Palavras-chave
Oligossacarídeos do leite humano · Imunidade · Lactente
Resumo
O sistema imune do lactente é funcionalmente imaturo e vulnerável. O leite humano contém proteínas bioativas, lipídios e carboidratos que protegem o recém-nascido e estimulam o desenvolvimento do sistema imune inato e adaptativo. Este artigo terá como foco o papel que os oligossacarídeos do leite humano (OLHs) desempenham
Reprinted with permission from: Ann Nutr Metab 2016;69(suppl 2):42–51 DOI: 10.1159/000452818
Leite humano: lições das últimas pesquisas
Os oligossacarídeos do leite humano influenciam
a imunidade da mucosa e sistêmica dos neonatos
Sharon M. Donovana Sarah S. Comstockb
aDepartamento de Ciências Alimentares e Nutrição Humana, Universidade de Illinois, Urbana, IL, e bDepartamento de Ciências Alimentares e Nutrição Humana, Universidade do Estado de Michigan, East Lansing, MI, EUA
Mensagens principais
• Os oligossacarídeos do leite humano (OLHs) são componentes predominantes do leite humano. São compostos de diversas estruturas neutras ou ácidas e de algumas formas sialiladas ou fucosiladas, o que contribui com suas funções biológicas. • Os OLHs protegem o lactente contra infecções
patogênicas, facilitam o estabelecimento da
microbiota intestinal, promovem o desenvolvimento do intestino e estimulam a maturação imune. • Hoje em dia alguns tipos de OLHs estão
disponíveis comercialmente, adicionados às fórmulas infantis de forma isolada ou em combinação com outros prebióticos.
no desenvolvimento e na função do sistema imune gas-trointestinal e sistêmico dos neonatos. No decorrer da última década, muitas pesquisas foram realizadas com o objetivo de determinar a complexidade dos oligossa-carídeos do leite de muitas espécies. Hoje esses estudos começam a delinear as diversas funções dos OLHs. Tais ensaios demonstraram que o leite humano contém oli-gossacarídeos de concentração, diversidade estrutural e grau de fucosilação maiores que os do leite de outras es-pécies, especialmente o bovino, do qual derivam muitas fórmulas infantis. A disponibilidade comercial de gran-des quantidagran-des de certos OLHs aumentou o conheci-mento sobre as funções de OLHs específicos, como pro-teger os lactentes contra infecções patogênicas, facilitar o estabelecimento da microbiota intestinal, promover o desenvolvimento do intestino e estimular a maturação do sistema imune. Muitas dessas atividades são reali-zadas por meio de interações carboidrato-carboidrato com patógenos ou células hospedeiras. Foram recente-mente adicionados dois OLHs, 2’-fucosil-lactose (2’FL) e lacto-N-neotetraose (LNnT), às fórmulas infantis. Embora esse seja mais um passo para aproximar a composição das fórmulas infantis à do leite humano, ainda não está claro se um ou dois OLHs serão suficientes para replicar a complexidade das atividades realizadas pela mistu-ra abmistu-rangente de OLHs que os lactentes amamentados ao seio ingerem. Assim, quanto mais OLHs se tornarem disponíveis comercialmente, isolados do leite bovino ou sintetizados de forma química ou microbiana, mais oligossacarídeos serão adicionados às fórmulas infantis, isolados ou em combinação com outros prebióticos.
Introdução
Quando o lactente humano chega ao mundo, seu sistema imunológico ainda é funcionalmente imaturo, o que afeta a resposta imune adaptativa e inata [1] e expõe o recém-nas-cido a alto risco de infecções comuns. A maturação imune pós-natal é estimulada por exposições antigênicas e inte-rações hospedeiro-micróbio [1,2]. O tipo de alimento que o lactente recebe e a forma como isso ocorre influenciam o desenvolvimento e a competência do sistema imune [3-5]. O leite humano protege o lactente durante esse perío-do vulnerável porque fornece componentes bioativos que defendem a criança contra infecções patogênicas, susten-tam o desenvolvimento intestinal, promovem a função da barreira, estimulam o desenvolvimento imune, facilitam a tolerância imune e alimentam os micróbios do intestino [2-5]. Assim, o leite humano proporciona diversos níveis de proteção ao lactente (Fig. 1).
A amamentação ao seio, especialmente se for exclusiva até os 6 meses de idade ou mais, em comparação ao uso de fórmulas, diminui a incidência e/ou a gravidade das doenças infecciosas [6]. Muitas doenças de etiologias que envolvem componentes infecciosos e imunes, inclusive diarreia, infecção do trato respiratório e do trato urinário, otite média, bacteremia e enterocolite necrosante, ocor-rem com menos frequência em lactentes amamentados ao seio em comparação aos alimentados com fórmulas [6,7]. Além disso, a amamentação ao seio está envolvida na redução da incidência de outras doenças relacionadas ao sistema e à tolerância imune, como doença inflamatória intestinal, doença celíaca, asma, alergia, diabetes tipo 1, leucemia linfoide aguda e leucemia mieloblástica aguda [6,8]. Esses benefícios podem ser mediados, em parte, pelos efeitos da amamentação ao seio sobre a microbiota intestinal [8,9], que, por sua vez, estimula a maturação e a especificidade do sistema imune sistêmico e da mucosa dos neonatos [2].
O benefício imune da amamentação ao seio é atribuído, em parte, aos diversos componentes bioativos do leite hu-mano [2-5]. Há fortes argumentos que sustentam o papel importante dos oligossacarídeos do leite humano na defesa e na maturação do sistema imune dos neonatos. Como será descrito abaixo, os OLHs estão presentes em altas concen-trações no leite humano, têm uma diversidade estrutural incrível [10-13] e fornecem proteção ao hospedeiro, além de mediar as respostas imunes por meio de diversos meca-nismos [14,15].
Conteúdo e composição dos OLHs
Os OLHs são glicanos solúveis complexos predominan-temente presentes no leite em sua forma livre. Esses gli-canos são sintetizados de cinco monossacarídeos básicos: galactose, glicose, N-acetilglicosamina, fucose e um
deri-Fig. 1. O leite humano pode orquestrar o desenvolvimento gastrointes-tinal, imune e da microbiota. O ecossistema do intestino representa um ambiente complexo e interativo em que o leite humano influencia o de-senvolvimento intestinal, o estabelecimento da microbiota e a maturação do sistema imune sistêmico e da mucosa. Os sinais da microbiota, por sua vez, estimulam a maturação e a especificidade do sistema imune sistêmico e da mucosa. Além disso, o sistema imune e a microbiota promovem o desenvolvimento intestinal. O leite humano contém nutrientes bioativos e outras substâncias que modulam esses processos, e os oligossacarídeos constituem um componente-chave. Maturação e função imune.
vado do ácido siálico, o ácido N-acetilneuramínico [10,11]. Com poucas exceções, todos os OLHs transportam lactose (Galβ1-4GIc) no terminal redutor, que pode ser alongado na ligação β1-3 ou β1-6 por dois dissacarídeos diferentes, Galβ1-3GIcNAc (cadeia tipo 1) ou Galβ1-4GIcNAc (ca-deia tipo 2) [11].
Relatou-se que o leite maduro apresenta conteúdo de OLHs de 1 a 10 g/L, enquanto no colostro há de 15 a 23 g/L [10-13]. No leite materno a termo, ~35% a 50% dos OLHs são fucosilados, de 12% a 14% são sialilados e de 42% a 55% são OLHs neutros não fucosilados [10-13] (Ta-bela 1). Entretanto, a composição dos OLHs é influenciada pela genética materna, incluindo-se o status secretor e o grupo sanguíneo Lewis [10,11]. A fucosilação dos OLHs é mediada por duas fucosiltransferases, FUT2 (gene secre-tor) e FUT3 (gene Lewis). As mães não secretoras, que não apresentam enzima FUT2 funcional e representam cerca de 30% das mulheres de todo o mundo, produzem leite sem oligossacarídeos α1-2-fucosilados, como 2’-fucosil-lacto-se (2’FL) e lacto-N-fucopentao2’-fucosil-lacto-se (LNFP) I [10,11]. A au-sência desses componentes pode apresentar consequências funcionais. Os lactentes que consomem leite produzido
Maturação e função imune Desenvolvimento intestinal Componentes bioativos do leite humano Estabelecimento do microbioma
por mulheres não secretoras, por exemplo, têm coloniza-ção tardia de Bifidobacteria, maior abundância de
Strep-tococcus e diferenças funcionais de atividade metabólica
da microbiota [16]. Os lactentes que recebem leite de mães não secretoras apresentam maior risco de doenças diarrei-cas [17].
OLH e microbioma
O desenvolvimento da microbiota intestinal dos lac-tentes é um processo sequencial que começa no útero e continua durante os primeiros dois a três anos de vida. A composição e a diversidade microbianas são modeladas pela genética do hospedeiro e por diversos fatores ambien-tais, como a dieta, um dos principais colaboradores [8,9]. Estudos realizados durante a última década demonstraram que espécies específicas de Bacteroides e de
Bifidobacte-rium que comumente colonizam os lactentes amamentados
ao seio usam, de forma eficiente, os OLHs como fontes de carbono. Isso é especialmente verdadeiro em relação a subespécies infantis de B. longum (B. infantis), micró-bio intestinal predominante em lactentes amamentados ao seio [18]. A descoberta de uma ilha genômica em B.
infan-tis que codifica enzimas específicas do metabolismo dos
OLHs sustenta uma adaptação dessa espécie ao ambiente intestinal do lactente amamentado ao seio [18,19]. De fato, um estudo recente com lactentes humanos que receberam fórmula suplementada com 2’FL (1 g/L) e LNnT (0,5 g/L) demonstrou que a composição global da microbiota des-sas crianças era diferente, em termos de gênero, daquela das crianças alimentadas com fórmula não suplementada (p<0,001) e mais similar à dos lactentes amamentados ao seio aos 3 meses de idade [20]. Observou-se também maior abundância de Bifidobacterium (p<0,01) versus
Escheri-chia e Peptostreptococcaceae não classificados em
lacten-tes que receberam fórmulas com 2’FL e LNnT em compa-ração a crianças que receberam fórmula não suplementada. Esses níveis foram mais próximos do que os observados em lactentes amamentados ao seio [20]. Além disso, as
fe-Categorias de OLHs (% total) Oligossacarídeo Concentração média (variação), g/L Fucosilados (35%-50%) 2’FL 3’FL LNFP I LNFP II + III 2,7 (1,88-4,9) 0,5 (0,25-0,86) 0,122 (0,106-0,145) 0,156 (0,120-0,161) Sialilados (12%-14%) 3’SL 6’SL 0,2 (0,1-0,3) 0,5 (0,2-1,22) Neutros não fucosilados (42%-55%) LNnT 0,3 (0,17-0,45)
2’FL: 2’-fucosil-lactose; 3’SL: 3’-sialil-lactose; 6’SL: 6’-sialil-lactose; OLHs: oligossacarídeos do leite humano; LNFP: lacto-N-fucopentaose; LNnT: lacto-N-neotetraose.
Tabela 1. Concentrações dos principais OLHs no leite humano [10-13]
zes dos lactentes que receberam a fórmula suplementada com OLHs apresentaram concentrações de diversos me-tabólitos importantes (propionato, butirato e lactato) mais similares às dos lactentes amamentados ao seio [20].
Demonstrou-se anteriormente que a fermentação de OLHs pela microbiota de suínos neonatos produziu áci-dos graxos de cadeia curta e promoveu o crescimento de bactérias benéficas in vitro [21] e in vivo [22]. As bacté-rias do intestino e a resposta imune, sobretudo a gastroin-testinal, estão estritamente relacionadas [23]. Assim, nes-se modelo animal, as alterações induzidas por OLHs nas populações bacterianas do intestino dos suínos mudam o curso da infecção intestinal [24], que por sua vez mudaria a resposta imune [22]. Em contrapartida, a alteração das bactérias do intestino poderia afetar diretamente o siste-ma imune desses anisiste-mais [2]. A próxisiste-ma seção resume outras formas através das quais os OLHs podem mediar a imunidade dos neonatos.
Os OLHs como imunomoduladores
A figura 2 resume as evidências, cada vez maiores, que mostram que os OLHs influenciam direta e indiretamente a função imune sistêmica e da mucosa dos lactentes. A saúde intestinal e a função da barreira são, de modo geral, con-sideradas a primeira linha de defesa da imunidade inata. A proliferação celular ocorre nas criptas, e as células se dife-renciam conforme migram para cima, no eixo cripta-vilo, com exceção das células de Paneth, que migram para bai-xo, até a base da cripta. Os OLHs reduzem a proliferação das células da cripta intestinal [25,26], além de aumentar a maturação das células do intestino [26] e a função de bar-reira [26] (indicação 1-3 na fig. 2). Uma camada formada por glicoproteínas do muco ou por mucinas produzidas por células caliciformes atua como lubrificante e como barreira física protetora entre o epitélio intestinal e o conteúdo do lúmen (indicação 4 na figura. caliciformes, como se de-monstrou em relação aos galacto-oligossacarídeos (GOS) [27]. Os OLHs afetam a expressão gênica imune do
epi-Fig. 2. Mecanismos potenciais pelos quais os oligossacarídeos
do leite humano influenciam a função imune do hospedeiro. Os OLHs afetam a imunidade inata através da barreira epitelial: re-duzem a proliferação de células da cripta intestinal (1), aumentam a maturação das células intestinais e a função da barreira (3) e podem influenciar a função das células caliciformes (4), confor-me se demonstrou em relação aos galacto-oligossacarídeos. Além disso, os OLHs afetam a expressão gênica imune do epitélio dire-ta (5) e indiredire-tamente através da microbiodire-ta (6). Os OLHs atuam
Lúmen intestinal Microbiota comensal Patógeno Bifidobacterium 2'FL 6'SL LNT 7 8 6 2 5 4 1 Camada mucina Junção íntima Célula caliciforme Célula epitelial e vilosidades Camada epitelial Células com micropregas Lâmina própria Placa de P ey er Cripta 9 Circulação 11 10 12 LNT 6'SL 2'FL 3 Macrófago Célula
dendrítica Neutrófilo Célula T virgem Célula T Plaqueta Citocinas
como prebióticos na promoção do crescimento de bactérias sau-dáveis, inclusive das espécies Bifidobacteria e Bacteroides (7). Além disso, inibem infecções por bactérias e vírus quando se ligam aos patógenos no lúmen ou impedem a ligação aos recep-tores de glicanos da superfície celular (8). Os OLHs afetam as populações de células imunes e a secreção de citocinas (9). São também absorvidos pela corrente sanguínea (10), onde afetam a ligação de monócitos, linfócitos e neutrófilos às células endote-liais (11) e a formação de complexos plaquetas-neutrófilos (12).
télio direta [28-30] e indiretamente através da microbiota [31] (indicação 5 e 6 na fig. 2 respectivamente). Conforme se observou acima, os OLHs atuam como prebióticos na promoção do crescimento de bactérias saudáveis, inclusive os gêneros Bifidobacteria e Bacteroides [32] (indicação 7 na fig. 2). Além disso, inibem as infecções por bactérias e vírus quando se ligam aos patógenos no lúmen ou im-pedem a ligação aos receptores de glicanos na superfície celular [14-15,22] (indicação 8 na fig. 2). Os oligossaca-rídeos também estão presentes no revestimento intestinal, contribuindo no repertório de glicanos do intestino [33]. Os OLHs também contribuem para a função da barreira epitelial porque sustentam o crescimento de B. infantis no intestino do lactente [10,18]. Em um modelo murino de colite, demonstrou-se que B. infantis produz peptídeos que normalizam a permeabilidade intestinal pelo aumento da expressão proteica na junção íntima [34]. É provável que os OLHs sustentem outras espécies de bactéria importan-tes para a manutenção da integridade do inimportan-testino. Essas alterações de função da barreira intestinal mudariam, por sua vez, o sistema imune local e sistêmico [35]. Os OLHs afetam as populações de células imunes e a secreção de citocinas [22,36] (indicação 9 na fig. 2). Alguns OLHs também são absorvidos pela corrente sanguínea [37-39] (indicação 10 na fig. 2), onde exercem efeitos sistêmicos pela ligação de monócitos, linfócitos e neutrófilos às célu-las endoteliais [40] (indicação 11 na fig. 2) e pela formação de complexos plaquetas-neutrófilos [41] (indicação 12 na fig. 2). Recomenda-se que os leitores consultem a revisão recente de Kulinich e Liu [15] para obter mais informações sobre esse assunto.
A ligação do carboidrato como mecanismo
potencial dos OLHs no sistema imune
Os carboidratos e as proteínas ligantes de carboidratos desempenham papel importante nas respostas imunes. As células apresentam assinaturas únicas de polissacarídeos, compostas de combinações de padrões específicos de gli-canos que são engajados quando uma célula entra em con-tato com outra célula ou com outros componentes de seu ambiente [42,43]. Entretanto, muitos dos padrões de polis-sacarídeos encontrados nas células de mamíferos também podem ser encontrados nos micróbios e nos alimentos, inclusive no leite humano. Essas similaridades promovem oportunidades de interações hospedeiro-micróbio-OLH.
As lectinas são proteínas ligantes de carboidratos pre-sentes nas superfícies das células de mamíferos que tra-duzem o reconhecimento de padrões específicos e a apre-sentação espacial desses padrões em ação. As lectinas se agrupam de acordo com seus domínios de reconhecimen-to de carboidrareconhecimen-tos (DRCs, na sigla em inglês) [42,43]. Há pelo menos uma dúzia de DRCs identificados em
mamíferos, mas as três classes de lectinas relacionadas à influência dos OLHs nas respostas imunes são: as lectinas do tipo C, as siglecs (lectinas semelhantes à imunoglobu-lina de ligação ao ácido siálico) e as galectinas.
As lectinas do tipo C necessitam de cálcio para atuar e incluem selectinas, lectina de ligação a manose e não integrina ligante de molécula de adesão intercelular-3 es-pecífica de células dendríticas (DC-SIGN, na sigla em in-glês). Os receptores da lectina do tipo C na superfície das células dendríticas (DC, na sigla em inglês) determinam se a célula induzirá tolerância em vez de ativar os lin-fócitos [44]. A DC-SIGN é particularmente interessante em relação aos mecanismos pelos quais os OLHs podem influenciar a imunidade porque apresenta DRC específico das unidades de fucose. Além disso, as células do trato gastrointestinal do lactente apresentam expressão de DC-SIGN [45]. Essas células intestinais são provavelmente apresentadoras de antígenos, considerando-se que a DC-SIGN é expressa por células apresentadoras de antíge-nos, especificamente as DC [43]. Embora as interações de ligantes fucosilados com DC-SIGN contribuam para a tolerância imune, a resposta celular depende basicamente de outras reações ligante-receptor que ocorrem simulta-neamente [43].
As siglecs são lectinas de ligação ao ácido siálico mais comumente encontradas em subconjuntos de cé-lulas imunes [46]. Há pelo menos 16 siglecs expressas por diferentes populações de leucócitos, que incluem lectina 1 semelhante a Ig de ligação ao ácido siálico (siglec-1), lectina 2 semelhante a Ig de ligação ao áci-do siálico (siglec-2), glicoproteína associada a mielina (siglec-4), siglec-15 e siglecs relacionadas a CD33. A especificidade das siglecs se origina das diferenças de sítios de ligação secundários [43]. As siglecs são recep-tores endocíticos que transportam carga entre a super-fície celular e as vesículas intracelulares. Esses recep-tores são expressos, sobretudo, nas células envolvidas no processamento e na apresentação de antígenos [43]. Além disso, as moléculas que contêm ácido siálico po-dem ganhar acesso aos macrófagos quando se ligam às siglecs na superfície celular [46]. Nas células de mamí-feros, alguns glicanos que contêm ácido siálico atuam como padrões moleculares autoassociados e evitam res-postas imunes a estímulos não patogênicos. A ligação de siglecs específicas estimula a produção da citocina imunorregulatória interleucina 10 (IL-10) [47]. As ga-lectinas são importantes para a renovação celular e a re-gulação imune. Os DRCs das galectinas são específicos de β-galactosídeos. Quando as células são desialiladas, há aumento da densidade das porções de galactose ex-postas na superfície celular. As células T virgens, por exemplo, expressam CD45 com um ácido siálico de
li-Espécie Delineamento do estudo Principais achados Ref. Lactentes
humanos
Lactentes saudáveis não gêmeos e com até 5 dias de vida foram incluídos e alimentados com fórmula até 4 meses de idade
– Amamentados ao seio – Fórmula + 2,4 g/L GOS
– Fórmula + 2,2 g/L GOS + 0,2 g/L 2’FL – Fórmula + 1,4 g/L GOS + 1,0 g/L 2’FL PBMCs isoladas após 6 semanas de vida
Os achados foram similares entre os lactentes amamentados ao seio e os alimentados com uma das fórmulas com 2’FL; os lactentes amamentados apresentaram menos citocinas inflamatórias plasmáticas do que os lactentes que receberam a fórmula de controle
Em culturas de PBMCs estimuladas com VSR ex vivo, as células dos lactentes amamentados ao seio não foram diferentes das de nenhum dos grupos que receberam fórmula com 2’FL, mas secretaram menos TNF-α e gamainterferon e tenderam a apresentar níveis menores de IL-1Ra, IL-6 e IL-1β do que as células de lactentes que receberam a fórmula de controle
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Lactentes humanos
Lactentes saudáveis não gêmeos e com até 14 dias de vida foram incluídos e alimentados com fórmula em fase experimental até 6 meses de idade e com fórmula de seguimento padrão até 12 meses de idade
– Fórmula
– Fórmula + 1,0 g/L 2’ FL + 0,5 g/L LNnT
Os lactentes que receberam fórmula suplementada com OLHs apresentaram número significativamente menor de relatos por parte dos pais de:
– Bronquite aos 4, 6 e 12 meses
– Infecções do trato respiratório aos 12 meses – Uso de antipiréticos aos 4 meses
– Uso de antibióticos aos 6 e 12 meses
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Leitões pri-vados de colostro
Estudo com alimentação por 15 dias – Fórmula
– Fórmula + 4 g/L OLH (40% 2’FL; 35% LNnT; 10% 6’SL; 5% 3’SL; 10% ácido siálico livre)
Infectados com a cepa OSU de RV no dia 10 e analisados no dia 15
O uso de OLHs resultou em menor duração da diarreia e maior expressão de RNAm de gamainterferon e IL-10 ileal do que a fórmula, mas concentrações similares de IgG e IgM específicas de RV do que a fórmula
22
Camundongos C57BL/6 (fê-meas adultas)
Modelo de infecção por E. coli – 0,25% SSD oral nos dias 0-3
– 2’FL (100 mg ou veículo por gavagem oral nos dias 0-4)
– 20 mg de estreptomicina por gavagem oral no dia 4
Infectados com AIEC no dia 5 e analisados no dia 9
O uso de 2’FL evitou perda de peso corporal e reduziu a colonização por AIEC, a inflamação do cólon, a expressão de CD14 nas células da cripta e a produção de IL-6, IL-17 e TNF-α em resposta à infecção por AIEC
29
Camundongos Balb/c (ma-chos adultos)
Modelo de tratamento de alergia alimentar – IP sensibilizada com OVA
– 2 semanas depois (dia 27), gavagem oral diária (1 mg em 200 μL PBS)
2’FL 6’SL Lactose
– Dia 28: provocação oral com OVA (50 mg) a cada 3 dias até o dia 43
O uso de 2’FL e 6’SL atenuou a diarreia e a hipotermia induzidas pela provocação com OVA, reduziu as quantidades de mastócitos intestinais e a anafilaxia cutânea passiva, além de aumentar as células T regulatórias da placa de Peyer, e CD11c + CD103 + DC 6’SL aumentaram as células T regulatórias de IgG2a e MLN específicas de OVA
Os esplenócitos de camundongos tratados com 6’SL produziram mais gamainterferon e IL-10, mas menos TNF
Os esplenócitos de camundongos tratados com 2’FL produziram menos gamainterferon
51
2’FL: 2’-fucosil-lactose; 3’SL: 3’-sialil-lactose; 6’SL: 6’-sialil-lactose; AIEC: E. coli aderente invasiva; DCs: células dendríticas; DSS: sulfato de sódio dextrano; GOS: galacto-oligossacarídeos; OLHs: oligossacarídeos do leite humano; IFN: interferon; IP: infecção intraperitonial; Ig: imunoglobulina; IL: interleucina; LNnT: lacto-N-neotetraose; MLN: linfonodos mesentéricos; OSU: Universidade do Estado de Ohio; OVA: ovalbumina; PBMCs: células mononucleares do sangue periférico; PBS: tampão fosfato salina; RSV: vírus sincicial respiratório; RV: rotavírus; SA: ácido siálico; TNF: fator de necrose tumoral.
Tabela 2. Desfechos de imunidade dos estudos sobre administração de OLHs
gação α-2,6. A quantidade de ácido siálico de ligação α-2,6 apresenta redução após a ativação da célula T. A diminuição de ácido siálico com ligação α-2,6 torna as células T ativadas suscetíveis à apoptose mediada por galectina-1 [48]. Assim, a ligação dos OLHs sialilados às células pode evitar a apoptose.
Os OLHs como moduladores da imunidade
da mucosa
Foram utilizadas linhagens celulares do intestino para determinar os efeitos dos OLHs sobre a expressão gêni-ca imune e a produção de proteínas. Essas células foram coincubadas com oligossacarídeos [28], bactérias [48] ou
lipopolissacarídeos (LPSs) para demonstrar uma infecção bacteriana [29]. A coincubação de Bifidobacterium com células da linhagem celular intestinal Caco-2 e OLH re-sultou na regulação para baixo dos genes das células in-testinais relacionadas à atividade da quimiocina em com-paração à coincubação com glicose ou lactose [29]. Em contrapartida, na ausência de um coestimulante bacteria-no, os OLHs aumentaram a expressão de diversas quimio-cinas por meio da linhagem celular HT-29 [28]. Outros trabalhos sobre as linhagens celulares intestinais T84 e HCT8 demonstraram que misturas complexas de OLHs, assim como de 2’FL, reduziram as assinaturas de inflama-ção intestinal [29].
Demonstrou-se que os OLHs afetam o curso da in-fecção viral gastrointestinal. Em um modelo de inin-fecção aguda por rotavírus (RV), quando o íleo de um leitão de 21 dias foi isolado in situ, as alças intestinais cotratadas com OLH e RV apresentaram redução da expressão de RNAm na proteína não estrutural 4 (NSP-4, na sigla em inglês), o que indica que os OLHs podem reduzir a repli-cação de RV [49]. A expressão de citocina e quimiocina intestinal, entretanto, não foi afetada. Os OLHs neutros e ácidos reduziram a expressão de RNAm intestinal na NSP-4 no modelo in situ, enquanto apenas os OLHs áci-dos inibiram efetivamente a infectividade do RV em um modelo in vitro [49].
Os OLHs como moduladores da imunidade
sistêmica e da proteção contra infecções
Os OLHs são detectados no plasma de lactentes ama-mentados com leite humano em concentrações de 1 a 133 mg/L [37,39], o que sugere o potencial dos OLHs alimen-tares de afetar diretamente as células imunes circulantes no sangue. Conforme já se discutiu acima, muitos receptores imunes reconhecem as estruturas de oligossacarídeos de seus ligantes de glicoproteínas [14,15]. Considerando-se que um subconjunto de OLHs é estruturalmente similar aos ligantes de selectina [14], é provável que os OLHs congam ligar-se diretamente às células imunes e estimular a si-nalização que resulta nas alterações das populações e fun-ções das células imunes. A P-selectina e a E-selectina, por exemplo, reconhecem a sialil-Lewis x (sLeX), uma porção glicano de diversos OLHs [11]. Além disso, a fucosilação e a sialilação, duas modificações enzimáticas comuns aos OLHs, possibilitam a ligação a selectinas [50]. O bloqueio induzido pelos OLHs das interações imunes de carboidrato e proteína reduziu o rolamento e a ativação dos neutrófilos [40]. Os OLHs afetaram diretamente a proliferação celular e a produção de citocinas em experimentos ex vivo com células mononucleares de sangue periférico (PBMC, na sigla em inglês) de porcos neonatos [36]. A estimulação com OLHs isolados promoveu a produção da citocina
re-gulatória IL-10 [36]. Outros estudos demonstraram que os OLHs ácidos induzem a produção de IL-10. Além disso, observou-se que os OLHs ácidos induzem a produção de gamainterferon a partir de células mononucleares de san-gue de cordão umbilical estimuladas ex vivo. Os OLHs iso-lados aumentaram a proliferação de PBMCs estimuladas com um mitógeno de célula T, a fito-hemaglutinina (PHA), e os OLHs sialilados elevaram a proliferação de PBMCs estimuladas com o mitógeno de célula B LPS [36]. Por outro lado, a 2’FL inibiu a proliferação de PBMCs não estimuladas e cultivadas por três dias. Assim, a resposta aos OLHs pode depender do estado do lactente. No estado não estimulado, os OLHs reduzem a proliferação, mas a elevam em resposta a estímulos mitogênicos.
Poucos estudos, até o momento, administraram OLHs e analisaram desfechos imunes [22,29,30,51-54] (Tabela 2). Quando se administrou 2’FL a leitões [55], relataram-se apenas desfechos toxicológicos e de crescimento. Um ar-tigo publicado recentemente descreveu os desfechos imu-nes em lactentes humanos que receberam fórmulas com 2,4 g/L de galacto-oligossacarídeos (GOS), 2,2 g/L GOS mais 0,2 g/L 2’FL ou 1,4 g/L GOS mais 1,0 g/L 2’FL em comparação aos controles de referência amamentados ao seio [53]. Os lactentes receberam as fórmulas a partir de cinco dias de vida até 4 meses de idade. Após seis semanas, obtiveram-se amostras de sangue para análise de citocinas, fenotipagem de células imunes e estimulação ex vivo de PBMCs isoladas. Os resultados dos lactentes amamenta-dos ao seio e amamenta-dos que receberam uma das fórmulas com 2’FL foram similares e apresentaram menos citocinas in-flamatórias plasmáticas do que as crianças que receberam a fórmula de controle. Além disso, a secreção de citocinas pelas PBMCs entre os lactentes amamentados ao seio e os que receberam uma das fórmulas com 2’FL estimuladas ex
vivo com vírus sincicial respiratório foi similar e
apresen-tou menos fator de necrose tumoral-α e gamainterferon, além de mostrar tendência a níveis menores de IL-1Ra, IL-6 e IL-1β em relação às células dos lactentes que rece-beram a fórmula de controle [53].
Outro estudo recente com lactentes humanos avaliou o efeito da fórmula suplementada com 2’FL (1,0 g/L) e LNnT (0,5 g/L) em comparação com uma fórmula não su-plementada. Os lactentes receberam as fórmulas a partir de 14 dias de vida até 6 meses de idade. Depois disso, hou-ve mudança para uma fórmula de seguimento padrão com acompanhamento até 12 meses de idade. Os lactentes que receberam a fórmula suplementada com OLHs apresenta-ram número significativamente menor de relatos por parte dos pais de (p=0,004-0,047) bronquite aos 4 meses (2,3% vs 12,6%), aos 6 meses (6,8% vs 21,8%) e aos 12 meses (10,2% vs 27,6%); infecções do trato respiratório (grupo de eventos adversos) aos 12 meses (19,3% vs 34,5%); uso
de antipiréticos aos 4 meses (15,9% vs 29,9%); e uso de antibióticos aos 6 meses (34,1% vs 49,4%) e aos 12 meses (42,0% vs 60,9%) em relação aos que receberam a fórmula padrão [54].
Diversos estudos com modelos animais sustentam a re-dução da incidência de infecções em lactentes humanos que receberam fórmula com OLHs. Em camundongos infecta-dos com Escherichia coli, a gavagem oral uma vez por dia com 100 mg de 2’FL preveniu a perda de peso corporal e reduziu a colonização por E. coli aderente invasiva, a infla-mação do cólon, a expressão de CD14 nas células da cripta e a produção de IL-6, IL-17 e fator de necrose tumoral-α em resposta à infecção por E. coli aderente invasiva em comparação com camundongos tratados com veículo [29]. Os camundongos alimentados com 2’FL e submetidos a ressecção ileocecal ganharam mais peso e apresentaram maior profundidade da cripta e altura do vilo no sítio de transecção do que os camundongos sem suplemento [30]. Os camundongos que receberam 2’FL também apresenta-ram regulação para cima dos genes de resposta imune da mucosa do intestino delgado distal [30]. Os estudos em que lactentes de suínos e humanos receberam OLHs focaram a 2’FL, que está disponível em grandes quantidades e a custo acessível. Além disso, demonstrou-se que os oligossacarí-deos fucosilados alimentam classes específicas e benéficas de bactérias durante os eventos de inflamação do intestino [56]. Considerando-se o que se sabe sobre os efeitos de outros OLHs, esses componentes também devem ser usa-dos em estuusa-dos sobre alimentação quando disponíveis em quantidades suficientes.
Apenas um estudo in vivo usou uma mistura comple-xa de OLHs e avaliou os desfechos imunes. Nesse estudo, porcos neonatos que receberam dieta de 4 g/L de OLHs, com 40% de 2’FL, 10% de 6’-sialil-lactose (6’SL), 35% de lacto-N-neotetraose (LNnT), 5% de 3’-sialil-lactose (3’SL) e 10% de ácido siálico livre, apresentaram redu-ção da duraredu-ção da diarreia em resposta à infecredu-ção por RV, com 48,8 ± 9,8 horas versus 80,6 ± 4,5 horas, em relação a porcos que receberam fórmula sem suplementação [22]. O tecido ileal dos porcos alimentados com OLHs apresen-tou mais RNAm de gamainterferon (produzido por células Th1) e IL-10 (citocina anti-inflamatória) em relação aos porcos que receberam fórmula [22].
Em um modelo murinho de alergia alimentar, o uso de 2’FL e 6’SL em administração via gavagem oral reduziu os sintomas de camundongos sensibilizados em relação à ovalbumina, uma proteína do ovo [51]. De modo espe-cífico, os esplenócitos estimulados com ovalbumina dos camundongos tratados com 6’SL produziram mais IL-10 e menos gamainterferon que os dos camundongos não tra-tados. Além disso, os camundongos tratados com 2’FL ou 6’SL apresentaram mais células imunes regulatórias nos
tecidos imunes do intestino do que os camundongos não tratados. É interessante ressaltar que nem o uso de 2’FL nem de 6’SL afetou as células T regulatórias do intestino na administração a camundongos não sensibilizados [51]. Isso exemplifica a necessidade de identificar um modelo de provocação adequado para avaliar os efeitos dos compo-nentes nutricionais no sistema imune. Entre camundongos, os oligossacarídeos do leite LNFP III e LNnT apresentam viés relativo a Th2 e suprimem as respostas de Th1 [57]. Há relatos recentes de que lactentes humanos que recebe-ram leite humano com concentrações baixas de LNFP III (<60 µM) apresentaram probabilidade 6,7 vezes maior (IC de 95%: 2,0-2,2) de ter alergia ao leite de vaca em compa-ração aos lactentes que receberam leite com concentrações altas de LNFP III [58].
Outra abordagem que usou camundongos nocaute demonstrou que os componentes com SL podem afetar diretamente a imunidade da mucosa gastrointestinal [52, 59]. Em um estudo com camundongos nulos para IL-10, a presença de 3’SL no leite aumentou a quantidade de células imunes que se infiltram no intestino [52]. Além disso, a suplementação de 3’SL aumentou a gravidade da colite em camundongos recém-nascidos e nulos para IL-10 e St3gal4 (a enzima que sintetiza 3’SL), e a ado-ção interespecífica de camundongos do tipo selvagem por fêmeas deficientes reduziu a gravidade da colite. É importante observar que esse trabalho foi realizado na ausência da produção de IL-10 endógena, enquanto outros estudos in vivo demonstraram que alguns OLHs aumentam a IL-10 [22,51]. A 3’SL é um produto de di-versas bactérias patogênicas [60], e a conformação (li-gação α-2,3 entre ácido siálico e galactose) em bactérias patogênicas e no leite humano é a mesma. A 3’SL é reco-nhecida pelas DCs e gera uma resposta imune através da via de sinalização TLR4 [61]. Esses resultados sugerem que a presença de 3’SL aumenta a resposta inflamató-ria através de efeitos diretos nas DCs. Na ausência de TLR4, a 3’SL foi menos eficaz na indução da ativação das DCs. Entretanto, essas DCs também demonstraram aumento mínimo da expressão de CD40, o que sugere haver pelo menos mais um mecanismo de detecção de 3’SL nas DCs, embora muito menos eficaz. A TLR4 é o receptor de LPS de E. coli. Outra ligação entre 3’SL e TLR4 foi explicada em um artigo mais recente, no qual se demonstra que a 3’SL estimula a proliferação da po-pulação de E. coli intestinal e que esse supercrescimento de E. coli é responsável pela exacerbação da colite in-duzida por sulfato de sódio dextrano pela liberação de citocinas pró-inflamatórias a partir das DCs intestinais [62]. Esses exemplos demonstram a complexidade das relações entre os oligossacarídeos, as bactérias intesti-nais e o sistema imune.
Conclusão
A rica diversidade dos OLHs tem o potencial de modular a imunidade inata e adaptativa dos neonatos. Achados de ex-perimentos in vitro e modelos animais demonstram que os OLHs interagem diretamente com as células epiteliais gas-trointestinais e com as células imunes sistêmicas e da mucosa para modular a função imune. Além disso, os OLHs moldam, de forma benéfica, o microbioma do lactente amamentado ao seio. O aumento da disponibilidade de OLHs de fontes co-merciais, assim como o número cada vez maior de evidências que demonstram que a fórmula suplementada com OLHs é segura e pode oferecer benefícios aos lactentes humanos, levou à recente adição de 2’FL, isolada ou em combinação com LNnT, às fórmulas infantis. Além disso, devido aos
efei-tos benéficos para a função imune e a defesa do hospedei-ro, os OLHs também podem beneficiar outros segmentos da população que apresentam comprometimento imune ou alto risco de infecções. Há um número limitado de estudos em que animais ou seres humanos receberam OLHs. Além disso, poucos estudos avaliaram os efeitos da alimentação com mis-turas complexas de OLHs sobre a resposta imune. Assim, são necessárias novas pesquisas para determinar os mecanismos e entender completamente o benefício potencial dos OLHs em relação à função imune dos lactentes.
Declaração legal
Sharon Donovan recebeu financiamento da Nestlé Nu-trition R&D. Sarah Comstock não tem nada a declarar.
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