

Métodos de ionização

•A amostra é misturada com uma matriz que

absorva UV

•As moléculas da matriz ionizada transferem

(15)

I - á c i d o -4 -h y d r o x i -c y a n o c i n n a m i c o I I - á c i d o Si n a p i c o CH CH COOH H₃CO HO OCH₃ CH C COOH HO CN I I I

Matrizes para MALDI

(16)

Ácido cinâmico

Preparação da amostra

(17)

Pulsed Laser Beam Strong electric field (5-20 kv) + + + + + + + + + + + + + + + + + + Accelerated charged particles Métodos de ionização

(18)

Características da Técnica MALDI-TOF MS

•

Ionização suave – análise de biomoléculas intactas

•

Extensa faixa de massa (> 400 kDa)

•

Análise de misturas - sem purificação

•

Alta sensibilidade

•

Fácil interpretação dos dados

•

Tampões e sais tem pouco efeito

•

Rápida

(19)

Aplicaçôes MALDI-TOF

Peptídeos

Medidas de massa Confirmar síntese Sequenciamento Sequenciamento químico e enzimático MS/MS Análise Proteômica Utilizar resultados para pesquisa em banco de dados

Proteinas

Medidas de Massa Confirmar PM de proteínas Identificar modificações pós traducionais Caracterizar proteínas

Oligonucleotideos

Medidas de massa Confirmar síntese Sequenciamento Ladder sequência-exonucleases Genespectrometria

(20)

(21)

(22)

Fonte de ionização

(23)

(24)

Métodos de ionização

(25)

Equilíbrio de estados de cargas M E H F R W G K H H _H H 4+ H H H H 4+ H H H 3+ H 2+ H 1+ H Métodos de ionização N- terminal amine

(26)

Espectro de Massas ESI de peptídeos

H H m/z = (M_r+4H)/4 H H 4+ H H H 3+ H 2+ H 1+ H m/z = (M_r+3H)/3 m/z = (M_r+2H)/2 m/z = (M_r+H) 1+ 2+ 3+ 4+ R e l. I n te n . m/z ES- MS Métodos de ionização

(27)

Espectro de Massas ESI de Proteínas

(28)

1) Apropriado para compostos carregados, polares e

básicos;

2) Permite a detecção de compostos de alta massa molecular maioria dos espectrômetros de massas;

3) Melhor métodos para análises de compostos multicarregados;

4) Baixo ruído químico permite ótimos limites de detecção; 5) Permite o controle de fragmentações;

6) Compatível com métodos de MS/MS Métodos de ionização

(29)

MALDI-TOF ou Electrospray? Vantagens do MALDI-TOF

• Maior resolução e exatidão (comparado ao LC/MS com quadrupolos e ion-traps);

•Intervalo de massa de ~50 - >400,000 Daltons; •Relativa tolerância à sais, tampões;

•Fácil interpretação dos dados;

•Possibilidade de analisar amostras difíceis (Glicoproteinas, oligonucleotideos,carbohidratos);

(30)

•Sistema dinâmico;

•Aplicado a moléculas pequenas, quantificação,

(particularmente triplo quadrupolo);

•Opções de MS/MS

•Massa exata de proteínas intactas.

(31)

• Exatidão nas medidas de massa

– Caracterização de amostras sintéticas, proteínas, peptídeos...

– Verificação de homogeneidade de amostras antes do sequeciamento das proteínas,

– Purificação de amostras “on line” – Mapeamento de peptídeos

• Caracterização estrutural da proteína usando CID/MS and MS/MS

– Identificação de modificações pos traducionais; – Sequência primária de peptídeos;

• Software eficiente na análise dos dados

– Rápida identificação da proteína utilizando pesquisas em

banco de dados.

(32)

(33)

Resolução

R= m/ m m= m/R

(34)

Análise de proteínas no ESI - BSA

1000 1700 2400 3100 3800 4500 Mass (m/z) 3165 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % I n te n s it y 1954.345 2076.494 2143.433 1846.291 2214.905 1748.868 2291.345 1704.449 2373.148 2461.494 1661.850 1620.910 2556.378 2658.149 1510.337 2893.649 1453.913 3025.703 3909.434 3690.996 3164.460 3327.893 4153.774

(35)

% I n te n s it y 66000 66320 66640 66960 67280 67600 Mass (m/z) 0 3.9E+4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 66424 66533 66684 66805

(36)

Resolução LC-MS-MS

691.5 692.5 693.5 694.5 m/z, amu 2.0e4 1.0e5 1.8e5 In te n s it y , c p s 692.5 694.0 Baixa resolução (700) 692.429 692.934 693.439

High resolution gives you much more information & more accurate information about what is in a sample

Alta resolução ~13000

Precisão

(37)

Quadrupolo (

depende decorrente elétrica)

Time of Flight

(depende da massa)

Ion Trap

(depende da corrente elétrica)

Setor Magnético

(depende da voltagem)

(38)

x

y

z

• Consiste de 4 bastões de metal paralelos

• Os bastões opostos tem potential de mesmo sinal

•angular

(39)

•Voltagem aplicada aos eletrodos afeta a trajetória dos íons com o valor de m/z de interesse, e eles viajam dentro dos bastões

•Estes íons passam através do sistema de eletrodos

•Íons sem interesse mudam sua trajetória original e

chocam nas paredes dos quadrupolos;

•Desta maneira os íons de interesse são separado

•O espectro de massas é obtido variando a voltagem nos

bastões e monitorando quais íons passam pelo filtro

(40)

Em espectrometria de massas seqüencial

Normalmente existem 2 analisadores de massa em série O primeiro analisador (MS1) é usado para SELECIONAR o íon que se deseja fragmentar. O íon selecionado por MS1 é o íon pai que pode ser o íon molecular ou qualquer outro íon resultante de uma fragmentação primária. A DISSOCIAÇÃO ocorre na região de fragmentação. Os íons filhos são analisados no segundo analisador de massas e detectados no detector.

MS2 MS1

(41)

MS1, seleção do íon pai.

Região de fragmentação, existe um gás neutro ( He, Ar, N2….) O íon selecionado interage com as moléculas de gás.A energia cinética dos íons é transformada em energia interna, o que permite a sua fragmentação

MS2, os íons formados são separados de acordo com sua razão m/a e detectados no detector.

(42)

MS

Ion Source

Q1 q2 Q3 Detector

(43)

MS/MS

Ion Source

(44)

MS/MS

Ion Source

(45)

Ion Source

MS/MS

(46)

Aminoácidos são sub unidades da proteína

ALANI NA

(47)

Aminoácidos são ligados por ligações peptídicas e formam poli peptídeos

A polypeptide chain has two distinct ends (amino- or N-terminus and carboxyl- or C- N-terminus) and it is made up

of a regularly repeating backbone and distinctive side chains or residues (R₁, R₂, R₃, R₄, R₅)

(48)

(49)

CID de um Peptídeo Tríptico

y 1 b₁ b₂ b 3 y 2 y 3 L F K G G L K F R e la ti v e I n te n s it y m/z COOH H₂N COOH H₂N+ + y1 b6 b5 COOH H₂N+ y2 + b4 COOH H₂N+ y3 +

(50)

(51)

(52)

Analisador de Massas

Tempo de Vôo

•Separa os íons beseando no tempo de vôo

(53)

Laser

Detector

Signal processing

(54)

Laser

Detector

(55)

Laser

Detector

(56)

Laser Spectrum Detector Signal processing Analisador de Massas

Tempo de Vôo

(57)

Laser Detector Signal processing Spectrum Analisador de Massas

Tempo de Vôo

(58)

Reflectron TOF Z

2

(59)

PULSED LASER BEAM 20 kV ION-GATE m/z 1 m/z 2 m/z1= m/z2 Signal processing DETECTOR

(60)

Signal processing DETECTOR 20 kV ION-GATE LASER

(61)

Signal processing DETECTOR 20 kV ION-GATE LASER t_x

(62)

Signal processing DETECTOR 20 kV ION-GATE LASER

(63)

Signal processing DETECTOR 20 kV ION-GATE LASER m/z

(64)

Signal processing DETECTOR 20 kV ION-GATE m/z

(65)

Signal processing DETECTOR 20 kV ION-GATE m/z

(66)

m/z

íons b

m/z íons y

(67)

(68)

(69)

G T I/L I/L G I/L I/L K/Q S I/L

(70)

(71)

Detectores

Multiplicador de elétrons

Multiplica uma corrente eletrônica, por aceleração de elétrons na superfície de um eletrodo. A colisão libera um número de elétrons secundários maior que o número de elétrons incidentes Os elétrons secundários são acelerados também por um outro eletrodo que por sua vez libera outros elétrons secundários e assim por diante, resultando em uma amplificação do sinal.

(72)

Detectores

Placa de Micros Canais (MCP)

Um arranjo de capilares de vidro - paredes internas - material condutor de energia elétrica - alta voltagem - íon que colidir na parede interna dos capilares criará uma avalanche de elétrons secundários

(73)

Detectores

(74)

Prof. Dr. Mario Sergio Palma

Pós-Doutorandos: Bibiana Monson de Souza Lucilene Delazari dos Santos

Lilian Mari Marcondes Cesas-Togneli

Doutorandos: Daniel Saidemberg Nicoli Baptista Barao Paulo César Gomes Keity Souza Santos

GRUPO LBEZ –

www.rc.unesp.br/lbez

Mestrandos: Fernanda Pessoa de Sales Alessandra Vaso

I.C.: Virginia Ferreira

Jose Roberto dos Santos Nathalia Dias

(75)

(76)

APLICAÇÕES

Espectrometria de Massas

APLICA

Ç

ÕES

Espectrometria de Massas

(77)

Toxinas de venenos podem causar uma grande variedade de sintomas e apresentar vários mecanismos de ação em diferentes

tipos de células

Toxinas de Venenos podem ser usadas como uma importante ferramenta para estudos de bioatividade

Muitas destas toxinas tornam-se modelos

(78)

As toxinas de venenos animais devem

estudadas de acordo com sua natureza

química

:

Compostos de baixo peso molecular;

Peptídeos e

(79)

O tipo de toxina depende do tipo do veneno

animal em investigação

:

Aranhas Escorpiões Cobras Anêmonas Insetos LMW + peptídeos Peptídeos Proteínas + peptídeos LMW Proteínas + peptídeos

(80)

Tetrahydro betacarbolinetoxins Parawixia bistriata NH HO NH NH ₂ NH O NH ₂ NH HO NH NH 2 NH 2 NH Bloqueadores de Receptores Benzodiazipina

(81)

OH HO NH NH O NH NH NH 2 CONH 2 O O NH NH O NH NH O NH NH O NH NH NH 2 CONH 2 O O NH NH HO NH O NH NH O NH NH NH 2 CONH 2 O O NH

Acylpolyamine Amide Toxins: 72 estructuras elucidadas

Nephila clavipes

Non-Competitive Glutamate Receptor Blockers

(82)

Nephila clavipes Web Insecto Toxins HO CH3 N NH OH CH2 CH2 CH₃ O CH3 NH NH2 O .Fe Inseticidas 5-hidroximetil-2-aminometil-N-carbonilamino-2-metilpropilfenona

(83)

Jelly Fish: Caribdea alata Inflammatory factor: OH OH OH OH OH O OH O O

(84)

Aplicações

Structural Characterization of Novel Chemotactic and Mastoparan Peptides from the Venom of the

Social Wasp Agelaia pallipes pallipes by HPLC-ESI-MS/MS

Maria Anita Mendes, Bibiana Monson de Souza,

(85)

Cromatograma de massas do extrato de veneno bruto da vespa Agelaia pallipes pallipes

(86)

I/L-I/L-G-T-I/L-I/L-G-I/L-I/L-K/Q-G-I/L-NH

₂

Sequências dos peptídeos determinadas por ESI-MS/MS

I / L uso de íons fragmentos do tipo d e w

Q / K uso de reação de acetilação com anidrido acético

(87)

Distinguindo Ile e Leu

Íons “d” e “w”

(88)

Distinguindo Ile e Leu

Íons “d” e “w”

(89)

Protonectina (MW 1207.8 Da)

I/L-L-G-T-I-L-G-L-L-K-G-I/L-NH

₂

Sequência dos peptídeos determinadas por

espectrometria de massas

Agelaia MP (MW 1565,0)

(90)

Atividades Biológicas

(91)

Atividades Biológicas

(92)

Atividades Biológicas

(93)

Atividades Biológicas

(94)

Conclusões

Determinação de sequência primária de peptídeos;

Distinção de resíduos de amino ácido isobáricos;

-Caracterização de peptídeos envolvidos em

processo inflamatórios.

Poder da técnica de espectrometria de massas

(95)

MASS SPECTROMETRIC CHARACTERIZATION OF TWO NOVELINFLAMATORY PEPTIDES FROM THE

VENOM OF THESOCIAL WASP Polybia paulista.

Bibiana Monson de Souza1_{, Mauricio Ribeiro Marques}1_,

Daniela Maria Tomazela2, Marcos Nogueira Eberlin2_,

Maria Anita Mendes1_{Mario Sergio Palma}1_*

(96)

Determinação Estrutural

(97)

Determinação Estrutural

Análise de massas do peptídeos purificados

A:

B1

B:

(98)

(99)

(100)

Distinguindo Ile e Leu

Íons “d” e “w”

(101)

Distinguindo Ile e Leu

Íons “d” e “w”

(102)

Determinação Estrutural

Sequência do peptídeo

I N W L K L G K M V I D A L-NH

₂

(MW 1611.98 Da)

(103)

Structural and Functional Characterization of

N-Terminal Blocked Peptides Isolated from

The Venom of the Social Wasp

Polybia Paulista

Susan Pereira Ribeiro1_{, Maria Anita Mendes}1_,

Bibiana Monson de Souza1_{, Lucilene Delazari dos Santos, Maurício}

Ribeiro Marques1_{, Walter Filgueira de Azevedo Jr}2_,

Mario Sergio Palma1*

(1) Dept. Biology - CEIS / IBRC - UNESP - Rio Claro, SP, (2) CEP: 13506-900 – Brazil; (2) Dept. Physics,

(104)

RESULTADOS

Perfil cromatográfico do extrato de veneno em gradiente de 5 to 60% (v/v) MeCN .

(105)

Fração 13 apresentou potente atividade de degranulação demastócitos.

(106)

Perfil cromatográfico da fração 13 em fase normal sob condições isocráticas [50% (v/v) MeCN ].

(107)

FR 13-1 FR 13-2 A: B1 B: B2

(108)

Sequeciamento N-Terminal

Química Degradativa de Edman

Não houve reação de acoplamento entre os grupos

a-amino de ambos peptídeos com o reagente de

Edman (phenylisothiocyanate)

(109)

Espectro de Massas Sequencial (ESI-MS/MS)

(110)

Espectro de Massas Sequencial (ESI-MS/MS)

(111)

Distinção de resíduos de amino ácidos Isobáricos

Uso Combinado de MS com Química de Proteínas

I / L uso de íons fragmentos do tipo d e w

(com alta energia de colisão)

(112)

Sequência Completa dos Peptídeos

Polybine-I: Ac-S-A-D-L-V-K-K-I-W-D-N-P-A-L-NH

₂

Polybine-II: Ac-S-V-D-M-V-M-K-G-L-K-I-W-P-L-NH

₂

Síntese do peptídeos em fase sólida Com e sem acetilação

(113)

Degranulação de Mastócitos;

Hemólise;

Quimiotaxia;

Antibiose.

Atividades Biológicas

Os peptídeos não apresentaram atividades

(114)

(115)

(116)

(117)

A acetilação dos grupos -amino dos resíduos N-terminal do Polybine-I e –II aumenta a atividade biologica para ambos peptídeos;

CONCLUSÕES

Podem prevenir a ação de algumas exoproteinases sobre os peptídeos;

Os peptídeos Polybines I e II constitutem uma nova família de peptídeos inflamatórios encontrados no veneno de vespas, apresentando em in vivo um bloqueio químico no resíduo N-terminal

(118)

APLICAÇÕES

Espectrometria de Massa x

Análise Proteômica

APLICA

Ç

ÕES

Espectrometria de Massa x

An

(119)

“análise de PROTeínas expressas

(120)

separação sistemática Identificação quantificação

PROTEOMA

conjunto de Proteínas 1 amostra

(121)

“análise de PROTeínas expressas por um genOMA”

(122)

PROTEOMA

“análise de PROTeínas expressas por um genOMA”

(123)

GENOMA

PROTEOMA

Representa a soma de todos os genes de um organismo

Não é uma característica fixa no organismo

(124)

O material genético pode ser expresso de várias maneiras “Splicing” do RNAm

Modificações pós-traducionais

(125)

PROTEOMA

Todas as proteínas expressas por um genoma

Atualmente

Metodologia que objetiva documentar a distribuição geral de proteínas de uma amostra, identificar e caracterizar

proteínas individuais e principalmente elucidar as suas associações e funções

(126)

Estudo comparativo de venenos: A gravidade dos acidentes ofídicos causados por serpentes

do gênero Bothrops atrox das regiões de Manaus e da Fronteira Brasil- Colômbia são diferentes. O

mesmo ocorre com diferentes espé cies de aranhas do gênero

Loxosceles.

identificação de proteínas de interesse biotecnológico e

(127)

Espectrometria de massas e/ou Sequenciamento Automático (Química Degradativa de Edman)

SEQUENCIAMENTO PEPT

(128)

(129)

Bancos de Dados Programas de Busca

(Ferramentas de Bioinformática)

Dados oriundos da Espectrometria de Massas e Eletroforese Bidimensional

BIOINFORM

(130)

130 Relatório de um Espectrômetro de Massas do tipo ToF-ToF

(131)

Proteoma da geléia real e do veneno da abelha Apis mellifera

Proteoma do veneno de vespa Polybia paulista

PROTEOMA DESCRITIVO

Identificação das proteínas mais abundantes da amostra analisada, a fim de compreender os mecanismos de ação

(132)

Veneno total 92 spots

Identificação das proteínas do veneno de abelhas Africanizadas (Apis mellifera L.) imunoreativas ao soro antiveneno por abordagem proteômica

16 proteínas identificadas:

Fosfolipases Metaloproteases

(133)

Proteínas imunoreativas Proteínas não imunoreativas Ácidas Básicas 210 spots 72 spots 111 spots 43 spots comuns Total: 239 spots diferentes

Extratos específicos para diagnóstico e tratamento

(134)

Gel de Eletroforese Bidimensional em SDS-PAGE 15%(m/v) do veneno da vespa social Polybia

paulista. As proteínas foram focalizadas em fitas de pI de 3 a 10, com 13 cm de comprimento.

(135)

IMUNODETECÇÃO

Soros dos pacientes sensibilizados com o veneno da vespa Polybia paulista x Veneno da vespa P. paulista

16 proteínas imunoreativas

* 1º Relato: Identificação de antígenos clássicos e suas isoformas

Extratos específicos para diagnóstico e tratamento

(136)

Câncer de Cabeça e Pescoço

Tecido Sadio Tecido Doente

kDa 50 40 30 25 pI 3.0 10.0 pI 3.0 10.0

PROTEOMA DE EXPRESSÃO DIFERENCIAL

(137)

Softwares para Tratamento e Análise de Géis 2D

(138)

Planta Sadia Planta Doente kDa 50 40 30 25 pI 4.0 5.9 4.0 5.9

(139)

PROTEOMA DE MAPEAMENTO

A identificação de proteínas e suas atividades em organelas, refletindo a atuação das mesmas (funções), o qual promove a visualização das proteínas (distribuição espacial celular) e se elas estão ativas.

Wu et al (2000) identificou várias classes de proteínas envolvidas na regulação da fusão de membranas e secreção utilizando eletroforese 2D e Espectrometria de Massas

Obtenção de um screening

funcional entre estados

diferentes dos retículos

endoplasmáticos de glândulas mamárias de ratos.

(140)

SHOT GUN

(141)

MALDI IMAGING

(142)

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