UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA
Renata Martins Parreira
PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CIMENTO ADITIVADO A BASE DE ALUMINATO DE CÁLCIO VISANDO APLICAÇÕES COMO BIOMATERIAL NA
ÁREA MÉDICO-ODONTOLÓGICA
São José dos Campos 2016
RENATA MARTINS PARREIRA
PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CIMENTO ADITIVADO A BASE DE ALUMINATO DE CÁLCIO VISANDO APLICAÇÕES COMO BIOMATERIAL NA
ÁREA MÉDICO-ODONTOLÓGICA
Tese de Doutorado defendida no Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos necessários para obtenção do grau de doutor em Engenharia Biomédica.
Orientadora: Profa. Dra. Ivone Regina de Oliveira
São José dos Campos 2016
Renata Martins Parreira
PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CIMENTO ADITIVADO A BASE DE ALUMINATO DE CÁLCIO VISANDO APLICAÇÕES COMO BIOMATERIAL NA
ÁREA MÉDICO-ODONTOLÓGICA
Tese de Doutorado aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Engenharia Biomédica, do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora.
___________________________________________________________________ Presidente: Prof. Dr. Rodrigo Sávio Pessoa (UNIVAP)
___________________________________________________________________ Orientadora: Profa. Dra. Ivone Regina de Oliveira (UNIVAP)
___________________________________________________________________ Membro Interno: Prof. Dr. Newton Soares da Silva (UNIVAP)
___________________________________________________________________ Membro Externo: Prof. Dra. Ana Maria do Espírito Santo (UNIFESP)
___________________________________________________________________ Membro Externo: Prof. Dr. Claudinei dos Santos (UERJ)
Prof. Dr. Leandro José Raniero Diretor do IP&D – UNIVAP.
São José dos Campos, 30 de agosto de 2016 Dedicatória
A minha família
Este trabalho é fruto de todo o apoio e carinho que vocês me deram nestes anos. Obrigada Mãe, Flavia, João, Lorenzo pelo amor incondicional. Obrigada André por todo companheirismo e amor. Obrigada Liz por transformar minha vida.
Agradecimentos
A Deus, por estar sempre me guiando.
A Dra. Ivone Regina de Oliveira,por mais esta oportunidade. A postura e capacidade a qual me orientou permitiu o amadurecimento das minhas opiniões e críticas, contribuindo muito para realização deste trabalho. Obrigada por todos os ensinamentos e anos de convívio.
A Professora. Dra. Cristina Pacheco por todo ensinamento e auxilio na realização dos testes com células, obrigada pela oportunidade de poder conhecer o exemplo de pessoa profissional e por toda dedicação que teve comigo neste período.
Ao Professor. Dr. Newton Soares por toda ensinamento e dedicação para realização dos testes com microrganismos. Foi um grande aprendizado ter passado pelo laboratório.
Obrigada a todos os alunos do laboratório que sempre estiveram dispostos a me ajudar. Valéria, Bruno, Roberta, Janaine, Geisa e Fernanda.
A Professora Dra. Maricilia Costa e todos os alunos do laboratório em especial ao Moises e Ana por todo ensinamento e auxilio na realização dos testes com Candida
albicans.
A Dra. Larissa Castro Raucci e Dr. Paulo Tambasco pela realização e dedicação nos testes complementares com células. Meu eterno agradecimento.
Ao Professor. Dr. Fernando Ortega por ter auxiliado na realização dos ensaios de Termogravimetria.
A Professora. Dra. Ana Maria por toda atenção e ajuda.
As companheiras de laboratório: Kelly, Vitória, Larissa, Milene e Ivy pela amizade e carinho nesses anos. Meu muito obrigada.
A Talita Luana por esses anos de amizade, por todo apoio, por me incentivar nos momentos mais difíceis. Sem dúvida a sua amizade fez com que a jornada desse trabalho ficasse mais leve. Obrigada por todo o auxílio e dedicação e que nossa sintonia e amizade fiquem para sempre.
A Priscila Leite, pela realização dos ensaios de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) além da amizade e carinho.
Nesses 10 anos de UNIVAP levo em meu coração a gratidão, por todo o apoio e carinho de professores e funcionários.
Aos professores do programa de Doutorado em Engenharia Biomédica por todo ensinamento.
Aos meus amigos que sempre estiveram ao meu lado me apoiando. Em especial a vocês que vivenciaram toda essa jornada Patrícia, Aline e Emily.
A minha família por estar sempre me apoiando para realização dos meus sonhos ao qual dedico esta minha conquista.
A você, minha Liz, que em meu ventre me deu forças para lutar e finalizar essa jornada.
A Vera, Valdevino e toda sua família pelo carinho e apoio.
Após a realização deste trabalho pude perceber que muitas pessoas contribuíram direta ou indiretamente para esta conquista; meu eterno obrigado à todos.
“Alguns homens veem as coisas como são, e dizem “Por quê?” Eu sonho com as coisas que nunca foram e digo “Por que não?”
PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CIMENTO ADITIVADO A BASE DE ALUMINATO DE CÁLCIO VISANDO APLICAÇÕES COMO BIOMATERIAL NA
ÁREA MÉDICO-ODONTOLÓGICA
RESUMO
O cimento de aluminato de cálcio (CAC) vem sendo estudado como um novo biomaterial para fins endodônticos e ortopédicos, apresentando propriedades físicas e mecânicas positivas além de bioatividade e radiopacidade. O biomaterial depende, além das suas propriedades físico-químicas, da sua capacidade de evitar contaminação durante a fase de manipulação, assim como de inibir o crescimento de microrganismos e favorecer a proliferação celular. O presente estudo teve como objetivo produzir biomateriais à base de CAC a fim de atender as recomendações do relatório do Estudo Prospectivo em Materiais Avançados para Aplicações em Saúde Médica-Odontológica, iniciado em 2007 no Centro de Gestão e Estudos Estratégicos (CGEE-Brasília). O desenvolvimento de cimentos com potencial de aplicação na área médico/odontológico. Neste trabalho, foi avaliada a influência dos aditivos alumina, zircônia, óxido de zinco, hidroxiapatita, fosfato tricálcico, quitosa e colágeno sobre as propriedades do CAC, quando comparado aos materiais comerciais usados na odontologia (MTA, Meron e Vidrion F) e na ortopedia (PMMA). Ensaios de resistência mecânica, porosidade aparente, distribuição de tamanho de poros, radiopacidade, bioatividade, comportamento frente à cultura de microrganismos e cultura de células foram realizados. Por fim foi avaliada a produção de biomaterial a base de CAC na forma porosa. As composições CAC-zircônia e CAC-fosfato tricálcico apresentaram os melhores resultados para a produção de arcabouços com poros interconectados e microestrutura homogênea. No geral, comparando-se entre todas as propriedades avaliadas neste estudo, as composições CACH-óxido de zinco e CACH-colágeno podem ser apontados como as mais promissoras para aplicação como biomaterial na área médico-odontológica.
Palavras-chave: aluminato de cálcio, biocompatibilidade, radiopacidade, capacidade bactericida, poroso.
PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF CALCIUM ALUMINATE BASED CEMENT APPLICATION AS BIOMATERIAL TO MEDICAL-DENTAL AREA
Abstract
The cement calcium aluminate (CAC) has been studied as a new biomaterial for endodontic and orthopedic purposes, with proper physical and mechanical properties as well as bioactivity and radiopacity. The biomaterial depends, in addition to its physicochemical properties, its ability to prevent contamination during the handling phase as well as inhibiting the growth of microorganisms and promote cell proliferation. This study aimed to produce biomaterials CAC-based in order to meet the Prospective Study report's recommendations in Advanced Materials for Applications in Medical-Dental Health, started in 2007 at the Centre for Strategic Studies and Management (CGEE-Brasilia). The development application potential with cements in medical / dental areas. In this work, we evaluated the influence of additives as alumina, zirconia, zinc oxide, hydroxyapatite, tricalcium phosphate, quitosa and collagen on the properties of the CAC, compared to commercial materials used in dentistry (MTA Meron and Vidrion F) and orthopedics (PMMA). Mechanical strength, porosity, pore size distribution, radiopacity, bioactivity behavior towards culture of microorganisms and cell culture were performed. Finally, we evaluated the production of biomaterial CAC based in porous form. The compositions evaluated showed superior mechanical strength comparad to commercial materials, except for the chitosan and collagen aditives. The bioactivity was proven to the compositions and to the MTA. The CAC zirconia compositions and tricalcium phosphate showed the best results for the production of scaffolds with interconnected pores and general homogeneous microstructure. Comparing the properties evaluated in all composition studied, the zinc oxide additive and CACH- collagen can be indicated as the most promising for use as biomaterial in medical and dental areas.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Diagrama de energia para a reação de hidratação do CAC, onde Ea representa a energia de ativação para a formação do hidrato e G representa a
variação da energia livre durante a reação ... 32
Figura 2: Ciclo de Le Chatelier para a reação de hidratação do CAC ... 32
Figura 3: Parâmetros que influenciam na adesão bacteriana ... 40
Figura 4: Modelo de microestrutura porosa ... 42
Figura 5: Reparo do tecido ósseo através de arcabouço ... 43
Figura 6: Esquema do processamento utilizado no método de réplica ... 44
Figura 7: Representação dos materiais utilizados no trabalho ... 46
Figura 8: Distribuição de tamanho de partículas de cimento de aluminato de cálcio (CAC) e dos compostos alumina, zircônia, óxido de zinco, hidroxiapatita, fosfato tricálcico, quitosana e colágeno ... 62
Figura 9: Resistência mecânica à compressão dos produtos comerciais (MTA, Meron, Vidrion F, PMMA) e das composições: CACH puro ou contendo diferentes teores dos compostos: alumina, zircônia, óxido de zinco, hidroxiapatita, fosfato tricálcico, quitosana e colágeno, avaliada após contato com solução SBF durante sete dias. Valores apresentados como média ± desvio padrão ... 64
Figura 10: Resistência mecânica à flexão das composições: CACH puro ou contendo 4%-p dos compostos alumina, zircônia, óxido de zinco, hidroxiapatita, fosfato tricálcico e 1%-p de quitosana e colágeno, avaliada após contato com solução SBF durante sete dias. Valores apresentados como média ± desvio padrão ... 65
Figura 11: Porosidade aparente dos produtos comerciais (MTA, Meron, Vidrion F, PMMA), CACH puro ou contendo diferentes teores dos compostos: alumina, zircônia, óxido de zinco, hidroxiapatita, fosfato tricálcico, quitosana e colágeno, avaliada (a) antes e (b) após contato com solução SBF durante sete dias. Valores apresentados como média ± desvio padrão ... 67
Figura 12: Distribuição de tamanho de poros do CACH puro ou contendo 4%-p dos compostos alumina, zircônia, óxido de zinco, hidroxiapatita, fosfato tricálcico e 1%-p de quitosana e colágeno, avaliada (a) antes e (b) após contato com solução SBF durante sete dias ... 68
Figura 13: Distribuição de tamanho de poros dos produtos comerciais MTA, Meron, Vidrion F e PMMA avaliada (a) antes e (b) após contato com solução SBF durante sete dias ... 71
Figura 14: Valores médios de radiopacidade expressos como espessura de alumínio (mm Al) e densidade óptica do CACH puro ou contendo 4%-p dos compostos alumina, zircônia, óxido de zinco, hidroxiapatita, fosfato tricálcico e 1%-p de quitosana e colágeno, quando comparado aos produtos comerciais (MTA, Meron, Vidrion F e PMMA). Valores apresentados como média ± desvio padrão ... 73
Figura 16: pH em função do tempo para SBF em contato com amostras ... 75 Figura 17: Concentração de íons cálcio em função do tempo para água em contato com as amostras ... 76 Figura 18: Concentração de íons cálcio em função do tempo para SBF em contato com as amostras ... 77 Figura 19: Micrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e identificação química elemental por espectroscopia de energia dispersiva (EDS) para amostras após contato com SBF durante 21 dias ... 80 Figura 20: Micrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e identificação química elemental por espectroscopia de energia dispersiva (EDS) para o material comercial MTA após contato com SBF durante 21 dias ... 85 Figura 21: Micrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) para os materiais comerciais Meron, Vidrion F e PMMA após contato com SBF durante 21 dias ... 86 Figura 22: Espectros Raman para CACH e CACH contendo 4 %-p (alumina, zircônia, óxido de zinco, hidroxiapatita, fosfato tricálcico) ou 1 %-p (quitosana, colágeno). Todas as amostras foram avaliadas após 21 dias em SBF a 37°C. Produtos comerciais (MTA, Meron, Vidrion F, PMMA) foram avaliados como controle... 89 Figura 23: Espectros micro-Raman de referência para hidroxiapatita ... 90 Figura 24 Micrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura ilustrando a morfologia dos microrganismos Staphylococcus aureus e Escherichia coli ... 91 Figura 25: Medidas de densidade óptica de crescimento de microrganismos
Staphylococcus aureus e Escherichia coli em contato com CACH puro ou contendo
4%-p dos compostos alumina, zircônia, óxido de zinco, hidroxiapatita, fosfato tricálcico e 1%-p de quitosana e colágeno, quando comparado aos produtos comerciais (MTA, Meron, Vidrion F e PMMA). Valores apresentados como média ± desvio padrão ... 91 Figura 26: Micrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura na presença de Staphylococcus aureus e Escherichia coli para CACH puro ou contendo 4%-p dos compostos alumina, zircônia, óxido de zinco, hidroxiapatita, fosfato tricálcico e 1%-p de quitosana e colágeno, quando comparado aos produtos comerciais (MTA, Meron, Vidrion F e PMMA) ... 95 Figura 27: Medidas de densidade óptica de crescimento do microrganismo Cândida
albicans em contato com CACH puro ou contendo 4%-p dos compostos alumina,
zircônia, óxido de zinco, hidroxiapatita, fosfato tricálcico e 1%-p de quitosana e colágeno, quando comparado aos produtos comerciais (MTA, Meron, Vidrion F e PMMA). Valores apresentados como média ± desvio padrão ... 99 Figura 28: Valores de absorbância da viabilidade celular de cultura de Fibroblastos L-929 após exposição ao eluído das amostras e ao latex (CP, controle positivo) ou não expostas (CN, controle negativo) durante 24 e 48 horas. Valores apresentados como média ± desvio padrão ... 100 Figura 29: Valores de absorbância da viabilidade celular de cultura de Osteoblastos (MG 63) após exposição ao eluído das amostras e ao latex (CP, controle positivo) ou
não expostas (CN, controle negativo) durante 24 e 48 horas. Valores apresentados como média ± desvio padrão ... 103 Figura 30: Resultados dos ensaios de adesão de Osteoblastos humanos (HOB) nas membranas em contato com as amostras por meio do microscópio confocal invertido de fluorescência, onde o núcleo celular esta destacado em azul ... 106 Figura 31: Micrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura do ensaio de adesão celular de Osteoblastos humanos (HOB) na superfície das amostras... 107 Figura 32: Viabilidade celular de cultura de Osteoblastos humanos (ATCC-HTB-85) após exposição direta as amostras, e ao DMSO (CP, controle positivo) ou não expostas (CN, controle negativo) durante 24 horas. Valores apresentados como média ± desvio padrão ... 108 Figura 33: Aspecto macroscópico da marcação por Fast Red em culturas Osteoblastos humanos (ATCC-HTB-85) expostos por 24 horas a diferentes amostras, ao DMSO (CP, controle positivo) ou somente meio (CN, controle negativo). Barra de escala = 3 mm ... 110 Figura 34: Micrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura das esponjas poliméricas utilizadas na produção de arcabouços antes da impregnação (como recebidas) ... 111 Figura 35: Curvas de análise termogravimétrica das esponjas poliméricas de poliuretano utilizadas na produção de arcabouços antes da impregnação (como recebidas)... 112 Figura 36: Espectros de Infravermelho (IR) com transformada de Fourier (FTIR) para a decomposição térmica da espuma de poliuretano (a) aquecimento até 300°C, e (b) aquecimento até 380°C ... 113 Figura 37: Micrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura da esponja polimérica rosa utilizada na produção de arcabouços após impregnação com as suspensões de CACH contendo diferentes teores de sólidos, após tratamento térmico a 800oC ... 113 Figura 38: Micrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura da esponja polimérica rosa utilizada na produção de arcabouços passando pelos tratamentos (1) uso de uma solução de álcool polivinílico (PVAl) para mergulhar as espumas antes de passar pela suspensão; (2) passagem na solução seguido da adição de uma mistura 0.2 PVAl com 0.23 silicato de sódio (SS) à suspensão de CACH ou (3) somente adição da mistura PVAL:SS, após tratamento térmico a 800oC ... 115 Figura 39: Micrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura da esponja polimérica rosa utilizada na produção de arcabouços passando pelos tratamentos (1) uso de uma solução de álcool polivinílico (PVAl) para mergulhar as espumas antes de passar pela suspensão ou (2) passagem na solução seguido da adição de uma mistura PVAl com silicato de sódio (SS) à suspensão de CAC com diferentes teores, após tratamento térmico a 800oC ... 116 Figura 40: Micrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura da esponja polimérica rosa utilizada na produção de arcabouços passado na solução de PVAL e após impregnação com as suspensões de CAC (65%-p sólidos) contendo 4%-p de diferentes compostos após tratamento térmico a 800 oC, na presença da mistura (PVAl+SS) ... 117
Figura 41: Distribuição de tamanho de poros das esponjas polimérica rosa utilizadas na produção de arcabouços após impregnação com as suspensões de CACH e CAC quando puros e contendo os compostos zircônia e fosfato, com 65%-p de sólidos após tratamento térmico a 800 oC, na presença da mistura (PVAl+SS).Todas as esponjas foram passadas na solução de PVAL antes da impregnação ... 119
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Tipo de enxertos para o reparo de tecidos ósseo ... 25 Tabela 2: Características dos materiais utilizados ... 47 Tabela 3: Condições usadas nos ensaios de distribuição de tamanho de partículas 48 Tabela 4: Concentração de sólidos das suspensões de colágeno e quitosana ... 49 Tabela 5: Resumo das características dos ensaios realizados ... 50 Tabela 6: Reagentes usados na preparação de um litro de solução de fluido corporal simulado ... 51 Tabela 7: Características das esponjas poliméricas avaliadas ... 60 Tabela 8: Condições avaliadas para a impregnação da esponja rosa (65%-p sólidos) ... 61 Tabela 9: Elementos químicos determinados por espectroscopia de energia dispersiva (EDS) para as amostras tratadas durante 21 dias em SBF (%-atômica) . 87 Tabela 10: Comparações entre grupos pelo pós-teste de Fisher dos valores de crescimento de Staphylococcus aureus ... 92 Tabela 11: Comparações entre grupos pelo pós-teste de Fisher dos valores de crescimento de Escherichia coli ... 93 Tabela 12: Comparações entre grupos pelo pós-teste de Fisher dos valores de crescimento de Cândida albicans ... 100 Tabela 13: Comparações entre grupos pelo pós-teste de Fisher dos valores de viabilidade celular de culturas de células L-929 expostas por 24 horas a diferentes amostras, ao látex (CP, controle positivo) ou somente meio (CN, controle negativo) ... 102 Tabela 14: Comparações entre grupos pelo pós-teste de Fisher dos valores de viabilidade celular de culturas de células L-929 expostas por 48 horas a diferentes amostras, ao látex (CP, controle positivo) ou somente meio (CN, controle negativo) ... 102 Tabela 15: Comparações entre grupos pelo pós-teste de Fisher dos valores de viabilidade celular de culturas de células MG 63 expostas por 24 horas a diferentes amostras, ao látex (CP, controle positivo) ou somente meio (CN, controle negativo) ... 104 Tabela 16: Comparações entre grupos pelo pós-teste de Fisher dos valores de viabilidade celular de culturas de células MG 63 expostas por 48 horas a diferentes amostras, ao látex (CP, controle positivo) ou somente meio (CN, controle negativo) ... 104 Tabela 17: Comparações entre grupos pelo pós-teste de Fisher dos valores de viabilidade celular de culturas de células Osteoblastos humanos (ATCC-HTB-85) expostas por 24 horas a diferentes amostras, ao DMSO (CP, controle positivo) ou somente meio (CN, controle negativo) ... 109
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALP = Atividade de fosfatase alcalina ANOVA = Análise de variância
ASTM = Sociedade americana para testes e materiais (American Society for
Testing and Materials)
CAC = Cimento de aluminato de cálcio
CACH = Cimento aluminato de cálcio homogêneo CGEE= Centro de Gestão e Estudos Estratégicos CIV = Cimentos de ionômero de vidro
CN = Controle negativo CP = Controle Positivo CSC = Silicato de cálcio
DAPI = 4’6-diamidino-2- -phenylindole
DMEM = Meio mínimo essencial modificado Dulbecco's DMSO = Dimetilsulfóxido (Dymethyl sulfoxide minimum) DNA = Ácido desoxirribonucleico
DO = Densidade óptica Ea = Energia de ativação
EDS = Espectroscopia por dispersão de energia EDTA = Ácido etilenodiamino tetra-acético
FTIR = Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (Fourier
transform infrared spectroscopy)
GGTP = Gama-glutamil-transpeptidase (Gama glutamyl transpeptidase) HA = Hidroxiapatita
HMDS = Hexamethyldisilazane
IR = Espectro eletromagnético na região infravermelha (Infrared spectrum) ISO = Organização internacional para padronização
LB = Luria Broth
MEM= Meio mínimo essencial
MEV = Microscopia eletrônica de varredura MMA = Metilmetacrilato
MTA = Agregado de trióxido mineral (Mineral trioxide aggregate) MTT = Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazolio NIH = Instituto Nacional de Saúde (National Institutes of Health) PBS = Tampão fosfato-salino
pH = Potencial de hidrogênio PMMA = Polimetilmetacrilato PS = Poliestireno
PU = Poliuretano
PVAl = Àlcool polivinílico PVC = Policloreto de vinila
SBF = Solução simuladora de fluido corporal simulado SFB = Soro fetal bovino
SS = Silicato de sódio TG = Termogravimetria
UFC = Unidade formadora de colônia
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 20
2 OBJETIVOS ... 23
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 24
3.1 Biomateriais usados na área médico-odontológica ... 24
3.2 Cimento de aluminato de cálcio ... 29
3.3 CAC como biomaterial ... 33
3.4 Propriedades relevantes para uso do CAC como biomaterial ... 36
3.5 Arcabouços e a técnica de réplica ... 42
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 46
4.1 Avaliação da influência de compostos nas propriedades do cimento de aluminato de cálcio ... 46
4.2 Resistência mecânica e porosidade aparente ... 51
4.3 Distribuição de tamanho de poros ... 52
4.4 Radiopacidade ... 53
4.5 Bioatividade ... 54
4.6 Comportamento frente à cultura de microrganismos ... 54
4.6.1 Staphylococcus aureus e Escherichia coli ... 55
4.6.2 Cândida albicans ... 56
4.7 Comportamento frente à cultura de células ... 56
4.7.1 Fibroblastos e Osteoblastos ... 56
4.7.2 Osteoblastos humanos (HOB) ... 57
4.7.3 Osteoblastos humanos (ATCC-HTB-85) ... 58
4.8 Avaliação da produção de arcabouços de cimento de aluminato de cálcio ou suas composições ... 59
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 62
5.1 Resistência mecânica e porosidade aparente ... 63
5.2 Distribuição de tamanho de poros ... 67
5.3 Radiopacidade ... 72
5.4 Bioatividade ... 74
5.5 Comportamento frente à cultura de microrganismos ... 90
5.5.1 Staphylococcus aureus e Escherichia coli ... 90
5.5.2 Cândida albicans ... 98
5.6 Comportamento frente à cultura de células ... 100
5.6.1 Fibroblastos e Osteoblastos ... 100
5.6.2 Osteoblastos humanos (HOB) ... 105
5.6.3 Osteoblastos humanos (ATCC-HTB-85) ... 107
5.7 Avaliação da produção de arcabouços de cimento de aluminato de cálcio ou suas composições ... 111
6 CONCLUSÕES ... 121
7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 123
8 Produção Científica ... 124
8.1 Publicados em periódicos ... 124
8.2 Apresentados em congresso ... 124
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 127
Anexo A: Calcium aluminate cement-based compositions for biomaterial applications. Ceramics International, v. 42, p. 11732-11738, 2016... 140
Anexo B: Characterization of Calcium Aluminate Cement Phases when in Contact with Simulated Body Fluid. Materials Research (São Carlos. Impresso), v. 18, p. 382-389, 2015. ... 141 Anexo C: Influence of radiopacifier additives on calcium aluminate cement properties. Materials Research (São Carlos. Impresso), v. 17, p. 1295-1301, 2014. ... 142
1 INTRODUÇÃO
A expectativa de vida do brasileiro vem sendo ampliada de forma consistente, principalmente a partir da década de 40. Estima-se, para 2020, 30 milhões de brasileiros com mais de 60 anos. Com o incremento da longevidade e de traumas decorrentes de acidentes de trânsito e violência, aumenta também a demanda por produtos e tecnologias de preservação da saúde e qualidade de vida (1). Assim, é fundamental consolidar a indústria de produtos para a saúde no Brasil como forma de atender a demanda crescente por procedimentos de alta complexidade.
O Estudo Prospectivo em Materiais Avançados para Aplicações em Saúde Médica-Odontológica, iniciado em 2007 no Centro de Gestão e Estudos Estratégicos (CGEE) resultou na priorização de seis tópicos, entre os quais estão materiais dentários e materiais para engenharia tecidual como o arcabouço.
Com relação ao tópico materiais dentários, dois materiais merecem destaque dentro dos próximos 15 anos e destina-se, de modo particular, a melhorar a qualidade de vida da população (1): Cimentos de ionômero de vidro (CIV) e cerâmicas odontológicas.
Entre as opções de materiais dentários disponíveis no mercado, o cimento ionômero vidro (CIV) se destaca pela facilidade de aplicação, adequação e estética. Por estes e outros motivos, os CIV estão presentes na maioria dos consultórios odontológicos do mundo, sendo, portanto, um material relevante economicamente (1).
As aplicações dos CIV são várias, incluindo uso para cimentar próteses e brackets ortodônticos, em restaurações temporárias e como base de restaurações profundas, em selantes e, ainda, na medicina como cimentos ósseos (2).
As principais empresas fabricantes de cimentos ionômeros de vidro se encontram na Europa, Japão, Estados Unidos e Austrália. No Brasil, os ionômeros são, em sua ampla maioria, importados e embalados em território nacional. Dessa forma, entre as recomendações do relatório do CGEE está a de desenvolver composições de cimentos, a exemplo do ionômero de vidro, incluindo a etapa de testes toxicológicos (1).
Já, a engenharia de tecidos para mimetizar, por exemplo, cartilagem e osso, depende de um biomaterial que sirva como arcabouço para a cultura de células e o desenvolvimento do novo tecido (reconstrução óssea). O projeto de um arcabouço
objetiva mimetizar o funcionamento da matriz extracelular em uma estrutura coordenada no tempo e organizada no espaço, sendo necessário codificar os sinais biológicos dentro do arcabouço para controlar a adesão, migração, proliferação e diferenciação celular. Para isso, é preciso estabelecer um compromisso entre as propriedades físico-químicas e biológicas do arcabouço (3).
Diversos materiais vêm sendo estudados com vistas à produção de arcabouços com características específicas, a exemplo de polímeros biorreabsorvíveis, fosfatos de cálcio, compósitos de polímeros (naturais ou sintéticos) com fosfatos de cálcio, alginato e quitosana. Entretanto, arcabouços têm sido produzidos em pequenas quantidades e de modo artesanal, dependendo, muitas das vezes, de insumos importados (caros e com baixa disponibilidade). Além disso, a compatibilização das propriedades mecânicas com as biológicas de um arcabouço ainda não foi alcançada plenamente (1,4).
Diante da demanda pelo desenvolvimento de novos materiais que possam ser aplicados como materiais dentários e para o reparo ósseo, pesquisas vem sendo realizadas envolvendo o uso de cimento de aluminato de cálcio (CAC) (5,6).
O CAC, quando estudado para o preenchimento do canal dentário, vem mostrando superar algumas deficiências do produto comercial a base de silicato de cálcio (CSC) mais utilizado para tal fim (MTA, mineral trioxide aggregate), tais como longo tempo de endurecimento, alta porosidade e baixa resistência mecânica (7).
Quando aplicado como biomaterial, o CAC tem apresentado ainda outras vantagens como: I) fluidez e melhores condições de trabalhabilidade (8,7), II) preparação a temperatura ambiente com possibilidade de ajuste da reologia e tempo de endurecimento, alta resistência mecânica inicial e boa resistência a corrosão (9), III) biocompatibilidade quando testado em tecidos subcutâneos de ratos sem a identificação de reações inflamatórias (10,11), IV) habilidade de formar apatita in situ indicando sua bioatividade (9,6), V) capacidade de atuar como barreira contra a microinfiltraçao bacteriana (12), VI) ligeira expansão permitindo boa retenção ao dente e VII) boa aderência entre o CAC e o dente (9).
Cimentos usados para o reparo ósseo devem preencher vários requerimentos médicos tais como baixo valor de temperatura de cura (para evitar necrose térmica do tecido ósseo durante o endurecimento do cimento), tempo de endurecimento moderado (tal que o cimento não cure tão rápido ou tão devagar) e altos valores de
resistência à compressão (permitindo ao cimento curado suportar as cargas de compressão envolvidas nas atividades diárias).
O cimento ósseo de maior aplicação é composto, principalmente, de polimetilmetacrilato (PMMA) o qual apresenta excelentes propriedades mecânicas comparadas a outros polímeros (13). Entretanto, o PMMA apresenta algumas deficiências com relação a propriedades de manuseio e biocompatibilidade. Além disso, sua reação é exotérmica resultando em excesso de calor no tecido circundante o que pode causar danos e não é injetado diretamente após a mistura por causa de sua consistência muito líquida e cheiro forte (13).
Alguns estudos (14,15) tem reportado a aplicação do CAC no reparo de defeitos ósseos, já que sua composição é bastante semelhantes ao do dente e osso humano. O uso deste cimento apresenta ainda outras vantagens como alta viscosidade, permitindo injeção direta após a mistura e alta biocompatibilidade (13,16). Além disso, a combinação de CAC-zircônia resultou em valores de resistência à compressão similar ao PMMA (13).
Desta forma, a exemplo da composição CAC-zircônia, outras composições podem ser desenvolvidas envolvendo o uso de materiais que apresentam potencial como biomateriais como a alumina, o óxido de zinco, a hidroxiapatita, o fosfatos de tricálcico, a quitosana e o colágeno.
2 OBJETIVOS
O objetivo geral desse trabalho foi produzir e caracterizar composições a base de cimento aluminato de cálcio (CACH) visando aplicações como biomaterial na área médico-odontológica.
Os objetivos específicos foram:
• Produzir composições a base de CAC por meio da adição dos compostos (alumina, zircônia, óxido de zinco, hidroxiapatita, fosfato tricálcico, quitosana e colágeno);
• Caracterizar as propriedades físico-químicas das composições obtidas comparando-as com os produtos comerciais comumente usados na odontologia (MTA e CIV) e ortopedia (PMMA): resistência mecânica à compressão uniaxial e à flexão, porosidade aparente, distribuição de tamanho de poros, radiopacidade e bioatividade.
• Avaliar as propriedades biológicas das composições obtidas comparando-as com os produtos comerciais comumente usados na odontologia (MTA e CIV) e ortopedia (PMMA): viabilidade bacteriana, viabilidade celular por diferentes metodologias e linhagens celulares, adesão celular e fosfatase alcalina.
• Avaliar a produção de arcabouços a partir de CAC e suas composições por meio do método de réplica da esponja polimérica.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Biomateriais usados na área médico-odontológica
Em todo o mundo, cerca de 2,2 milhões de intervenções cirúrgicas são realizadas com o objetivo de reconstruir frações do tecido ósseo danificado por traumas devido a acidentes (automobilístico ou trabalho), doenças ósseas (osteoporose, osteoartrose e a perda de massa óssea) além da falta de cuidado ou higiene (por exemplo, perda dos dentes) (17,18).
O tecido ósseo, quando lesado, é capaz de regenerar, fenômeno que demonstra sua permanente vitalidade (19,20). A regeneração óssea é um termo aplicado ao processo biológico em que a estrutura e a função do tecido lesado ou perdido são completamente restaurados (21). Entretanto, defeitos com dimensões reduzidas reparam-se com facilidade em virtude de disporem de mecanismo reparador. Hirn et al, afirmaram que defeitos ósseos menores que 60 mm3 não necessitam de preenchimento com substitutos ósseos pois remodelam com baixo risco de fratura (5%), enquanto os defeitos maiores requerem estabilização devido ao maior risco de fratura (17%) (22). Porém, este mecanismo não ocorre em defeitos que apresentam dimensões maiores tornando necessária a substituição óssea ou dentária por biomateriais (23,24).
Os biomateriais são muitas vezes necessários para correção de falhas ósseas, seja para dar suporte, preencherem espaços vazios ou acelerar a reparação biológica dos defeitos ósseos (25). Os enxertos ósseos são amplamente utilizados na medicina, em cirurgias plásticas e ortopédicas (26,27), na odontologia em reconstruções maxilo-mandibulares e aumentos da altura óssea, possibilitando a colocação de implantes ósseos integrados (28).
Diante da necessidade do reparo do tecido ósseo, podem ser utilizado diferentes tipos de enxertos, como apresentado na Tabela 1.
Tabela 1: Tipo de enxertos para o reparo de tecidos ósseo
Fonte: (29,30)
A aplicação de enxertos aloplásticos vem ganhando cada vez mais aceitação no reparo do tecido ósseo. Eles podem ser produzidos a partir de substratos metálicos; poliméricos, naturais ou sintéticos; cerâmicos; ou uma mistura de dois ou mais tipos, denominados compósitos (29,30). Estes materiais apresentam vantagens, como baixo risco de contaminações virais e bacterianas. São disponibilizados comercialmente (31) podendo ser de fácil dissolução e absorção, ao mesmo tempo podem estimular a formação óssea (31).
O material ideal para a substituição de tecido ósseo deve ter resistência, ser facilmente moldado ou manipulado podendo ser pré-fabricado, mas deve ser implantado numa única etapa. Além disso, deve possuir baixa condutividade térmica e ser radiopaco (32).
Algumas outras propriedades são essenciais aos biomateriais, como a biocompatibilidade, osteoindução, osteocondução, e a osteogênese, fatores importantes para que o biomaterial possa integrar-se ao tecido adjacente, possa restaurar a estrutura tecidual óssea lesada além de devolver a funcionalidade necessária a esse tecido com o intuito de melhorar a qualidade de vida dos pacientes (33,34).
Na ortopedia, o biomaterial aloplástico de maior destaque na fixação de próteses, consolidação de fraturas ou reconstrução de defeitos ósseos é o cimento ósseo, também conhecido como cimento ortopédico, o polimetilmetacrilato (PMMA).
O PMMA é uma resina de base acrílica, biocompatível, composto pela mistura de um polímero (pó) poli(metil-2-metilpropenoato) e um monômero (líquido), o éster metil propenoato de metila, os quais são unidos pelo processo de polimerização (35).
Este material foi desenvolvido em 1928 e colocado no mercado em 1933 através da empresa alemã Rohm and Haas (36). Partes para substituição óssea podem ser pré-fabricadas reduzindo o tempo de cirurgia facilitando manuseio e apresentando excelente resultado estético (37).
Biologicamente, o PMMA é considerado inerte e estável sendo insolúvel e não se degrada ao longo do tempo (37). O PMMA apresenta um papel importante dentro das áreas médica e odontológica onde atualmente, todos os cimentos ósseos no mercado são baseados quimicamente na mesma substância, o metilmetacrilato (MMA), um éster do ácido metacrílico.
Entretanto, esse material apresenta algumas limitações, principalmente durante a fase de polimerização da mistura onde ocorre um aumento da temperatura, reação química exotérmica (38) e um dos produtos desta reação química é o monômero metacrilato de metila, substância tóxico que induz o aumento da enzima GGTP (gama-glutamil-transpeptidase) na corrente sanguínea, que sinaliza lesão de hepatócitos, diminuindo a pressão arterial e a pressão parcial de 02 no sangue. Este
monômero residual combinado com o aumento de temperatura da massa pode provocar a necrose nos tecidos adjacentes ao osso, e fibrose entre o cimento e o osso, sendo este um dos fatores de soltura asséptica do implante, dificultando assim sua aplicação em alguns casos (39).
Efeitos adversos mais sérios e frequentes são relatados pelo próprio fabricante na bula do material, sendo esses: infarto do miocárdio, acidente cerebrovascular, tromboflebite, hemorragia e hematoma, perda ou deslocamento da prótese, infecção superficial ou profunda da lesão e irregularidade na condução cardíaca em curto prazo (40). Outros inconvenientes apontados a respeito do PMMA incluem: a ausência de bioatividade entre o cimento e osso, susceptibilidade a falhas quando as forças de tração estão presentes e contração volumétrica significativa durante a
polimerização, o que induz tensões e enfraquece a integridade da interface cimento-osso.
Devido a tais limitações apresentadas pelo PMMA, materiais alternativos vêm sendo estudados com destaque para os ionômeros de vidro.
O cimento de ionômero de vidro (CIV) é um agente cimentante bastante difundido no mercado odontológico. Possui inúmeras vantagens sobre os cimentos de PMMA, como boa adesão ao osso, estabilidade em ambiente aquoso e mínima reação exotérmica de polimerização (41,42). Devido a suas características químicas e sua biocompatibilidade, os cimentos de ionômero de vidro têm encontrado indicações fora da odontologia como cimentos cirúrgicos em implantes ortopédicos (43).
Os CIV são materiais que consistem de partículas inorgânicas de vidro dispersas numa matriz insolúvel de hidrogel. As partículas de vidro têm função de material de preenchimento e são fonte de cátions para formação de ligações cruzadas com as cadeias poliméricas (44). Os CIV surgiram dos estudos de Wilson & Kent em 1971, sendo introduzidos no mercado somente em 1975 (45).
Uma das vantagens dos CIV está em sua capacidade de adesão ao dente devido à troca de íons entre o material e a estrutura dentária, contribuindo para o vedamento marginal e consequentemente para a manutenção da longevidade da restauração. Apresentam liberação contínua de flúor, além de baixa solubilidade e excelente biocompatibilidade (43,46).
Entretanto, apresentam algumas características indesejáveis em materiais restauradores, as quais incluem baixa resistência à abrasão, resistência mecânica reduzida, baixa dureza, translucidez reduzida, friabilidade, estética pobre (devido à opacidade do cimento) (47,48).
Hatton et al. (49), analisaram o cimento de ionômero de vidro e concluíram que este é um biomaterial moderno, com grandes adequações nas áreas médica e odontológica, mas deve ser usado com moderação e cautela, visto que se faz necessário mais estudos e pesquisas sobre ele (49).
Outras classes de biomateriais com destaque no reparo de tecido ósseo são as biocerâmicas por possuírem uma estrutura semelhante ao componente inorgânico do osso; serem biocompatíveis, osteocondutivas e não possuírem proteínas em sua composição o que proporciona ausência de resposta imunológica (50), diminuindo o
risco de rejeição pelo organismo (25) além de possuírem um alto tempo de degradação in vivo (50), permitindo a remodelação óssea no sítio do implante.
Biocerâmicas comumente usadas incluem zircônia, alumina, hidroxiapatita e biovidro (51,18). São utilizadas em inúmeras áreas (ortopédica, buco-maxilo-facial e odontológica) e em diferentes aplicações clínicas no organismo humano.
Na odontologia, além da utilização da hidroxiapatita (HA) em procedimentos cirúrgicos onde há a necessidade de reparação óssea, muitas pesquisas vêm adicionando está biocerâmica na composição de cimentos endodônticos na tentativa de melhorar as propriedades físico-químicas e biológicas desses materiais (52).
Cimento a base de fosfato de cálcio também vem sendo utilizado para reparação de defeitos cranianos em seres humanos (53). Uma vantagem do uso de cimentos é a possibilidade de preencher espaços vazios no osso de maneira uniforme.
Outro cimento cerâmico com grande destaque e ampla utilização na odontologia é o agregado de trióxido mineral (MTA). Foi desenvolvido na Universidade de Loma Linda no estado da Califórnia nos Estados Unidos, com o intuito de selar as comunicações existentes entre as porções internas e externas do dente (54).
O MTA é uma mistura de pó hidrofílico constituído de silicato tricálcico, óxido tricálcico, óxido de silicato e aluminato tricálcico além do óxido de bismuto, que lhe confere radiopacidade (55). Após o endurecimento do MTA, é formado óxido de cálcio, que reage com os fluidos corporais produzindo hidróxido de cálcio.
Quando em contato com fluidos corporais o hidróxido de cálcio se dissocia em íons cálcio e hidroxila (52). A liberação de íons hidroxila faz com que eleve o pH do meio promovendo a ativação da fosfatase alcalina e iniciando o processo de mineralização.
Os íons cálcio, quando em contato com o tecido conjuntivo, determinam uma área de necrose formando o dióxido de carbono, onde junto com o hidróxido de cálcio proporcionam a formação de cristais de calcita (carbonato de cálcio) que vão servir como núcleo de calcificação. A alcalinidade do meio estimula o tecido conjuntivo a secretar uma glicoproteína (fibronectina) que juntamente com os cristais de calcita, estimulam a formação de colágeno tipo I com o cálcio, induzindo o processo de mineralização (56). Por causa dessa alta alcalinidade também se atribui
ao MTA a característica de tornar o meio inóspito ao crescimento de algumas bactérias (57).
Por ser um material bioativo e biocompatível, diversos estudos na literatura avaliaram as propriedades físico-químicas e biológicas do MTA como cimentos endodônticos (58) além do seu uso no reparo de defeitos ósseos, por facilitar a regeneração do ligamento periodontal, bem como a deposição de osso novo (57).
Entretanto, o MTA apresenta algumas limitações clínicas por apresentar difícil manipulação e longo tempo de presa. Também apresenta baixa resistência mecânica à compressão e este é um importante fator a ser considerado quando um material reparador é colocado em uma cavidade que irá sofrer pressão oclusal, como preenchimento de canal do dente (57).
Um novo cimento a base de aluminato de cálcio (CAC) tem sido estudado visando preservar as propriedades positivas e aplicações clínicas do MTA superando as limitações apresentadas por esses materiais (16,8)
A formulação, a princípio, fora voltada para aplicação na odontologia, mais especificamente na endodontia, tendo alcançado desempenho suficiente para se transformar em alternativa para MTA (16,8). O aluminato de cálcio também tem sido estudado como um cimento reparador em ortopedia visto que sua biocompatibilidade já fora comprovada em testes realizados na odontologia (8).
O CAC pertence a classe das cerâmicas as quais formam um corpo sólido por meio de reações químicas em meio aquoso com a vantagem destas ocorrerem à temperatura ambiente (9).
3.2 Cimento de aluminato de cálcio
O cimento de aluminato de cálcio (CAC) surgiu no século 19 para substituir o silicato de cálcio (cimento Portland) em regiões onde o cimento ficava exposto a altos teores de sulfato e de água (59). A partir de 1919 a companhia francesa Lafarge passou a comercializar o CAC como um material resistente a corrosão por sulfato. Em 1920 o CAC passa a ser reconhecido como ligante para concretos refratários, porém, somente em 1950, o CAC de alta pureza foi comercializado para indústria de refratário (59).
O CAC é o ligante hidráulico mais utilizado em concretos refratários com a finalidade de obter um material com propriedades superiores em relação à resistência mecânica, térmica e química, e de elevada pureza (60).
As principais características do CAC como ligante hidráulico é o fato de ter baixo custo e de apresentar propriedades refratárias como resistência mecânica e alta resistência a agentes corrosivos (61,62).
A produção comercial do CAC ocorre através de um processo de calcinação de uma mistura de Al2O3 e CaCO3, a temperaturas entre 1315 e 1425°C. O aluminato
de cálcio formado é resfriado e então moído na granulometria desejada. De uma forma geral a formação do CAC pode ser descrita por meio da seguinte reação química.
CaCO3 + Al2O3 → Ca(AlO2)2 + CO2↑ (1)
Apesar da simplicidade da reação química descrita acima, a formação do CAC ocorre de uma maneira complexa. No início do processo de fusão da mistura formam-se fases cristalinas de aluminatos com altos teores de Ca. Com o aumento da temperatura mais CaO e Al2O3 reagem com os primeiros produtos formados,
produzindo outras fases com menores teores de Ca (59).
Neste processo, a quantidade e o tipo de fase cristalina formada depende da razão entre CaO e Al2O3 na mistura, da temperatura alcançada e do procedimento
de resfriamento do material obtido.
Nas condições de produção, utilizadas atualmente, obtém-se CACs de alta pureza com diferentes proporções entre as diversas fases cristalinas, dependendo da aplicação a que se destina este material (62). Estas fases apresentam distintas propriedades no que se refere à reatividade em relação à água, já que, em geral, quanto maior a quantidade de CaO, maior a reatividade. As principais fases cristalinas presentes em cimentos comerciais são (63):
-A fase C12A7 (12CaO. 7Al2O3) a qual também se hidrata rapidamente e, por esse
motivo, pode ser utilizada com o intuito de controlar o tempo de pega de cimentos comerciais;
-A fase CA (CaO. Al2O3) hidrata-se mais lentamente, quando comparada com a fase
C3A e C12A7. Apesar disso apresenta um rápido endurecimento após ter início o
-A fase CA2 (CaO. 2Al2O3) requer um longo tempo para se hidratar. A presença
desta fase pode acelerar o processo de pega da fase CA, entretanto o efeito oposto não é observado.
O processo de hidratação das diferentes fases do CAC inicia-se quando a água entra em contato com a superfície das suas partículas, sendo esta etapa descrita pela seguinte equação química:
CaO.Al2O3 + 4H2O ⇔ Ca2+ + 2Al(OH)4- (2)
Os íons Al(OH)4-, formados na reação descrita pela Equação (2) comportam-se
como uma base, sendo que, uma pequena parte deles se dissocia em íons Al3+ e OH-, estabelecendo um equilíbrio. Este fenômeno é o responsável pelo aumento no pH do meio:
Al(OH)4- ←���⃗ Al3+ + 4 OH- Kb= [Al3+ ] . [OH - ] 4
[Al(OH)4- ]
= 10-35 (3)
A ocorrência destas reações químicas provoca a dissolução das fases anidras que compõem o CAC, proporcionando um aumento das concentrações dos íons Ca2+ e Al(OH)4- em solução. Este processo continua até que um estado de
saturação, em relação à dissolução do cimento, seja alcançado. Desta forma, o processo atinge um equilíbrio químico e a dissolução do cimento é interrompida. No entanto, a solubilidade dos produtos da reação desses compostos com a água (chamados de hidratos de aluminato de cálcio) é menor do que das suas fases anidras (63). Por esse motivo, existe uma tendência natural para que ocorra a precipitação desses hidratos formados (62).
Apesar de favorecida, a precipitação dos hidratos envolve um processo lento de nucleação, durante o qual não ocorre precipitação. Este tempo de espera, necessário para que se atinjam condições ideais para a precipitação dos hidratos é conhecido como “período de indução”.
A nucleação é um fenômeno dinâmico que pode ser descrito considerando que os íons Ca2+ e Al(OH)4- e as moléculas de água estão em constante movimento,
chocando-se uns contra os outros. Desta forma, ligações entre estas espécies ocorrem aleatoriamente, sendo constantemente formadas e rompidas. Em algum
momento um conjunto de espécies pode permanecer unido por um tempo maior que o médio, permitindo assim o aumento de seu tamanho por meio da ligação de outras espécies. Ao se atingir um determinado tamanho crítico verifica-se a formação de um núcleo estável. Esta ideia corresponde à superação da barreira Ea, de acordo
com o esquema mostrado a seguir (62).
Figura 1: Diagrama de energia para a reação de hidratação do CAC, onde Ea representa a energia de ativação para a formação do hidrato e G representa a variação da energia livre durante a reação
Fonte: (62)
A partir da formação dos primeiros núcleos estáveis, a velocidade de precipitação passa a não ser mais limitada por Ea, uma vez que, deste momento em
diante, o processo deve ocorrer por meio do crescimento dos núcleos já formados. Desta maneira, estes núcleos crescem rapidamente retirando os íons Ca2+ e Al (OH)4- da solução, proporcionando a retomada da dissolução das partículas de
cimento o que possibilita um contínuo crescimento dos grãos de hidratos e consequente precipitação.
Esse mecanismo pode ser esquematicamente representado através do ciclo de Le Chatelier, mostrado na Figura 2. Esse ciclo representa a contínua dissolução do cimento anidro e a precipitação dos hidratos formados que prossegue até que todas as partículas do cimento anidro, em contato com a água, sejam consumidas (62).
Figura 2: Ciclo de Le Chatelier para a reação de hidratação do CAC
Fonte: (8)
3.3 CAC como biomaterial
O uso do CAC como biomaterial teve seu início na odontologia onde Hermansson, em 1987, (64) desenvolveu um processo químico com o objetivo de criar um novo restaurador dental mais biocompatível do que a amálgama. No ano de 1990 foi depositada a primeira patente do CAC como um material restaurador da odontologia (64). A formulação do material foi finalizada pela empresa Doxa AB e uma versão comercial do cimento aluminoso chamado de Doxadent®, foi introduzida no mercado odontológico no mesmo ano (64).
O cimento aluminato de cálcio vem sendo estudado como um cimento hidraulico para aplicações na área medica odontológica (65). Testes comprovando a sua biocompatibilidade foram realizados (66,65), alem de o CAC ser bioativo promovendo a formação de hidroxiapatita na superfície quando em contato com uma solução simuladora de fluido corporal (67).
Estudos que envolveram o CAC para aplicação na odontologia, mostraram que após dois anos do material em in vivo uma camada de apatita tinha sido formada em sua superfície (9).
Mais recentemente, um cimento endodôntico a base de cimento de aluminato de cálcio também foi desenvolvido na Universidade Federal de São Carlos (8,7).
O CAC tem sido investigado como biomaterial na odontologia apresentando vantagens: 1) fluidez e boas condições de trabalhabilidade (8,7), 2) preparação a temperatura ambiente com possibilidade de ajuste da reologia e tempo de endurecimento, alta resistência mecânica inicial e boa resistência a corrosão (9), 3) biocompatibilidade quando testado em tecidos subcutâneos de ratos sem a identificação de reações inflamatórias (10,11), 4) habilidade de formar apatita in situ indicando sua bioatividade (9,6), 5) capacidade de atuar como barreira contra a microinfiltraçao bacteriana (12), 6) ligeira expansão permitindo boa retenção ao dente e 7) boa aderência entre o CAC e o dente (9).
Além das características citadas acima, o uso deste cimento como biomaterial também pode ser indicado para a ortopedia devido a suas características inerentes como alta viscosidade, permitindo injeção direta após a mistura, baixa reação exotérmica e alta biocompatibilidade (13,16). Além disso, estudos tem reportado a aplicação do CAC na reparação de defeitos ósseos, devido sua composição e seu coeficiente de expansão serem bastante semelhantes ao do dente e osso humano (14,15).
Composição de CAC contendo zircônia também foi desenvolvida especialmente para aplicação em estabilização de fraturas de compressão vertebral, resultando em valores de resistência à compressão similar ao PMMA, estabilidade após seis meses em solução tampão de fosfato e porosidade de 10-15%. Investigações em vértebras de ovelhas indicaram menor inflamação e melhor adaptação do osso em materiais à base de CAC quando comparados com o PMMA (13).
A exemplo da composição CAC-zircônia, outros materiais também vem sendo combinados visando melhorar as suas propriedades tais como alumina, óxido de zinco, hidroxiapatita, fosfato tricálcico, quitosana e colágeno.
Zircônia e alumina apresentam vantagens quando aplicados como biomateriais devido à adequada biocompatibilidade, resistência à corrosão, estabilidade química, alta resistência à compressão e ao desgaste podendo atuar como reforço biocerâmico (68). Muitos estudos têm focado na produção de compósitos de fosfato de cálcio bifásico sendo verificado que as propriedades mecânicas incluindo
biocompatibilidade e formação de osso com os tecidos adjacentes duro aumentam com a adição de alumina (69).
Óxido de zinco também se destaca devido a sua capacidade antibactericida e biocompatibilidade (70). Compósitos cerâmicos contendo zinco fornecem novas possibilidades na engenharia de tecido ósseo, visto que: (1) em compostos Zn-fosfato tricálcico a presença de apatita acentuou a proliferação de células (71), e (2) cerâmicas de aluminato contendo zinco apresentaram ação estimuladora sobre as células osteoblastos e favoreceram a diferenciação e o processo de mineralização (72).
As cerâmicas de fosfato de cálcio possuem variadas aplicações biomédicas sendo usadas para reparar defeitos ósseos, no aumento e manutenção de cristas ósseas alveolares, na recolocação de raiz dentária, em implantes auriculares, no revestimento de implantes metálicos, entre outros. Entre os biomateriais de fosfato de cálcio mais comuns encontram-se a hidroxiapatita e o fosfato tricálcico (73).
A hidroxiapatita [Ca10(PO4)6(OH)2, HA] é uma das mais interessantes
biocerâmicas devido as suas similaridades química e cristalográfica com os componentes inorgânicos encontrados nos tecidos duros (dentes e ossos), (74) sendo assim utilizada na forma densa ou particulada para implantes metálicos, próteses na substituição de ossos e dentes, e na produção de biocompósitos (75). Além disso, este composto apresenta alta biocompatibilidade, não induzindo a rejeição por parte do tecido ósseo e possibilitando a osteointegração e a osteocondução (76).
Cimentos com alta resistência mecânica preparados a partir de fosfatos de cálcio e aluminato de cálcio tem sido desenvolvidos e avaliados para uso na reparação de ossos e articulações. Neste caso, a presença do fosfato de cálcio tende a melhorar a atividade biológica do material, enquanto o aluminato é responsável por fornecer alta resistência mecânica e uma boa resistência à corrosão quando em contato com fluidos corporais (77,78).
Quitosana e colágeno, por sua vez, são biopolímeros que vem ganhando destaque como biomaterial (79,80). O aumento da aplicação do colágeno se deve ao seu baixo índice de reações imunológicas e sua capacidade de formar fibras a partir de preparações solúveis, cujas propriedades são similares àquelas encontradas nos tecidos. A quitosana apresenta características de não toxicidade, biocompatibilidade, capacidade antioxidante, antimicrobiana e propriedades anti-inflamatória e
cicatrizante. Seu uso ocorre principalmente na área biomédica (suturas cirúrgicas, implantes dentários, reconstituição óssea, lentes de contato, liberação controlada de medicamentos, encapsulamento de materiais) (68). Conforme reportado na literatura (81), a incorporação de nanopartículas de quitosana a cimentos dentários melhorou significativamente as suas propriedades anti-microbianas e a capacidade de lixiviação dos componentes antibacterianos. Entretanto, a quitosana apresenta limitações quanto a sua resistência mecânica e funções biológicas e por isso, algumas partículas inorgânicas como hidroxiapatita, fosfato de cálcio e sílica estão sendo incorporadas a ela (82). Cabe ressaltar, que entre as propriedades necessárias para uso como biomaterial relatadas acima se destaca a necessidade do material apresentar adequada resistência mecânica. Além disso, outras propriedades podem ser otimizadas por meio da combinação entre diferentes materiais, como apresentados a seguir.
3.4 Propriedades relevantes para uso do CAC como biomaterial
A propriedade mecânica mais amplamente exigida para os cimentos usados na odontologia diz respeito à resistência a compressão para que o material mantenha integridade quando submetidos à compressão como ocorre no processo de mastigação (57).
Cimentos aluminosos vêm sendo utilizados na odontologia e reparação de defeitos ósseos, já que sua principal vantagem é a alta resistência mecânica à compressão (7).
O CAC, apresenta resistência superior ao MTA (acima de 30 MPa), (83). Também quando comparado aos cimentos a base de silicato e fosfato de cálcio, o CAC apresenta valores de resistência à compressão, resistência à flexão e módulo de Young superiores (13,14).
Além disso, maior resistência do CAC podem ser obtidas por meio da incorporação de aditivos com partículas finas e materiais óxidos (7,84). Quando combinado duas ou mais partículas em uma composição cimentícia é necessário se considerar as características das partículas (tamanho, forma, densidade) que afetam a reologia e o empacotamento das partículas. Quando dois pós-monodispersos com grãos grandes e finos, respectivamente, são misturados, os mais finos se
empacotam dentro dos interstícios dos maiores, diminuindo o tamanho médio do poro (84).
Outra propriedade que pode ser alterada por meio da combinação entre materiais é a radiopacidade. O biomaterial deve ter radiopacidade suficiente para ser distinguido de estruturas anatômicas adjacentes, tais como ossos e dentes (85,86). A radiografia tradicional ou as imagens digitalizadas são os únicos métodos disponíveis para investigar a qualidade do tratamento de canal ou a qualidade dos retro-obturadores, bem como o reparo tecidual pós-tratamento.
De acordo com o protocolo para radiopacidade de materiais dentários, publicado pela International Standards Organization (ISO 4049), estes materiais devem ser mais radiopacos do que a dentina. Os agentes cimentantes devem possuir radiopacidade igual ou superior à espessura em alumínio, para que se possam diferenciar os materiais da estrutura dental humana e até mesmo de cáries recorrentes, infiltrações marginais e falhas na cimentação (87). O alumínio é o material de referência para comparação por possuir radiopacidade similar à da dentina (87). A norma ISO 6876:2012 estabelece 3 mm Al como a mínima radiopacidade para seladores do canal radicular (88). Também em tratamentos envolvendo a injeção de cimentos em fraturas de compressão vertebral uma alta radiopacidade é necessária para verificar o local de implantação evitando vazamento do cimento na coluna vertebral ou veias (13).
Em estudos que avaliaram defeitos ósseos preenchidos com o cimento de aluminato de cálcio, foi verificada uma radiopacidade maior do que a do osso (5).
A radiopacidade de um material pode ser aumentada pela adição de partículas que contêm metais pesados, tais como o bismuto (Z = 83), bário (Z = 56), zircónio (Z = 40), estrôncio (Z = 38) ou zinco (Z = 30). De fato, estudos tem mostrado superior radiopacidade do CAC alcançando valores adequados quando combinado com bismuto Bi2O3 (78) ou a mistura 15% ZnO: 10% Bi2O3 preservando as propriedades
mecânicas do CAC (89).
Estudos utilizando o CAC como aditivo ao fosfato tricálcico mostraram que o CAC favoreceu a precipitação de hidroxiapatita, em estágios iniciais (78), assim como apresentou a formação insitu de apatita na interface entre com tecido duro (65).
A incorporação do aluminato de cálcio ao ionômero de vidro promoveu a biocompatibilidade desses materias, alem de favorecer a precipitação de
hidroxipatita, promovendo então a bioatividade do material alem de uma rápida remineralização dos tecidos dentários periféricos (90).
A bioatividade é definida como a capacidade de desenvolver uma ligação estável com tecidos vivos via a deposição de hidroxiapatita (HA) (91) e pode ser testada in vitro por meio de contato do material com uma solução simuladora de fluido corporal simulado (SBF).
A solução SBF é uma solução de sais inorgânicos visando imitar a composição e concentração iônica do plasma sanguíneo.
Quando um material bioativo é colocado em contato com SBF, íons Ca2+ e OH -são liberados acentuando a supersaturação da solução o que induz a precipitação de hidroxiapatita sobre a superfície do material (7).
O mecanismo geral de como um material específico se liga aos tecidos vivos varia com os materiais bioativos com, entretanto, uma completa similaridade entre todos eles. Uma camada de hidroxiapatita (HA) biologicamente ativa é formada na superfície quando o material é introduzido no corpo (75,92).Assim, o estudo in vitro da formação de apatita na superfície em SBF tem sido útil como o primeiro teste de bioatividade.
A maior importância da formação de apatita na superfície do biomaterial é devido à equivalência biológica dos constituintes inorgânicos do osso. Uma camada de HA formada sobre o material é reconhecida pelo corpo e não irá ser recoberto por uma camada fibrosa. A camada de cristais de apatita é então capaz de se ligar ao tecido duro fornecendo bioatividade ao material (93,94).
O teor de fosfato em fluidos corpóreos está presente como componentes em equilíbrio no sistema H3PO4, significando que em pH neutro, o HPO42- é o íon
dominante. A solubilidade dos íons cálcio está abaixo 10-5 em pH de aproximadamente 8,5 sugerindo que a apatita pode precipitar até mesmo em fluidos onde a concentração de fosfato é muito baixa a medida que ocorra aumento da concentração de íons cálcio e do pH. Embora SBF seja supersaturado com relação a apatita, a precipitação não ocorre sem estímulo químico devido a alta energia necessária para formar núcleos críticos (95).
Dessa forma, quando o CAC hidratado é exposto a solução SBF fornece ambos íons Ca2+ solubilizados a partir dos hidratos e aumento do pH, favorecendo a precipitação de hidroxiapatita.
10 Ca2+ + 6 HPO42- + 2 H2O → Ca10(PO4)6(OH)2 + 8H+ (4)
Esta reação pode ser vista como um mecanismo de defesa onde o corpo neutraliza o pH básico por meio da produção de HA. A introdução de CAC hidratado em tal sistema irá então promover a seguinte cadeia de reações:
H2PO4- + OH- → HPO42- + H2O (5)
HPO42- + OH- → PO43- + H2O (6)
5 Ca2+ + 3 PO43- + OH- → Ca5 (PO4)3 (OH) (7)
As reações acima implicam que o CAC hidratado em fluidos corpóreos promove a precipitação de apatita. Pode também ser facilmente sugerido que baseado na solubilidade e pH, aluminato de cálcio hexahidratado (C3AH6) podem se
converter em Al(OH)3 e apatita quando em contato com fluido corpóreo de acordo
com a reação:
Ca3(Al(OH)4)2(OH)4 + 2 Ca2+ + HPO42- + 2 H2PO4-→ Ca5(PO4)3(OH) + 2 Al(OH)3 + 5 H2O (8)
Outra importante reação que ocorre em consideração neste contexto é a precipitação de carbonato de cálcio. CO2 é parcialmente dissolvido como um gás em
fluidos corpóreos, mas está também presente como íons HCO3-. Se um maior pH for
localmente introduzido por exemplo na superfície do CAC hidratado, íons CO32- são
produzidos e CaCO3 pode precipitar.
Materiais a base de CAC destacam-se também em relação aos fosfatos, silicatos ou sulfatos tanto na odontologia como na ortopedia por apresentar atividade antibacteriana (96).
De acordo com o órgão norte-americano NIH (Instituto Nacional de Saúde), aproximadamente 80% de todas as infecções no mundo estão associadas aos biomateriais o que representa um dos maiores problemas clínicos (97).
A adesão bacteriana é um processo bastante complexo que envolve a interação multifacetada de três componentes: a bactéria, a superfície (biótica ou abiótica) e o microambiente em que eles se encontram (97). Existem diversas variáveis que podem influenciar esse processo, tais como: temperatura, presença de agentes antimicrobianos, quantidade de inoculo, forças hidrodinâmicas, características do
substrato, variação de pH, disponibilidade de nutrientes e oxigênio, assim como as concentrações dos metabólitos microbianos (98), como outros fatores apresentado na Figura 3.
Figura 3: Parâmetros que influenciam na adesão bacteriana
Fonte: Adaptado (97)
Biomateriais são facilmente colonizados por microrganismos como a
S.aureus, E.coli, C.albicans, após a sua implantação. O tipo de material utilizado na
sua fabricação pode diferenciar em relação à propensão de adesão bacteriana (97), podendo até inibir a formação do crescimento bacteriano.
O CAC mostrou um grau elevado de atividade antibacteriana contra
Streptococus mutans, superior ao PMMA (99). Também mostrou resultados positivos
contra S.aureus e C.albicans após 24 horas de avaliação, semelhante ao MTA (100). Em ambos os estudos, o efeito positivo dos materiais foi correlacionado aos altos valores de pH proporcionados pelos materiais.
Entretanto, as propriedades bacteriostáticas e antibacterianas do CAC podem estar relacionadas com o desenvolvimento da estrutura e porosidade durante a sua hidratação e não somente com o seu valor de pH.
Estudos têm mostrado atividades antimicrobianas de materiais naturais e sintéticos como a quitosana (101). Entretanto, a atividade da quitosana in vitro é dependente de muitos fatores intrínsecos e extrínsecos, diretamente relacionados ao
peso molecular, grau de desacetilação, viscosidade, solventes e concentração ou com factores abióticos como a estirpe microbiana em questão e seu estado fisiológico, o meio de cultura, pH, temperatura, força iônica, e presença de íons metálicos, EDTA e matéria orgânica. Quitosana também mostrou eficiência na redução da adesão de Candida albicans (102).
Óxido de zinco também vem apresentando capacidade de induzir a precipitação de compostos relevantes para o processo de mineralização, quando imersos em fluidos corporais, apresentando potencial bioativo (73) e propriedades antibacterianas contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus (103).
Por fim, estudos com CAC vêm atestando a sua capacidade de favorecer a diferenciação de células da linhagem osteoblástica que expressam fosfatase alcalina, ou seja, induz o crescimento das células formadoras de osso que permanecem em contato com ele (11).
Compostos de aluminato de cálcio incorporados em biomembrana de quitosana/colágeno tem apresentado excelentes resultados em relação a proliferação celular alcançando intensa deposição de uma matriz mineralizada induzindo o processo regenerativo sem danos químicos para as células da região (104).
Segundo Hentrich et al, materiais a base de aluminatos de cálcio tem evidenciado melhor mineralização de tecido ósseo do que outras cerâmicas como a alumina e zircônia tendo uma grande capacidade para ser utilizado em tecidos duros e moles (105). Também, tem permitido a adesão, espraiamento e a proliferação de células em estágios mais avançados da diferenciação osteoblasticas quando comparado ao MTA (11). Além disso, tem sido verificado que o osso tem habilidade de se formar na superfície de aluminato de cálcio, bem como de crescer dentro dos poros em estrutura porosa a base de CAC, mostrando a compatibilidade com osso autógeno e os tecidos moles do corpo (105).
Estudo envolvendo arcabouços a base de aluminato de cálcio com porosidade controlada também foram processados para utilização em reparo ósseo Esses materiais mostraram boa aderência celular e um bom comportamento de crescimento frente a cultura de osteoblastos humanos e células derivadas a partir de tecidos de fetos humanos (106).
3.5 . Arcabouços e a técnica de réplica
As biocerâmicas porosas devem favorecer a adesão, crescimento e diferenciação celular e crescimento de osso, revascularização e osteointegração (25).
Apesar do aumento da porosidade diminuir a resistência mecânica do material isoladamente, a existência de poros com dimensões adequadas pode favorecer o crescimento do tecido ósseo através deles, fazendo com que ocorra um forte entrelaçamento com o implante, aumentando, por conseguinte, a resistência do material in vivo (25).
Com relação à dimensão dos poros, Hulbert (107) demonstrou que poros maiores que 100 µm favoreceram o crescimento do osso através do material. Este tamanho de poro, que define a porosidade ótima das biocerâmicas, está relacionada à necessidade de fornecer um suprimento sanguíneo ao tecido conectivo em crescimento. A Figura 4 apresenta um modelo de microestrutura porosa, com poros maiores que 100 µm (108).
Figura 4: Modelo de microestrutura porosa
Fonte: (108)
Entretanto Karageorgiou e Kaplan (109), definiram que o tamanho mínimo necessário para o crescimento de células ósseas é de 100 - 200 μm. Poros menores entre 75 - 100 μm resultam no crescimento de tecido osteóide não mineralizado, enquanto poros tendo entre 10 – 75 μm permitem a penetração ape nas de tecido fibroso, o que ajuda na fixação mecânica do arcabouço. Outros estudos (110,111)
