Proteínas expressas diferencialmente em hemócitos do camarão branco,
Litopenaeus vannamei (BOONE, 1931), infectado com o vírus da síndrome da
mancha branca (WSSV)
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial para à obtenção do título de Doutor em Aquicultura.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Risoleta Freire Marques
Florianópolis
Proteínas expressas diferencialmente em hemócitos do camarão branco,
Litopenaeus vannamei (BOONE, 1931), infectado com o vírus da síndrome da
mancha branca (WSSV)
O presente trabalho em nível de doutorado foi avaliado e aprovado por banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Profa. Maria Risoleta Freire Marques, Dra. Universidade Federal de Santa Catarina
Prof. Felipe do Nascimento Vieira, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Prof. Guilherme de Toledo e Silva, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Prof. Guilherme Razzera Maciel, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Prof. José Camillo Novello, Dr. Universidade Estadual de Campinas
Sérgio Winckler da Costa, Dr.
Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina
Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado adequado para obtenção do título de doutora em Aquicultura.
__________________________________ Profa. Dra. Leila Hayashi
Coordenadora do Programa
__________________________________ Profa. Dra. Maria Risoleta Freire Marques
Orientadora
Florianópolis, 29 de fevereiro de 2016
Maria Risoleta Freire Marques:02506029893
Digitally signed by Maria Risoleta Freire Marques:02506029893 Date: 2019.08.23 10:46:59 -03'00' Digitally signed by Leila Hayashi:26459401888 Date: 2019.08.26 10:11:02 -03'00'
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Agradeço inicialmente ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura da UFSC (PPGAQI/UFSC), através do qual obtive ensinamentos que contribuíram para o meu desenvolvimento pessoal, acadêmico e profissional.
À equipe administrativa do PPGAQI/UFSC, em especial ao Carlito Aloísio Klunk, pela gentileza, atenção, força e amizade.
Meu agradecimento especial a minha orientadora, Profa. Dra. Maria Risoleta Freire Marques, que me acompanha desde o mestrado, pela orientação recebida, incentivo, dedicação, disponibilidade, amizade e compreensão nas etapas mais árduas da pesquisa e da vida.
Agradeço também, a todos os membros do Laboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquática e Imunoquímica (LABCAI/UFSC), que tanto me orgulho de ter feito parte, pela receptividade, acolhimento, amizade, incentivo e auxílio durante a realização do doutorado. Aprendi muito com vocês.
À Banca Examinadora, formada por professores que admiro academicamente e respeito pessoalmente. Muito obrigada por dedicar seu tempo para leitura e compartilhar seus conhecimentos para o aprimoramento da tese.
Ao Laboratório de Camarões Marinhos (LCM/UFSC), e a todos seus colaboradores pela disponibilidade em ceder gentilmente os camarões utilizados em alguns ensaios desta pesquisa.
Agradeço também a todos os membros e colaboradores do Núcleo de Estudos em Patologia Aquícola (NEPAQ/UFSC), em especial ao Seu Keka, pela amizade, apoio e incentivo recebido durante o desenvolvimento do trabalho.
Ao Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal (LFDGV/UFSC) pela digitalização das imagens dos géis.
Ao Centro de Espectrometria de Massa da UFSC (CEBIME/UFSC) pela disponibilidade para realização das análises de detecção por MALDI-TOF.
A CAPES, ao CNPq e ao FINEP pelo suporte financeiro, imprescindível ao desenvolvimento deste trabalho.
Aos meus pais, gratidão por tudo!
Por fim, agradeço a todos aqueles que estiveram presentes direta ou indiretamente durante o desenvolvimento do meu doutorado. O apoio de todos foi fundamental para a conclusão desta importante etapa da minha vida.
O vírus da síndrome da mancha branca (white spot syndrome virus, WSSV) é considerado como o vírus mais devastador para camarões cultivados, estando associado com grandes perdas econômicas registradas na carcinicultura mundial. A proteômica permite a determinação do perfil diferencial de proteínas expressas em diferentes condições metabólicas, bem como frente à exposição a agentes estressores, agentes patogênicos e contaminantes. Neste estudo a análise proteômica foi aplicada na investigação das respostas moleculares do camarão branco do Pacífico, Litopenaeus vannamei, frente à infecção pelo WSSV, buscando fornecer subsídios para o delineamento de estratégias eficazes para minimizar o impacto do vírus nos cultivos. Camarões, L. vannamei, livres de patógenos específicos (Shrimp Pathogen Free, SPF) (n=180), com aproximadamente 13,0±0,5 g, foram aclimatados em aquários individuais (n=1/aquário), e, após a coleta de hemolinfa, e nova aclimatação, foram infectados, experimentalmente, com um inóculo, contendo 1,3 x 104 cópias virais do WSSV. Os camarões sobreviventes, 56 dias após
a infecção experimental (6%), foram classificados como camarões mais tolerantes (grupo Tolerantes = T), enquanto que os primeiros camarões a apresentar os sinais da doença, e morrer, foram classificados como mais susceptíveis ao WSSV (grupo Susceptíveis = S). Os hemócitos dos camarões T e S, obtidos a partir das amostras de hemolinfa coletadas antes da infecção experimental, foram submetidos à análise proteômica, objetivando a determinação do perfil diferencial de proteínas expressas nessas células nos dois grupos (T versus S no tempo zero, T0, antes da infecção: T0T x T0S) – Capítulo 1. Paralelamente, os hemócitos dos camarões mais tolerantes, obtidos das amostras de hemolinfa coletadas antes e após a infecção experimental, foram submetidos à análise proteômica, objetivando a determinação do perfil diferencial de proteínas expressas nessas células nos camarões mais tolerantes (T no tempo zero, T0, antes da infecção versus T no tempo final do desafio experimental, TF, após a infecção: T0T x TFT) – Capítulo 2. Um total de 73 spots protéicos diferencialmente expressos (p<0,05) foram selecionados para identificação por espectrometria de massa (MALDI-TOF/PMF). Destes, 65 mostraram correspondência com proteínas que, uma vez identificadas e classificadas de acordo com as anotações no Gene Ontology, foram relacionadas a processos biológicos e funções moleculares envolvendo respostas do sitema imune inato, metabolismo energético e/ou regulação enzimática, metabolismo de carboidratos, estrutura e integridade celular, transporte citoplasmático/ endossomal, mediadores de transdução de sinal, transcrição, enovelamento correto de proteínas, regulação da expressão gênica, excreção de moléculas tóxicas e transporte de moléculas pouco solúveis, mediação da entrada de íons de cálcio, sinalização intracelular, diferenciação e proliferação celular, apoptose, entre outros. O possível significado do envolvimento de algumas dessas proteínas na resposta do hospedeiro ao WSSV foi discutido e um total de treze alvos protéicos distintos foram propostos como potenciais biomarcadores moleculares de tolerância/susceptibilidade ao vírus. Esses potenciais biomarcadores moleculares são apontados neste estudo como indicadores, e/ou como possíveis ferramentas, para o monitoramento dos cultivos e/ou, ainda, para a seleção de camarões reprodutores com maior grau de tolerância ao WSSV.
The white spot syndrome virus (WSSV) is considered as the most devastating virus for farmed shrimp and has been associated to huge economical losses worldwide. Proteomics allows the determination of the differential profile of expressed proteins under different metabolic conditions, as well as upon the exposure to stress, pathogenic agents and contaminants. Herein, proteomic analysis was used as a tool to investigate the molecular responses of the Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei, towards the infection by WSSV, in order to furnish data to outline strategies to minimize the impact of the virus in farmed shrimp. Shrimp, L. vannamei, specific pathogen free (SPF) (n=180), of 13.0 ± 0.5 g, were individually acclimated (n=1/aquarium) and, after having hemolymph collected and being submitted to a new acclimation, were experimentally infected with a WSSV inoculum (1.3 x 104 viral
copies). After 56 days post-infection, shrimp that survived (6%) were classified as more tolerant (Tolerant Group = T), whereas those who first displayed external signs of the infection and died were classified as susceptible to WSSV (Susceptible Group = S).The hemocytes of shrimp from group T and group S, obtained from hemolymph collected before the experimental infection, were submitted to proteomic analysis aiming to determine the differential profile of the expressed proteins in these cells in both groups ((T versus S at time zero, T0, before infection: T0T x T0S) – Chapter 1. Likewise, hemocytes from group S, obtained from hemolymph collected before and after the experimental infection, were used for proteomic analysis, in order to determine the differential profile of expressed proteins in these cells of S shrimp (T at time zero, T0, before the infection versus T at the end of the viral challenge, TF, after the infection, T0T x TFT) – Chapter 2. A total of 73 differentially expressed protein spots (p<0.05) were selected for identification by mass spectrometry (MALDI-TOF / PMF). Among those, 65 proteins were identified and classified according to the annotations of Gene Ontology and showed to be related to several biological processes and molecular functions, such as responses of the innate immune system, energy metabolism and/ or enzymatic regulation, carbohydrate metabolism, cellular structure and integrity, cytoplasmic/ endossomal transport, mediators of signaling transduction pathway, transcription, correct protein folding, gene expression regulation, excretion of toxic molecules and transport of poorly soluble molecules, calcium ion transport mediation, intracellular signaling, cell differentiation and proliferation, apoptosis, among others. The possible relevance of the role of some of these proteins in the host response to WSSV was discussed and a total of 13 distinct protein targets were proposed as potential molecular biomarkers of tolerance/ susceptibility to the virus. These potential molecular biomarkers could be used as indicators and/ or as tools for monitoring farmed shrimp and/ or for selecting shrimp with higher tolerance to WSSV.
Keywords: Aquaculture. Proteomics. WSSV. Shrimp. Biomarkers.
Figura 1 - Gel de agarose representativo do resultado da PCR nested para detecção do WSSV em amostras dos espécimes de L.vannamei, utilizados no presente estudo, ao final do primeiro período de aclimatação. 1-10) Animais negativos para o WSSV, C-) Controle negativo (H2O), C+) Controle positivo (camarão positivo para WSSV) e
MK) marcador de peso molecular. O tamanho do fragmento esperado corresponde a 941 pares de base (pb). ... 34 Figura 2 - Gel de agarose (2%) representativo do resultado da reação de PCR
para a detecção da sequência genômica alvo do IHHNV em amostras dos espécimes de L.vannamei, utilizados no presente estudo, ao final do primeiro período de aclimatação. 1–10) Animais negativos para o IHHNV; C+) Controle positivo; C-) Controle negativo (H2O); C+)
Controle positivo (camarão positivo para IHHNV) e MK) marcador de peso molecular. O tamanho do fragmento esperado corresponde a 512 pares de base (pb). ... 35 Figura 3 - Mortalidade acumulada (%) de camarões L. vannamei durante o
período de infecção experimental com o WSSV. ... 36 Figura 4 - Quantificação da carga viral (cópias de WSSV/µL) em camarões L.
vannamei ao longo do período de infecção experimental. ... 38 Figura 5 - Géis 2-DE representativos do perfil de proteínas de hemócitos de
Litopenaeus vannamei saudáveis, antes da infecção experimental (T0). (T0T) - Grupo T0 tolerantes ao WSSV; (T0S) - Grupo T0 susceptíveis ao WSSV. A faixa de pH da focalização isoelétrica (1ª. dimensão) e os valores correspondentes à massa molecular em kDa (2ª. dimensão) estão mostrados. ... 41 Figura 6 - Géis 2-DE, de proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei
saudáveis, antes da infecção experimental (T0), representativos dos spots protéicos presentes em ambos os grupos, (T0T) - Grupo T0 tolerantes ao WSSV e (T0S) - Grupo T0 susceptíveis ao WSSV mas, com maior expressão nos animais susceptíveis ao WSSV (p<0,05). Triângulos indicam spots que foram selecionados para identificação: triângulos ▲indicam spots maior expressão enquanto, que triângulos▼
focalização isoelétrica (1ª. dimensão) e os valores correspondentes à massa molecular em kDa (2ª. dimensão) estão mostrados... 42 Figura 7 - Géis 2-DE, de proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei
saudáveis, antes da infecção experimental (T0), representativos dos spots protéicos presentes em ambos os grupos, (T0T) - Grupo T0 tolerantes ao WSSV e (T0S) - Grupo T0 susceptíveis ao WSSV mas, com maior expressão nos animais tolerantes ao WSSV (p<0,05). Triângulos indicam spots que foram selecionados para identificação: triângulos ▲indicam spots maior expressão enquanto, que triângulos▼ indicam spots protéicos com menor expressão A faixa de pH da focalização isoelétrica (1ª. dimensão) e os valores correspondentes à massa molecular em kDa (2ª. dimensão) estão mostrados... 49 Figura 8 - Géis 2-DE, de proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei
saudáveis, antes da infecção experimental (T0), representativos dos grupos, (T0T) - Grupo T0 tolerantes ao WSSV e (T0S) - Grupo T0 susceptíveis ao WSSV mas, com expressão exclusiva, de alguns spots protéicos, apenas nos animais susceptíveis ao WSSV (p<0,05). Círculos contínuos indicam spots que foram selecionados para identificação enquanto, que círculos pontilhados indicam a ausência de spots na posição correspondente. A faixa de pH da focalização isoelétrica (1ª. dimensão) e os valores correspondentes à massa molecular em kDa (2ª. dimensão) estão mostrados. ... 52 Figura 9 - Géis 2-DE, de proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei
saudáveis, antes da infecção experimental (T0), representativos dos grupos, (T0T) - Grupo T0 tolerantes ao WSSV e (T0S) - Grupo T0 susceptíveis ao WSSV mas, com expressão exclusiva, de alguns spots protéicos, apenas nos animais tolerantes ao WSSV (p<0,05). Círculos contínuos indicam spots que foram selecionados para identificação enquanto, que círculos pontilhados indicam a ausência de spots na posição correspondente. A faixa de pH da focalização isoelétrica (1ª. dimensão) e os valores correspondentes à massa molecular em kDa (2ª. dimensão) estão mostrados. ... 55
detecção do WSSV em amostras dos espécimes de L.vannamei, utilizados no presente estudo, ao final do primeiro período de aclimatação. 1-10) Animais negativos para o WSSV, C-) Controle negativo (H2O), C+) Controle positivo (camarão positivo para WSSV) e
MK) marcador de peso molecular. O tamanho do fragmento esperado corresponde a 941 pares de base (pb). ... 84 Figura 11 - Gel de agarose (2%) representativo do resultado da reação de PCR
para a detecção da sequência genômica alvo do IHHNV em amostras dos espécimes de L.vannamei, utilizados no presente estudo, ao final do primeiro período de aclimatação. 1–10) Animais negativos para o IHHNV; C+) Controle positivo; C-) Controle negativo (H2O); C+)
Controle positivo (camarão positivo para IHHNV) e MK) marcador de peso molecular. O tamanho do fragmento esperado corresponde a 512 pares de base (pb). ... 84 Figura 12 - Mortalidade cumulativa (%) de camarões L. vannamei durante o
período de infecção experimental com o WSSV. ... 86 Figura 13 - Quantificação da carga viral (cópias de WSSV/µL) em camarões L.
vannamei ao longo do período de infecção experimental. ... 88 Figura 14 - Géis 2-DE representativos do perfil de proteínas de hemócitos de
Litopenaeus vannamei, tolerantes ao WSSV. (T0T) – camarões tolerantes, antes do desafio com o vírus da mancha branca (WSSV) (tempo zero; T0); (TFT) – camarões tolerantes, após o desafio com o WSSV, ao final do experimento (TF) de 56 dias. A faixa de pH da focalização isoelétrica (1ª. dimensão) e os valores correspondentes à massa molecular em kDa (2ª. dimensão) estão mostrados... 90 Figura 15 - Géis 2-DE, de proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei,
tolerantes ao vírus da mancha branca (WSSV), presentes em ambos os grupos, (T0T) – hemócitos coletados de camarões tolerantes, antes do desafio com WSSV (tempo zero; T0) e (TFT) – hemócitos coletados dos mesmos camarões tolerantes, após o desafio com o WSSV, ao final do experimento de 56 dias (tempo final; TF). Triângulos▲ indicam spots protéicos com maior expressão nos hemócitos coletados dos camarões tolerantes, antes do desafio com WSSV (T0T) enquanto que,
hemócitos coletados dos camarões tolerantes, após o desafio com o WSSV, ao final do experimento (TFT) (p<0,05). Triângulos ▲também indicam spots protéicos que foram selecionados para identificação. A faixa de pH da focalização isoelétrica (1ª. dimensão) e os valores correspondentes à massa molecular em kDa (2ª. dimensão) estão mostrados. ... 92 Figura 16 - Géis 2-DE, de proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei,
tolerantes ao vírus da mancha branca (WSSV), presentes em ambos os grupos, (T0T) – hemócitos coletados de camarões tolerantes, antes do desafio com WSSV (tempo zero; T0) e (TFT) – hemócitos coletados dos mesmos camarões tolerantes, após o desafio com o WSSV, ao final do experimento de 56 dias (tempo final; TF). Triângulos▲ indicam spots protéicos com maior expressão nos hemócitos coletados dos camarões tolerantes após o desafio com o WSSV, ao final do experimento (TFT) enquanto que, triângulos▼ indicam spots protéicos com menor expressão nos hemócitos coletados dos camarões tolerantes, antes do desafio com WSSV (T0T) (p<0,05). Triângulos ▲também indicam spots protéicos que foram selecionados para identificação. A faixa de pH da focalização isoelétrica (1ª. dimensão) e os valores correspondentes à massa molecular em kDa (2ª. dimensão) estão mostrados. ... 95 Figura 17 - Géis 2-DE, de proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei,
tolerantes ao vírus da mancha branca (WSSV). (T0T) – hemócitos coletados de camarões tolerantes, antes do desafio com WSSV (tempo zero; T0) e (TFT) – hemócitos coletados dos mesmos camarões tolerantes, após o desafio com o WSSV, ao final do experimento de 56 dias (tempo final; TF). Círculos contínuos indicam a expressão de spots protéicos apenas nos hemócitos coletados de camarões tolerantes, antes do desafio com WSSV (tempo zero; T0) (T0T) enquanto que, círculos pontilhados indicam a ausência dos spots na posição correspondente. Círculos contínuos indicam também os spots selecionados para identificação. A faixa de pH da focalização
molecular em kDa (2ª. dimensão) estão mostrados. ... 99 Figura 18 - Géis 2-DE, de proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei,
tolerantes ao vírus da mancha branca (WSSV). (T0T) – hemócitos coletados de camarões tolerantes, antes do desafio com WSSV (tempo zero; T0) e (TFT) – hemócitos coletados dos mesmos camarões tolerantes, após o desafio com o WSSV, ao final do experimento de 56 dias (tempo final; TF). Círculos contínuos indicam a expressão de spots protéicos apenas nos hemócitos coletados de camarões tolerantes após o desafio com o WSSV, ao final do experimento (TFT) enquanto que, círculos pontilhados indicam a ausência dos spots na posição correspondente. Círculos contínuos indicam também os spots selecionados para identificação. A faixa de pH da focalização isoelétrica (1ª. dimensão) e os valores correspondentes à massa molecular em kDa (2ª. dimensão) estão mostrados. ... 102
Tabela 1 - Proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei saudáveis com maior expressão nos animais susceptíveis ao WSSV. ... 43 Tabela 2 - Proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei saudáveis com
maior expressão nos animais tolerantes ao WSSV. ... 50 Tabela 3 - Proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei saudáveis com
expressão exclusiva aos animais susceptíveis ao WSSV. ... 53 Tabela 4 - Proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei saudáveis com
expressão exclusiva aos animais tolerantes ao WSSV. ... 56 Tabela 5 - Proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei, tolerantes ao
WSSV, com maior expressão nos animais saudáveis, antes da infecção experimental. ... 92 Tabela 6 - Tabela 6. Proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei,
tolerantes ao WSSV, com maior expressão nos animais infectados experimentalmente. ... 96 Tabela 7 - Proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei, tolerantes ao
WSSV, com expressão exclusiva nos animais saudáveis, antes da infecção experimental. ... 100 Tabela 8 - Proteínas de hemócitos de Litopenaeus vannamei, tolerantes ao
WSSV, com expressão exclusiva nos animais infectados experimentalmente. ... 102
ACN - Acetonitrila
BSA - Albumina Bovina Sérica
CBB - Azul de Coomassie Brilhante G-250
CHAPS - 3 - [(3-Cholamidopropyl)dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propanesulfonato CTAB - Brometo de cetil-trimetilamônio
dNTP - Desoxirribonucleotídio trifosfatado DTT - Ditiotreitol
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético IEF - Focalização Isoelétrica
IHHNV - Vírus da Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética IMNV - Vírus da Mionecrose Infecciosa
MALDI-TOF - Dessorção/ionização a laser em matriz assistida - tempo de voo MS - Espectrometria de massas
MW - Massa molecular
OIE - Organização Internacional de Epizootias PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida PCR - Reação em cadeia da polimerase PCR nested - PCR de dois passos
PGBP - proteína de reconhecimento/ligação de peptidoglicana PMF - Impressão digital de peptídeo
Pool - Amostra composta Primer - Iniciador
proPO - Pró-fenoloxidase PSA - Persulfato de amônia qPCR - PCR em tempo real SDS - Dodecil sulfato de sódio SPF - Livre de patógenos específicos Spot - Ponto que delimita proteínas Strip - Tira desidratada de poliacrilamida TEMED - Tetrametiletilenodiamina TFA - Ácido trifluoracético
WSS - Síndrome da Mancha Branca
WSSV - Vírus da Síndrome da Mancha Branca YHV - Vírus da Cabeça Amarela
CAPÍTULO 1
Proteínas diferencialmente expressas em hemócitos de camarões Litopenaeus vannamei saudáveis, tolerantes e susceptíveis a infecção pelo
vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) ... 21
1 NTRODUÇÃO ... 21 2 JUSTIFICATIVA ... 22 3 OBJETIVOS ... 22 3.1 OBJETIVO GERAL ... 22 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 22 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 23 4.1 MATERIAL BIOLÓGICO ... 23 4.2 COLETA DE HEMOLINFA ... 23
4.3 COMPROVAÇÃO DA AUSÊNCIA DE INFECÇÕES VIRAIS ESPECÍFICAS . 24 4.3.1 Extração de DNA ... 24
4.3.2 PCR nested para detecção do WSSV ... 24
4.3.3 PCR para detecção do IHHNV ... 25
4.3.4 Eletroforese para visualização dos resultados ... 25
4.4 INFECÇÃO EXPERIMENTAL ... 26
4.4.1 Preparação do inóculo ... 26
4.4.2 Infecção experimental com WSSV ... 26
4.4.3 Extração de DNA ... 27
4.4.4 PCR em Tempo Real (qPCR) para determinação da carga viral ... 27
4.4.5 Identificação dos grupos de animais susceptíveis e tolerantes ao WSSV... ... 28
4.5 ANÁLISE PROTEÔMICA ... 28
4.5.1 Extração de proteínas ... 28
4.5.2 Quantificação de proteínas ... 29
4.5.3 Reidratação dos Strips ... 29
4.5.6 Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE) - 2º
Dimensão ... 30
4.5.7 Método de coloração ... 31
4.5.8 Análise das imagens dos géis ... 31
4.5.9 Digestão da proteína em gel ... 32
4.5.10 MALDI-TOF/PMF ... 33
4.6 PAPEL FUNCIONAL DAS PROTEÍNAS IDENTIFICADAS ... 33
4.7 POTENCIAIS BIOMARCADORES ... 34
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 34
5.1 COMPROVAÇÃO DA AUSÊNCIA DE INFECÇÕES VIRAIS ESPECÍFICAS . 34 5.1.1 PCR nested para detecção do WSSV ... 34
5.1.2 PCR para detecção do IHHNV ... 35
5.2 QUALIDADE DA ÁGUA ... 35
5.3 MORTALIDADE ACUMULADA APÓS A INFECÇÃO EXPERIMENTAL COM O WSSV ... 36
5.4 PCR EM TEMPO REAL (qPCR) PARA DETERMINAÇÃO DA CARGA VIRAL .. ... 38
5.5 COMPARAÇÃO DO PERFIL DE PROTEÍNAS EXPRESSAS EM HEMÓCITOS DE Litopenaeus vannamei TOLERANTES E SUSCEPTÍVEIS AO WSSV.. ... 40
5.5.1 MALDI-TOF/PMF ... 41
5.6 IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSAS EM HEMÓCITOS DE Litopenaeus vannamei TOLERANTES E SUSCEPTÍVEIS AO WSSV... 41
5.6.1 Proteínas com maior expressão em hemócitos de Litopenaeus vannamei susceptíveis ao WSSV ... 42
5.6.2 Proteínas com maior expressão em hemócitos de Litopenaeus vannamei tolerantes ao WSSV ... 49
5.6.3 Proteínas exclusivamente expressas em hemócitos de Litopenaeus vannamei susceptíveis ao WSSV ... 52
vannamei tolerantes ao WSSV ... 55
6 CONCLUSÕES ... 58
REFERÊNCIAS ... 62
CAPÍTULO 2 Proteínas diferencialmente expressas em hemócitos de camarões Litopenaeus vannamei tolerantes a infecção pelo vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) ... 68 1 INTRODUÇÃO ... 68 2 JUSTIFICATIVA ... 69 3 OBJETIVOS ... 70 3.1 OBJETIVO GERAL ... 70 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 70 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 70 4.1 MATERIAL BIOLÓGICO ... 70 4.2 COLETA DE HEMOLINFA ... 71
4.3 COMPROVAÇÃO DA AUSÊNCIA DE INFECÇÕES VIRAIS ESPECÍFICAS . 71 4.3.1 Extração de DNA ... 72
4.3.2 PCR nested para detecção do WSSV ... 72
4.3.3 PCR para detecção do IHHNV ... 73
4.3.4 Eletroforese para visualização dos resultados ... 73
4.4 INFECÇÃO EXPERIMENTAL ... 74
4.4.1 Preparação do inóculo ... 74
4.4.2 Infecção experimental com WSSV ... 74
4.4.3 Extração de DNA ... 75
4.4.4 PCR em Tempo Real (qPCR) para determinação da carga viral ... 75
4.4.5 Identificação dos grupos de animais susceptíveis e tolerantes ao WSSV ... 76
4.5 ANÁLISE PROTEÔMICA ... 76
4.5.1 Extração de proteínas ... 77
4.5.4 Focalização Isoelétrica (IEF) – 1º Dimensão... 78
4.5.5 Tratamento do strip com DTT e Iodoacetamida ... 79
4.5.6 Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE) – 2º Dimensão ... 79
4.5.7 Método de coloração ... 80
4.5.8 Análise das imagens dos géis ... 80
4.5.9 Digestão da proteína em gel ... 81
4.5.10 MALDI-TOF/PMF ... 82
4.6 PAPEL FUNCIONAL DAS PROTEÍNAS IDENTIFICADAS ... 82
4.7 POTENCIAIS BIOMARCADORES ... 83
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 83
5.1 COMPROVAÇÃO DA AUSÊNCIA DE INFECÇÕES VIRAIS ESPECÍFICAS . 83 5.1.1 PCR nested para detecção do WSSV ... 83
5.1.2 PCR para detecção do IHHNV ... 84
5.2 QUALIDADE DA ÁGUA ... 85
5.3 MORTALIDADE ACUMULADA APÓS A INFECÇÃO EXPERIMENTAL COM O WSSV ... 85
5.4 PCR EM TEMPO REAL (qPCR) PARA DETERMINAÇÃO DA CARGA VIRAL ... 87
5.5 ANÁLISE COMPARATIVA DAS PROTEÍNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSAS ENTRE CAMARÕES TOLERANTES AO WSSV, ANTES E APÓS A INFECÇÃO ... 89
5.5.1 MALDI-TOF/PMF ... 90
5.6 IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSAS EM HEMÓCITOS DE Litopenaeus vannamei TOLERANTES AO WSSV. ... 91
5.6.1 Proteínas com maior expressão em hemócitos de Litopenaeus vannamei tolerantes ao WSSV, antes da infecção ... 92
5.6.2 Proteínas com maior expressão em hemócitos de Litopenaeus vannamei tolerantes ao WSSV, após a infecção ... 95
5.6.3 Proteínas exclusivamente expressas em hemócitos de Litopenaeus vannamei tolerantes ao WSSV, antes da infecção ... 99
vannamei tolerantes ao WSSV, após a infecção ... 102
6 CONCLUSÕES ... 104
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 112
8 PERSPECTIVAS ... 113
CAPÍTULO 1
Proteínas diferencialmente expressas em hemócitos de camarões Litopenaeus vannamei saudáveis, tolerantes e susceptíveis a infecção pelo vírus da síndrome da mancha branca (WSSV)
1 INTRODUÇÃO
Os camarões são uma das espécies mais importantes economicamente na aquicultura, devido à crescente demanda mundial. Entretanto, o rápido crescimento de sua produção aquícola, em larga escala e em alta densidade, tem desencadeado problemas severos no manejo das doenças que afetam estes crustáceos (SOMBOONWIWAT et al., 2010; SMITH & HAUTON, 2009; FIGUEIREDO et al., 2008).
O vírus da síndrome da mancha branca (white spot syndrome virus, WSSV) é considerado o mais devastador para camarões cultivados, estando associado com grandes perdas econômicas registradas na carcinicultura mundial (WANG et al., 2007).
A síndrome da mancha branca (white spot syndrome, WSS) é uma doença altamente infecciosa que afeta importantes espécies de camarão cultivado em programas de dimensões comerciais em diferentes regiões geográficas. Ainda hoje, permanece um grande interesse econômico no desenvolvimento de uma linhagem de camarão que apresente melhor resistência ao patógeno, uma vez que, diferentes relatos apontam na direção de uma variação individual na suscetibilidade ao WSSV em populações de L.vannamei, o que sugere a possibilidade da identificação de potenciais marcadores moleculares associados a uma maior tolerância ao vírus.
Um melhor entendimento dos mecanismos de defesa de camarões peneídeos é fundamental como contribuição para o desenvolvimento de estratégias para o controle das doenças, bem como para a sustentabilidade dos cultivos de camarão (LIU et al., 2011).
Estudos investigativos envolvendo os aspectos moleculares da interação vírus-hospedeiro em camarões podem prover novas idéias acerca das diferenças das respostas moleculares frente a infecções virais entre vertebrados e artrópodes (FLEGEL, 2007). A proposta desses estudos tem destacado como foco principal a caracterização de efetores imunes através da análise dos seus níveis de expressão em vários tecidos, sob condições normais ou, após desafio viral (FLEGEL, SRITUNIALUCKSANA, 2011).
Neste contexto, a análise proteômica pode ser de particular relevância na identificação da estrutura, e das respectivas sequências, de efetores proteicos presentes na hemolinfa, determinando sua participação na resposta imune de crustáceos (FLEGEL, SRITUNIALUCKSANA, 2011; SIRIPAVEE et al., 2005).
2 JUSTIFICATIVA
A caracterização e a identificação de proteínas envolvidas nestas respostas de defesa, bem como nas alterações metabólicas associadas com o estado patológico, constituem uma etapa fundamental deste e de outros estudos recentes. A partir da identificação de proteínas que possam estar relacionadas com a menor susceptibilidade ao WSSV, pode-se buscar os genes que as codificam e, consequentemente, identificar marcadores moleculares potenciais, os quais poderão ser utilizados como ferramenta na busca e no desenvolvimento de estratégias eficazes de manejo da doença, no melhoramento genético de camarões Litopenaeus vannamei, baseado em seleção assistida por marcadores genéticos, além de poder contribuir para a elucidação dos mecanismos de tolerância e defesa celular.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Identificar proteínas de hemócitos de camarões L. vannamei indicativas de maior tolerância ou susceptibilidade ao Vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV), a fim de contribuir para o delineamento do conjunto das respostas moleculares do hospedeiro associadas a esta doença.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Determinar o perfil diferencial de proteínas expressas em hemócitos de camarões com maior tolerância ou susceptibilidade ao WSSV infectados experimentalmente com este vírus;
b) Identificar e caracterizar as proteínas expressas diferencialmente, visando relacioná-las com vias metabólicas determinadas e/ou respostas de defesa do L. vannamei frente ao agente viral;
c) Propor alvos protéicos como potenciais biomarcadores moleculares a serem utilizados como indicadores e/ou ferramentas para o monitoramento e/ou seleção de camarões com maior grau de tolerância ao WSSV.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL BIOLÓGICO
Um total de cento e oitenta camarões, L. vannamei, com 13 ± 0,5 g, gentilmente cedidos pelo Laboratório de Camarões Marinhos (LCM/UFSC), foram aclimatados em aquários individuais com 2,5 litros de água do mar filtrada e esterilizada. A aclimatação foi realizada sob aeração constante, na temperatura de 25°C e a 20‰ de salinidade, na Sala de Bioensaios do Laboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquática e Imunoquímica (LABCAI/UFSC), por um período de sete dias. Parâmetros como amônia, temperatura, salinidade e pH foram monitorados diariamente e mantidos constantes, dentro dos níveis recomendados para a espécie. Os camarões foram alimentados com ração comercial (35% de proteína) três vezes ao dia (2% da biomassa). Diariamente, foi realizada a renovação de 100% da água dos aquários, sendo restos de ração e fezes removidos por sifonamento.
4.2 COLETA DE HEMOLINFA
Após o período de aclimatação de sete dias, foi realizada a coleta individual de 150 μL de hemolinfa, a partir da região ventral do segundo segmento abdominal, de cada um dos camarões, utilizando seringa de insulina de 1 mL com agulha de 13x3,8mm, contendo 150 μL de solução anticoagulante de Alsever’s modificada (120mM Glicose, 30mM Citrato de Sódio, 9mM EDTA e 380mM NaCl, pH 7,2). A hemolinfa misturada ao anticoagulante (300 μL) foi separada em duas alíquotas. Uma alíquota de 20 μL foi imobilizada em cartão FTA (Bioamerica – Whatman Inc.) para comprovação da condição sanitária dos animais, quanto à ausência de infecções virais, através da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR). A segunda alíquota de 280 μL foi centrifugada a 800 x g durante 10 minutos a 4°C para separação do plasma e dos hemócitos. Os hemócitos precipitados foram lavados duas vezes com solução 10mM PBS (solução salina tamponada) e, em seguida, estocados em freezer a -80 °C para posterior análise proteômica.
Estes mesmos camarões, após novo período de aclimatação de sete dias e, após a comprovação da ausência de enfermidades virais específicas (WSSV e IHHNV), foram submetidos à infecção experimental com o WSSV.
4.3 COMPROVAÇÃO DA AUSÊNCIA DE INFECÇÕES VIRAIS ESPECÍFICAS
A fim de validar o estado sanitário dos camarões, no início do experimento, todos os indivíduos foram amostrados e investigados quanto à presença de sequências genômicas dos vírus WSSV e IHHNV (Infectious Hypordermal and Hematopoietic Necrosis Virus). A seleção dos vírus a serem investigados foi realizada com base no histórico dos registros de enfermidades virais nos cultivos de camarões em Santa Catarina (MOSER, 2005; MARQUES, 2009; COSTA et al., 2010; MOSER et al.,2014).
O diagnóstico de enfermidades virais em camarões de cultivo através de PCR permite a detecção de animais positivos e negativos, tanto para o WSSV e IHHNV, como para outros vírus, e, desta forma, sua separação em grupos distintos para a realização de estudos posteriores, visto que alguns animais têm a capacidade de apresentar infecções virais simples, ou mesmo múltiplas, sem apresentar sinais clínicos aparentes da doença.
4.3.1 Extração de DNA
A extração do DNA genômico foi realizada nas amostras de hemolinfa armazenadas no cartão FTA, conforme recomendações do fabricante. A concentração de DNA das amostras foi determinada em espectrofotômetro (Nanodrop 1000 Thermo Scientific), através da razão de absorbância a 260 e 280 nanômetros. A avaliação do grau de integridade das amostras obtidas foi realizada com base no perfil eletroforético das amostras, visualizado em gel de agarose 1%, corado com GelRed.
4.3.2 PCR nested para detecção do WSSV
A PCR nested (ou PCR de dois passos) foi realizada conforme descrito por Lo et al. (1996), nas condições recomendadas pela OIE (2003). Para a primeira reação de amplificação da sequência genômica específica do WSSV, foram utilizados os iniciadores 146F1 (5'-ACT-ACT-AACTTC-AGC-CTA-TCT-AG-3') e 146R1 (5'-TAA-TGC-GGG-TGT-AAT-GTT-CTT-ACG-A-3'). Foi utilizado 1 μL de DNA extraído para 25 μL de reação, contendo 140
nM de cada iniciador. Após uma desnaturação inicial a 94 ºC por 2 minutos, as amostras foram submetidas a 39 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 30 segundos, anelamento a 55 ºC por 30 segundos e extensão a 72 ºC por 40 segundos. A extensão final foi realizada a 72 ºC por 5 minutos O tamanho do fragmento amplificado, utilizando-se os iniciadores descritos, corresponde a 1447 pb (pares de base). Para o segundo passo da reação (PCR nested), foi utilizado 1 μL do produto da primeira reação em 24 μL de uma nova mistura de reação, substituindo-se o primeiro par de iniciadores pelo segundo: 146F2 (5'-GTA-ACT-GCC-CCT-TCC-ATCTCC-A-3') e 146R2 (5'-TAC-GGC-AGC-TGC-TGC-ACC-TTG-T-3'), na mesma concentração. O protocolo da reação de amplificação utilizado foi o mesmo descrito para o primeiro passo. O tamanho esperado do fragmento amplificado nessa segunda reação corresponde a 941 pb. Controles positivos e negativos foram incluídos em todos os ensaios.
4.3.3 PCR para detecção do IHHNV
Devido à alta prevalência do IHHNV, a presença deste vírus também foi avaliada, para assegurar que as amostras, com as quais o experimento seria desenvolvido, eram negativas para ambos os vírus. Para a reação de amplificação da sequência específica do IHHNV, foram utilizados iniciadores F3 (5'-TCG-GAA-AAC-TGA-ACA-CTG-GCC-T-3') e R2 (5'-CGG-CGT-GTT-CTT-CGT-CTT-CAT-T-3'). Foi utilizado 1 μL de DNA extraído para 25 μL de reação, contendo cada iniciador na concentração de 1μM. Após uma desnaturação inicial a 94 ºC por 3 minutos, as amostras foram submetidas a 30 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 30 segundos, anelamento a 56 ºC por 45 segundos, seguidos de extensão a 72 ºC por 45 segundos. O tamanho do fragmento amplificado, utilizando-se os iniciadores descritos, corresponde a 512 pb (pares de bases). Controles positivos e negativos foram incluídos em todos os ensaios.
4.3.4 Eletroforese para visualização dos resultados
Os produtos amplificados por PCR foram corados com GelRed e submetidos a eletroforese em gel de agarose 2%. O tamanho dos fragmentos visualizados em transluminador, sob luz UV, foi comparado com aqueles de marcadores de peso molecular conhecido (BioLabs).
4.4 INFECÇÃO EXPERIMENTAL
4.4.1 Preparação do inóculo
Inóculo I: Tecidos musculares abdominais de quatro camarões provenientes da Fazenda Pescaria Brava (Laguna/SC), coletados em 15/02/2008, cujo diagnóstico foi positivo para WSSV e negativos para IHHNV (MARQUES, 2008/2009), e que estavam armazenados em freezer -80°C, foram homogeneizados em Tampão PBS 1X (1:3) e centrifugados a 14.000 rpm por 15 minutos a 4°C. O sobrenadante foi transferido para novos tubos e novamente centrifugado. Após ser filtrado em filtro Millipore de 45μm, o sobrenadante foi quantificado em PCR em Tempo Real (qPCR).
Dezoito camarões L. vannamei com aproximadamente 10 gramas, livres de WSSV e IHHNV, foram injetados, utilizando-se seringas de insulina, com 100μL do inóculo I para replicação viral e produção de novo inóculo. Após 96 horas da injeção, o tecido muscular abdominal dos dezoito camarões inoculados foi coletado e armazenado a -80°C.
Inóculo II: O tecido muscular dos camarões infectados com o inóculo I foi macerado em Tampão PBS1x (1:3) e centrifugado a 14.000 rpm por 15 minutos a 4°C. O sobrenadante foi coletado e novamente centrifugado. O sobrenadante foi filtrado em filtro Millipore (0,45μm) e quantificado em PCR em Tempo Real. Alíquotas do inóculo II foram armazenadas em freezer -80°C.
4.4.2 Infecção experimental com WSSV
Cento e oitenta camarões L. vannamei, livres de WSSV e IHHNV, com aproximadamente 13,0±0,5 gramas foram submetidos à infecção experimental com o WSSV.
Os animais foram infectados experimentalmente por injeção intramuscular de 100 μL de inóculo II, contendo 1,3 x 104 cópias virais de WSSV. Os animais, mantidos em aquários
individuais, foram observados diariamente quanto ao comportamento, presença de sinais clínicos externos da doença e mortalidade. Mortalidades foram registradas e os pleópodos dos animais mortos foram coletados para a quantificação e acompanhamento da carga viral através de qPCR ao decorrer do experimento.
No momento em que restava um total de 11 camarões sobreviventes (56 dias a partir da inoculação experimental), foi realizada também a coleta da hemolinfa e dos pleópodos
destes animais, conforme descrito anteriormente. Estes camarões, que representaram 6% dos animais desafiados com o WSSV, foram caracterizados neste estudo como tolerantes (grupo T) enquanto que os demais como susceptíveis (grupo S).
4.4.3 Extração de DNA
A extração do DNA genômico dos pleópodos dos camarões foi realizada conforme protocolo descrito por Moser, 2005. A concentração de DNA foi determinada em espectrofotômetro (Nanodrop 1000 Thermo Scientific), através da razão de absorbância a 260 e 280 nanômetros. A avaliação do grau de integridade das amostras obtidas foi realizada com base no perfil eletroforético, visualizado em gel de agarose 1%, corado com GelRed.
4.4.4 PCR em Tempo Real (qPCR) para determinação da carga viral
A determinação da carga viral do inóculo e dos animais experimentalmente infectados com o WSSV foi realizada por PCR em tempo real (qPCR), com a utilização dos iniciadores WS2F (5’-TGC-CTT-GCC-GGA-AAT-TAG-TGT-GTG-3’) e WS2R (5’-ACA-ACA-TCC-AAC-AAT-GGT-CCC-GTG-3’) (MULLER, 2009). Para a curva padrão foram utilizadas concentrações de 1,0 x 1010 a 1,0 x 100 cópias virais/L. A reação de PCR foi
realizada com o QuantiFast SYBR Green Master Mix (QIAGEN). Os ensaios foram realizados no aparelho Rotor Gene 6000 (Corbett Lifesciences). Todas as amostras foram testadas em duplicata. Foi realizada uma curva de dissociação (melting), através do aumento de 1ºC a cada 5 s, de 72°C a 95°C. Com base na transformação dos os valores brutos de fluorescência em uma escala logarítmica, através do o threshold foi delimitado, baseando-se no coeficiente de correlação (R2) e na eficiência da curva. O valor de CT (Cycle Threshold)
foi determinado como o ciclo em que a amostra cruza o threshold.
O número de cópias virais foi calculado pela interpolação do CT, através da curva padrão experimentalmente determinada. A partir deste número de cópias, o resultado final foi expresso como número médio de cópias WSSV por microlitro de amostra. A especificidade do produto amplificado foi verificada pela análise da curva de melting, com base na temperatura de dissociação de cada produto da qPCR.
4.4.5 Identificação dos grupos de animais susceptíveis e tolerantes ao WSSV
Com base no acompanhamento diário do comportamento dos camarões inoculados com o WSSV, bem como na observação do aspecto externo dos animais e na mortalidade, foram considerados e estabelecidos dois grupos distintos de camarões ao longo do experimento. O grupo de camarões considerados como susceptíveis ao WSSV foi formado pelos animais que não sobreviverem à infecção experimental (grupo S), enquanto que o grupo de camarões tolerantes foi formado pelos animais que sobreviverem à infecção experimental por mais tempo, a partir da inoculação (grupo T).
Com base neste critério, o final do período de aclimatação de cada grupo (antes da infecção experimental) foi considerado como tempo zero (T0). Assim, foi realizada a análise do perfil de proteínas de hemócitos coletados no tempo zero dos tolerantes (T0T), em comparação com o tempo zero dos susceptíveis (T0S), buscando identificar, por análise comparativa, proteínas que, possivelmente, pudessem ser indicativas da condição de maior tolerância ao WSSV, antes do contato com este vírus (ou seja, no período pré-inoculação).
4.5 ANÁLISE PROTEÔMICA
4.5.1 Extração de proteínas
A extração de proteínas foi realizada de acordo com protocolos adaptados de Somboonwiwat et al., (2010) e Chen et al., (2011). Os hemócitos foram ressuspendidos em tampão de lise (7M uréia, 2M tiouréia, 4% CHAPS, e 65mM DTT), suplementado com 2% IPG, 1% Mix Inibidor de proteases e 1% Mix Nucleases (GE Healthcare). As proteínas foram solubilizadas com agitação vigorosa (1.500 rpm) por 4 horas a 4°C, com 2 intervalos para banho ultrassônico refrigerado por 3 minutos cada. Ao final, as amostras foram sonicadas duas vezes durante 20 segundos (2s ON, 5s OFF, 120W). Após centrifugação a 12.000 x g durante 30 minutos a 4° C, o sobrenadante foi coletado e as proteínas precipitadas com quatro volumes de acetona/metanol (3:1) gelados. A mistura foi mantida a – 20ºC por 16 horas para precipitação de proteínas. Após este período, foi realizada uma nova centrifugação 20.000 x g por 20 minutos a 4 °C com subsequente descarte do sobrenadante. O precipitado foi lavado com metanol gelado. Em seguida, o precipitado foi ressuspendido em metanol gelado e agitado (vortex) até adquirir um aspecto de suspensão, sendo novamente centrifugado a
20.000 x g por 5 minutos a 4 °C e o sobrenadante descartado. A lavagem foi realizada no mínimo mais duas vezes. Após lavagem com metanol, o precipitado foi lavado da mesma forma com acetona gelada por duas vezes para retirada de qualquer traço de metanol. O precipitado contendo as proteínas totais foi ressuspendido em acetona contendo 0,1% de DTT e novamente centrifugado a 10.000 x g por 30 minutos a 4 °C e o sobrenadante descartado. O precipitado final foi seco, no máximo 5 minutos em temperatura ambiente, e solubilizado em 270 µL de tampão (7M uréia, 2M tiouréia, 4% CHAPS) acrescido de 1% Mix Inibidor de proteases.
Uma alíquota de 20 μL foi retirada para dosagem de proteínas e o restante da amostra armazenada a -80 °C para os procedimentos posteriores.
4.5.2 Quantificação de proteínas
A concentração de proteínas totais foi determinada pelo método de Bradford (1976) modificado. Como padrão foi utilizado de 0 a 5 µg/µL de Soro Albumina Bovina (BSA). O ensaio foi realizado em triplicata em microplaca com 5 µL de amostra em 45 µL de água com adição de 50 µL de HCl (0,0011 M) e 100 µL de CBB (0,194 mg/mL). A leitura da absorbância a 595 nm foi realizada após 5 minutos de incubação em temperatura ambiente, utilizando o software SoftMax PRO 5.2 em espectrofluorímetro. Com base na comparação das absorbâncias das amostras com aquelas da curva padrão foi determinada a concentração total de proteínas nas amostras.
4.5.3 Reidratação dos Strips
As amostras contendo 470 μg de proteína em tampão (7M uréia, 2M tiouréia, 4% CHAPS), acrescido de 1% Mix Inibidor de proteases, 65 mM DTT, 0,5% IPG e 0,001% azul de bromofenol, foram utilizadas na reidratação de tiras desidratadas de poliacrilamida (strips) de 13 cm, com gradiente de pH imobilizado na faixa entre 3-10 linear (Dry Strip Gels, GE Healthcare) por 16 horas.
Os strips foram produzidos em triplicatas técnicas e biológicas, tanto para o grupo de animais T0 tolerantes (hemócitos coletados antes da infecção com o WSSV de animais tolerantes ao vírus - T0T), quanto para o grupo de animais T0 susceptíveis (hemócitos coletados antes da infecção com o WSSV de animais susceptíveis ao vírus - T0S). Cada strip foi hidratado com proteínas obtidas de hemócitos de três camarões (n=3/strip).
4.5.4 Focalização Isoelétrica (IEF) - 1º Dimensão
Após a reidratação dos strips com as amostras, as mesmas foram submetidas à focalização isoelétrica em sistema Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare). Os strips cobertos com óleo mineral DryStrip Cover Fluid (GE Healthcare®) receberam sobre cada extremidade um
pre-cut eletrode wick (GE Healthcare®) hidratado com 150 µL de água MilliQ para os
eletrodos, de acordo com as recomendações do fabricante.
As condições ou programações utilizadas para as focalizações isoelétricas (IEF) foram realizadas para que as proteínas migrassem sob ação de um campo elétrico no gel de poliacrilamida, com um gradiente de pH até atingirem o seu ponto isoelétrico.
A IEF foi realizada a 20°C com o limite de 50 µA por strip; utilizando os seguintes passos: step (50, 100, 200, 300, 400, 500, 1.000, 2.000, 3.000 V por 3 horas cada), gradiente (4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000 V por 3 horas cada) e uma etapa adicional de 8.000 V por 6 horas (step). Ao final da IEF, os strips foram retirados do Ettan IPGphor 3 e armazenados individualmente em tubos de ensaio fechados em freezer -80 °C, antes do tratamento com DTT e Iodoacetamida.
4.5.5 Tratamento do strip com DTT e Iodoacetamida
Imediatamente antes da segunda dimensão, as proteínas, presentes nos strips e inicialmente separadas de acordo com o seu pI, foram reduzidas em tampão de equilíbrio (6M uréia, 75 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20% glicerol, 2% SDS, 0,002% azul de bromofenol) acrescido de 2% DTT, sob agitação constante durante 20 minutos, de modo a preservar o estado totalmente reduzido de proteínas não alquiladas. Em seguida, a alquilação dos grupos tióis foi realizada em tampão de equilíbrio contendo Iodoacetamida 2,5%, sob agitação constante, por 20 minutos, visando impedir sua re-oxidação durante a eletroforese.
4.5.6 Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE) - 2º Dimensão
Após o equilíbrio, as proteínas imobilizadas nos strips foram submetidas à eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 12,5%, contendo 0,27% N,N' metilenebisacrilamida, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,06% PSA e 0,06% Temed. Os géis foram polimerizados em placas de vidro de 14 x 16 cm, com espessura de 1,5
mm com etiqueta numerada na parte inferior esquerda para identificação e catalogação. Strips e marcadores de massa molecular (High e Low Markers, ambos da GE Healthcare®) foram
aplicados sobre os géis e então, selados com solução de agarose (0,5% agarose, 25 mM Tris-HCl, 192 mM Glicina, 0,1% SDS) aquecida a 70 ºC. A eletroforese foi realizada em sistema SE-600 Ruby (GE Healthcare®) com refrigeração (20°C) em tampão de corrida 1X Laemmli
SDS (25 mM Tris-HCl, 192 mM, Glicina, 0,1% SDS). Inicialmente com 15 mA por gel por 1 hora, para que as proteínas migrassem para o gel de acrilamida e em seguida, foi utilizada amperagem constante de 30 mA por gel e voltagem livre por aproximadamente 8 horas ou até que as amostras migrassem até o final do gel. Ao término da eletroforese, os géis foram retirados das placas de vidro e fixados de acordo com o método de coloração descrito a seguir. Os géis, advindos dos strips, foram produzidos em triplicatas técnicas e biológicas, tanto para o grupo de animais T0T (hemócitos coletados antes da infecção com o WSSV de animais tolerantes ao vírus), quanto para o grupo de animais T0S (hemócitos coletados antes da infecção com o WSSV de animais susceptíveis ao vírus). Cada gel foi composto por proteínas obtidas de hemócitos de três camarões (n=3/gel).
4.5.7 Método de coloração
Para a detecção de proteínas nos géis foi utilizado Coomassie Briliant Blue G-250 (CBB). A coloração com CBB foi realizada a partir de uma adaptação do método descrito por Neuhoff, et al. (1985). Os géis foram fixados por 16 horas em solução contendo 20% Metanol e 1,3% Ácido Fosfórico. Em seguida, foram corados durante 3 dias com Coomassie Blue G-250 0,09%, contendo 7,8% sulfato de amônio, 1,6% ácido fosfórico e 20% metanol. Após descoloração em água e limpeza com Ácido Acético 1%, os géis foram mantidos em Ácido Acético 0,5%.
Após o procedimento de coloração e descoloração, os géis tiveram suas imagens digitalizadas no Image Scanner III (GE healthcare®) e foram mantidos refrigerados a 4 °C e
ao abrigo da luz até as análises posteriores.
4.5.8 Análise das imagens dos géis
As imagens dos géis obtidos das amostras de hemócitos dos animais T0 tolerantes e T0 susceptíveis foram adquiridas no Image Scanner III (GE healthcare®).
Para cada grupo foram utilizadas três amostras com triplicatas, totalizando nove animais para cada tratamento (9 animais para o grupo T0 tolerantes e 9 animais para T0 susceptíveis).
Como parâmetros comparativos para as análises das imagens foram utilizados o pI, a massa molecular aparente (MW), a intensidade, a área e o volume dos spots de acordo com software Image Master Platinum, versão 7.0 (GE Healthcare).
Para identificar spots diferencialmente expressos, a intensidade dos spots do grupo T0 tolerante foi comparada àquela do grupo T0 susceptível ao WSSV através de análise estatística ANOVA, usando um nível de 0,05 de significância. Os spots foram divididos em três categorias, de acordo com seu nível de expressão relativa:
a- expressão exclusiva a um dos dois grupos; b- presentes em ambos os grupos, mas, com nível de expressão aumentado ou diminuído em um deles; c-presentes em ambos os grupos, sem diferenças no nível de expressão.
4.5.9 Digestão da proteína em gel
Os spots de proteína diferencialmente expressos, ou seja, aqueles que apresentaram um padrão qualitativo ou quantitativo distinto nos géis obtidos das amostras dos animais T0 tolerantes em comparação com os animais T0 susceptíveis foram selecionados. Eles foram retirados dos géis e transferidos individualmente para microtubos estéreis. Segundo protocolo de Chai et al. (2010), cada spot foi lavado três vezes com água destilada e descorado com 40% acetonitrila (ACN) em 200 mM de bicarbonato de amônio (pH 8,5) a 37°C por 30 minutos. Cada spot foi então desidratado com ACN por 5 minutos à temperatura ambiente, seco por 15 minutos e reidratado com solução de tripsina, contendo 20 mg/mL de Tripsina, 40 mM de bicarbonato de amônio e 9% ACN, no gelo por 45 min. A solução de tripsina em excesso foi removida e em seguida acrescentado bicarbonato de amônio 40 mM em 9% ACN a 37 °C, sendo, então, mantidos overnight nestas condições.
Após a incubação, o líquido foi transferido para um novo microtubo. Um total de 5 mL de ácido trifluoroacético 0,1% (TFA) em solução de ACN 50% foi adicionado a cada microtubo, no qual foi realizada a incubação prévia do spot, sendo, então, a solução incubada por 30 min. a 37 °C. Finalmente, a solução foi combinada com o bicarbonato de amônio 40 mM em ACN 9%. A mistura líquida foi seca a vácuo, dissolvida em TFA 0,1% e, em seguida, submetida ao MALDI-TOF.
4.5.10 MALDI-TOF/PMF
Os peptídeos, após sua tripsinização, foram misturados 1:1 com 1uL de solução da matriz ácida saturada (5 µg/mL α-ciano-4-ácido hidroxicinamico, ACN 50% e TFA 0,1%), colocados na placa apropriada e cristalizado a temperatura ambiente. Os espectros das proteínas foram obtidos, através de análise por espectrometria de massa (MS), através de ionização e detecção por MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight) no Centro de Espectrometria de Massa da UFSC - CEBIME.
Os dados de MS foram adquiridos com laser, onde 3000 disparos foram acumulados para cada espectro obtido do Autoflex III MALDI-TOF espectrômetro de massa (Bruker Daltonics). O espectrômetro de massa foi ajustado no modo MALDI-TOF impressão digital da massa do peptídeo (PMF), usando o programa FlexControl™. Foi utilizada uma aceleração de 20 kV e frequência de laser com 50 Hz. A calibração externa foi realizada usando uma mistura de peptídeos com [M + H+] íons de angiotensina I, angiotensina II, substância P, bombesina e hormônios adrenocorticotrófico. O espectro gerado foi analisado pelo programa FlexAnalysis 3.0 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). As proteínas foram identificadas com base nos valores das massas moleculares e cargas derivadas dos peptídeos. Usando o programa MASCOT (http://www.matrixscience.com/cgi/protein-view), as pesquisas no banco de dados foram realizadas utilizando os seguintes parâmetros: Base de dados, NCBInr; taxonomia, Metazoa; enzima, tripsina. O limite de erro de massa do peptídeo foi fixado em ± 100 ppm; MS tolerância da massa do íon foi fixado em 0,6 Da. Carbamidometilação da cisteína e oxidação da metionina foram selecionadas como modificações fixa e variável, respectivamente. A identificação da proteína ocorreu quando o escore foi considerado significante, bem como foram comparados também os valores de pI e MW. Somente proteínas com escore >40 foram consideradas.
4.6 PAPEL FUNCIONAL DAS PROTEÍNAS IDENTIFICADAS
As proteínas identificadas em hemócitos coletados antes da infecção experimental com o WSSV, tanto de camarões tolerantes (T0T), como de camarões susceptíveis (T0S), foram relacionadas com alterações metabólicas e/ou respostas de defesa do L. vannamei frente ao agente viral. As sugestões foram estabelecidas com base em pesquisa bibliográfica, bem como em banco de dados e programas de anotação de função e de interação proteína-proteína, Blast2go, Gene Onthology (GO) e String.
4.7 POTENCIAIS BIOMARCADORES
Algumas proteínas expressas nos hemócitos de L.vannamei foram propostas como biomarcadores potenciais, com base no perfil diferencial e na sua identificação, através da análise comparativa entre os dois grupos experimentais. A estes critérios foi somado, quando possível, o papel funcional atribuído à proteína em questão, de modo a sugerir um dado biomarcador proposto como indicativo potencial do grau de tolerância de L.vannamei ao WSSV.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 COMPROVAÇÃO DA AUSÊNCIA DE INFECÇÕES VIRAIS ESPECÍFICAS
5.1.1 PCR nested para detecção do WSSV
O gel de agarose representativo dos resultados obtidos no ensaio de PCR nested utilizado na detecção da amplificação de uma sequência genômica do WSSV (Fig. 1), mostra a ausência do fragmento esperado de 941 pb nas amostras, como observado para o controle positivo da reação. Desta forma, os resultados comprovam a ausência deste vírus nos espécimes de camarões L.vannamei, antes do desafio experimental com o WSSV.
Fonte: Dados elaborados neste trabalho.
500 pb
-1000 pb
-
-
941 pbMK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C- C+
Figura 1 - Gel de agarose representativo do resultado da PCR nested para detecção do WSSV em amostras dos espécimes de L.vannamei, utilizados no presente estudo, ao final do primeiro período de aclimatação. 1-10) Animais negativos para o WSSV, C-) Controle negativo (H2O), C+) Controle positivo
(camarão positivo para WSSV) e MK) marcador de peso molecular. O tamanho do fragmento esperado corresponde a 941 pares de base (pb).
5.1.2 PCR para detecção do IHHNV
O gel de agarose representativo dos resultados obtidos no ensaio de PCR utilizado na detecção da amplificação de uma sequência genômica do IHHNV (Fig. 2), mostra a ausência do fragmento esperado de 512 pb nas amostras, como observado para o controle positivo da reação. Desta forma, os resultados comprovam a ausência deste vírus nos espécimes de camarões L.vannamei, antes do desafio experimental com o WSSV.
Os resultados relativos à investigação da presença de sequências alvo do genoma do WSSV e do IHHNV nos camarões estão de acordo com o esperado, ou seja, observação de reação negativa (ausência de amplificação) nos ensaios de PCR. Os resultados negativos refletem a origem e a condição sanitária dos espécimes de L.vannamei do LCM, utilizados no presente estudo. Estes camarões têm sua origem traçada a partir de uma linhagem SPF original, importada, e de uma linhagem própria da AQUATEC Aquicultura Ltda. (Canguaretama/RN), constituindo hoje sua linhagem híbrida Speedline HB12, cujas pós-larvas são monitoradas previamente para estes dois vírus, além do vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) e do vírus de síndrome de Taura (TSV).
5.2 QUALIDADE DA ÁGUA
A temperatura da água, salinidade, pH e concentração de oxigênio dissolvido registraram valores na faixa de 25±1°C; 20±1‰; 8,0±0,5 e, 5,5±0,5 mg/L,
Fonte: Dados elaborados neste trabalho.
500 pb
-1000 pb
--
512 pb MK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C-C+
Figura 2 - Gel de agarose (2%) representativo do resultado da reação de PCR para a detecção da sequência genômica alvo do IHHNV em amostras dos espécimes de L.vannamei, utilizados no presente estudo, ao final do primeiro período de aclimatação. 1–10) Animais negativos para o IHHNV; C+) Controle positivo; C-) Controle negativo (H2O); C+) Controle positivo (camarão positivo para
IHHNV) e MK) marcador de peso molecular. O tamanho do fragmento esperado corresponde a 512 pares de base (pb).
respectivamente, durante todas as etapas do experimento. As concentrações de amônia foram mantidas em 1,0±0,5 mg/L, do início até ao final do experimento.
As condições estáveis destes parâmetros e o manejo dos aquários ao longo do experimento foram relevantes no sentido de contribuir com condições favoráveis para a sobrevivência dos camarões, frente ao desafio viral, visando à obtenção do grupo com o perfil considerado como menos suscetível ou tolerante ao WSSV. A interação vírus-hospedeiro e, a consequente severidade de infecções de etiologia viral, particularmente do WSSV, depende não somente dos mecanismos de replicação virais propriamente ditos, mas pode ser impactada pela interação do hospedeiro com o ambiente no qual ele se encontra, incluindo a qualidade da água, as condições de manejo, a densidade de estocagem, além de diversos agentes ou fatores estressores, como a presença de xenobióticos e, ainda, a ocorrência de infecções múltiplas (FLEGEL, 2004; UMESHA et al., 2006; MARQUES, 2008; COSTA et al., 2010; MOSER, 2011; MOSER et al., 2012).
5.3 MORTALIDADE ACUMULADA APÓS A INFECÇÃO EXPERIMENTAL COM O WSSV
Os animais infectados experimentalmente com o inóculo, contendo 1,3x104
cópias virais do WSSV, foram observados diariamente, em relação ao seu comportamento e aspecto externo, bem como quanto à ocorrência de mortalidades. Dos camarões, cuja mortalidade foi sendo registrada ao longo do experimento (Fig. 3), foram coletados pleópodos para a determinação da respectiva carga viral (item 5.4).
Fonte: Dados elaborados neste trabalho.
Figura 3 - Mortalidade acumulada (%) de camarões L. vannamei durante o período de infecção experimental com o WSSV.
Um total de onze camarões sobreviveu à infecção viral, até o intervalo correspondente a 51-56 dias, após a inoculação do vírus (Fig. 3). Ao 56⁰ dia de infecção, foi registrada a sobrevivência de um total de onze indivíduos, representando 6% da população inicial do experimento (180 camarões). Estes indivíduos foram considerados, neste estudo, como tolerantes ao WSSV.
Desta forma, com base no perfil de sobrevivência, foram estabelecidos os grupos de camarões que apresentaram maior ou menor suscetibilidade à infecção experimental com o WSSV, sendo classificados como grupo susceptível (S) e grupo tolerante (T), respectivamente.
De modo geral, estudos envolvendo a infecção experimental, ou seja, o desafio de camarões com o WSSV, têm sido realizados de forma a desencadear uma infecção de caráter agudo, com registros de mortalidades em torno de 98-100% em 72 horas, ou, mais raramente, com registros de animais moribundos em igual intervalo de tempo. Com base no perfil e evolução das taxas de mortalidade registradas no presente estudo, podemos sugerir que a infecção, neste caso, pode ser considerada como de caráter mais brando. Este grau de severidade da infecção pelo WSSV nos pareceu mais apropriado, tendo em vista os objetivos aqui propostos, quer seja indicar possíveis biomarcadores de susceptibilidade/tolerância, a partir da comparação do perfil diferencial de proteínas expressas entre os dois grupos, e as considerações de Flegel (2007) relativas a um possível mecanismo de acomodação viral.
Estudos realizados em fazendas de cultivo mostraram que em um mesmo viveiro, onde foram registrados percentuais altos de infecção (prevalência em torno de 72%), em uma amostragem ao acaso, tanto camarões positivos moribundos, como camarões positivos não moribundos puderam ser observados. No entanto, dado que em condições de cultivo não é possível se determinar de forma precisa o momento da infecção dos camarões em um dado viveiro, não foi descartada a hipótese de que as diferenças observadas pudessem estar refletindo simplesmente diferenças do tempo de infecção de cada animal (MÜLLER et al., 2010).
Por outro lado, o percentual de sobreviventes registrado no nosso experimento pode ser considerado relativamente próximo daquele observado em uma fazenda de cultivo na região de Laguna, Santa Catarina, no primeiro ciclo de cultivo liberado após o vazio sanitário de seis meses em 2005. Na fazenda estudada, cujo repovoamento pós-vazio sanitário ocorreu em outubro de 2005, a
