8
10
12
Porque é que os anticorpos necessitam
de uma região Fc?
• Detectar o antigénio • Precipitar o antigénio
• Bloquear os sitios activos de toxinas, mediadores imunológicos ou proteínas derivadas de agentes infecciosos. O fragmento (Fab)2 pode:
• Funções inflamatórias e efectoras associadas a células
• Funções inflamatórias e efectoras associadas ao complemento …Mas não podem activar:
14
Vantagens dos anticorpos monoclonais como
terapia
• Especificidade de reconhecimento de antigénios • Elevada eficácia de ligação
• Farmacocinética consistente
• Maior rapidez na progressão do desenvolvimento dos fármacos • Uma elevada gama de alvos terapêuticos
• Diversidade no modo de acção
– Antagonista – Agonista
15
Desvantagens dos anticorpos monoclonais
• Necessária a identificação de antigénios específicos • Eficácia varia conforme a expressão dos antigénios • Acesso dificultado a tumores sólidos
• Imunogenicidade (segurança e toxicidade) • Resposta celular (quando desnecessária!)
Aplicações dos Anticorpos
Monoclonais:
• Purificação de proteínas
• Identificação e isolamento de sub-populações utilizando o FACS.
• Detecção de tumores e imagiologia • Destruição de tumores
• Reagentes de diagnóstico • Desintoxicação de fármacos • Anticorpos catalíticos
Anticorpos
Policlonais
Monoclonais
Anticorpos totais a partir
do soro de animais imunizados
Reconhece múltiplas regiões (epitopos) do
antigénio utilizado
Hibridomas individuais clonados que expressam um tipo de anticorpo.
Anticorpos expressos são purificados do meio de cultura celular
Reconhecem UMA única região do antigénio
Hybridoma
• medium.
• Only the hybridoma cells
have got the ability to divide and proliferate on the HAT medium (Hypoxanthine
Aminopetrin Thymidine)
because genome from the B-lymphocyte makes them
HGPRT positive and genome from the myeloma cells they can divide indefinitely.
• Thus only the hybridoma cells or fused cells are selected
using selective media called as HAT medium.
26
A resposta humoral aos Anticorpos terapêuticos pode
alterar negativamente a sua eficácia e segurança
. Reacções de hipersensibilidade
The problem:
Immunogenicity of monoclonal antibodies
27
29
Tecnologia de ADN recombinante:
Manipulação genética de anticorpos
1. Humanização
a. Clonar o CDR de anticorpos de rato nas frameworks dos
anticorpos humanos.
b. Produção a partir de bibliotecas de anticorpos humanos c. Obtenção de anticorpos humanos a partir de ratos
transgénicos de Ig humanas.
31
Transferência das CDR do anticorpo do rato
para um anticorpo humano
VH rato
VH
humano
CDR de rato em humano = Humanização
32 Ac de rato Rato Ac Humano Humanos Ac quimérico Ac Humanizado Mouse Ab Human Ab
Humanização de anticorpos de rato
1. Humanização
a. Clonar o CDR de anticorpos de rato nas frameworks dos
anticorpos humanos.
b. Produção a partir de bibliotecas de anticorpos humanos
c. Obtenção de anticorpos humanos a partir de ratos
transgénicos de Ig humanas.
34
Engenharia de Anticorpos
Anticorpos 2ª Geração
• Clonagem e expressão de genes de anticorpos
• Bibliotecas de anticorpos
- humanos, ratos, tubarões
- fagos, bactérias, leveduras
35
• Construção de bibliotecas de anticorpos - Sequências de ADN que codificam os
domínios VH e VL são amplificadas por PCR
- Domínios VH e VL são juntos aleatoriamente, aumentando a diversidade funcional da biblioteca - As sequências do scFv final são
amplificadas por PCR utilizando primers que contêm sites de restrição.
- Clonagem em vectores apropriados
36
Selecção Fágica
• Apresentação combinatória de
proteínas por fusão com proteinas do revestimento do fago.
• Tecnologia excelente para
identificar interacções entre duas proteínas.
• Uma das técnicas mais
importantes para gerar proteínas
terapêuticas precursoras. Arquitectura do Fago filamentoso
Anticorpos recombinantes feitos por
apresentação por fagos
Gene III CH1 VH CL VL VL VH Gene III Expression Plasmid -
Selecção de bibliotecas de anticorpos
40
Testar afinidade e especificidade
• Ensaios imuno-enzimáticos (EIA) • Western blot
1. Humanização
a. Clonar o CDR de anticorpos de rato nas frameworks dos
anticorpos humanos.
b. Produção a partir de bibliotecas de anticorpos humanos
c. Obtenção de anticorpos humanos a partir de ratos transgénicos
de Ig humanas.
State of the art technology:
Transgenic mice
Inactivation of genes by specific deletion
Antibody genes introduced by artificial chromossomes
(Abgenix, Medarex)
Fully human antibodies (Golimumab, Denosumab, Ustecinumab, Canecinumab) High binding affinity and stability
Shealy et al, Mab. 2010
State of the art technology: Transgenic mice
AntigenLinf B
Cloning IgG
Expression in animal cells Production Formulation
43
Improved development of
antibodies!
Restore proper B-cell development and antibody production Generated antibodies also demonstrated high potency in blockingthe in vitro and in
vivo biological
effects
Favorable pharmacokinetic
s
mAbs of high affinity as a result of the broad and diverse utilization of the variable genes and the efficient hypermutation. Low Immunogenicity High stability Transgenic Mice 44
45
Imunoglobulinas (Anticorpos)
• Sufixo geral ( mab) • Anticorpos de rato (omab) • Anticorpos quiméricos (imab) • Anticorpos humanizados (zumab)Categorização dos Anticorpos Terapêuticos
46
47
48
Vantagens dos Ac terapêuticos
recombinantes
• Diminuir a imunogenicidade e melhorar a farmacocinética do Anticorpo
• Controlar a afinidade e especificidade do Anticorpo
• Manipular a estrutura proteica do Anticorpo
• Controlar as funções imunitárias
efectoras do hospedeiro (ADCC e CDC) • Produção recombinante em bactéria e
leveduras
Improving biopharmaceutical benefits
TOX TOX
Bi-specific mAb
Antibody Drug Conjugates
Glyco-Engineering mAb
Imunotoxinas: Conjugado
Anticorpo-Toxina
Antibody
Sómente as células reconhecidas
são eliminadas
Efeitos secundários maiores do que com Ac
OctreoScan num doente com carcinoma metastatico da Próstata.
Anticorpos, específicos para antigénios
cancerígenos, i.e. carcinoma da próstata, podem ser
conjugados com isótopos radioactivos, depois de injectados
