Figure 29 : Représentation schématique simplifiée de la réaction d’ubiquitination (d’après Brooks, 2010). La réaction d’ubiquitination consiste en l’attachement covalent d’une ubiquitine (Ub) sur une protéine cible et nécessite l’intervention séquentielle des enzymes E1, E2 et E3. Suivant une réaction dépendante de l’ATP, l’enzyme E1 active l’ubiquitine (1), puis l’ubiquitine activée est transférée sur l’enzyme E2 (2). L’enzyme E3 reconnaît la protéine à étiqueter, et fixe l’enzyme E2 (3). L’ubiquitine est ensuite soit transférée directement sur la protéine cible (cas de la E3 RING), soit transférée sur l’enzyme E3 avant d’être transférée sur la protéine ciblée (cas de la E3 HECT) (4). Le produit final de cette réaction est la protéine substrat étiquetée avec un monomère d’ubiquitine. Plusieurs cycles réitérés de cette réaction conduisent à l’attachement d’une chaîne d’ubiquitine (polyubiquitination) sur la protéine cible (5).
(1) (2)
(3)
(4)
(5)
Protéine
cible Protéine
cible
Protéine
cible Protéine
cible
Protéine cible
Protéine cible
(1) (2)
(3)
(4)
(5)
Protéine cible Protéine
cible Protéine
cible Protéine
cible
Protéine cible Protéine
cible Protéine
cible Protéine
cible
Protéine cible Protéine
cible
Protéine cible Protéine
cible
Les promoteurs UBQ sont très actifs et ont notamment été exploités pour l’expression de transgènes chez les céréales.
4.2La réaction enzymatique d’ubiquitination
La réaction d’ubiquitination fait intervenir successivement 3 enzymes : l’enzyme d’activation de l’ubiquitine, E1 ; l’enzyme de conjugaison E2 et l’enzyme E3 ligase (Figure 29). La réaction commence avec la formation dépendante de l’ATP d’une liaison thioester entre une cystéine de l’enzyme E1 et la glycine 76 de l’ubiquitine. L’ubiquitine ainsi activée est transférée sur une cystéine de l’enzyme E2 par transestérification. De son côté, l’enzyme E3 ligase reconnaît spécifiquement une protéine substrat. L’enzyme E2 se fixe ensuite à l’enzyme E3 et lie soit directement l’ubiquitine sur le groupement amine d’une lysine de la protéine substrat ou transfère l’ubiquitine sur l’enzyme E3 qui catalysera ensuite le transfert de l’ubiquitine sur une lysine de la protéine ciblée. Le produit final de cette réaction est un conjugué protéine substrat-ubiquitine dans lequel le groupement carboxyle de la glycine 76 de l’ubiquitine est liée par une liaison isopeptidique au groupement amine d’une lysine de la protéine substrat.
4.3Les divers types d’ubiquitination
La protéine substrat peut être ubiquitinée de différentes manières ce qui conditionne son devenir dans la cellule. Une seule ubiquitine ou des chaînes de poly-ubiquitine peuvent être attachées sur un résidu du substrat (mono-ubiquitination et poly-ubiquitination, respectivement) ou des monomères d’ubiquitine sur plusieurs résidus du substrat (multi- mono-ubiquitination), au niveau d'une lysine le plus souvent (revue de Haglund et Dikic, 2005 ; Figure 30). Dans le cas de la poly-ubiquitination, l'élongation de la chaîne de poly- ubiquitine se fait par la formation d'une liaison isopeptidique entre la glycine 76 d'une nouvelle ubiquitine et une lysine de la molécule d'ubiquitine précédemment conjuguée au substrat, par des cycles successifs d’ubiquitination précédemment décrits.
L’ubiquitine contient 7 lysines (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63 ; Figure 28).
Toutes les lysines sont exposées au solvant, et différents types de chaînes poly-ubiquitine peuvent ainsi être formées en fonction de la lysine de l’ubiquitine impliquée dans la liaison avec l’ubiquitine suivante dans la chaîne (revue par Trempe, 2011). Trois natures de chaînes
Figure 30 : Les différentes formes d’ubiquitination et leurs rôles (d’après Haglund et Dikic, 2005). Dans le cas de la poly-ubiquitination, seule le rôle des types de poly-ubiquitination le plus fréquemment rencontré (chaînes d’ubiquitine en K48 et K63) est mentionné.
Mono-ubiquitination
Multi-mono-ubiquitination
Poly-ubiquitination
Dégradation protéique par le protéasome.
Réparation de l’ADN, endocytose,
activation de protéines kinases.
Endocytose.
Endocytose,
Régulation des histones, réparation de l’ADN,
export nucléaire, tri endosomal.
Figure 31 : Représentation schématique des différentes possibilités de chaînes d’ubiquitine (d’après Ikeda et Dikic, 2008). (A) Les chaînes homotypiques sont constituées d’ubiquitine reliées entre elles par une liaison incluant toujours la même lysine. (B) Les chaînes mixtes présentent des liaisons incluant diverse lysines des ubiquitines et sont bifurquées. (C) Les chaînes hétérologues sont l’assemblage d’ubiquitine et de protéine ubiquitin-like, comme la protéine SUMO 2 (Small Ubiquitin-like Modifier 2) par exemple.
A- Chaînes homotypiques B- Chaîne mixte
C- Chaîne hétérologue A- Chaînes homotypiques B- Chaîne mixte
C- Chaîne hétérologue
peuvent être rencontrées : les chaînes homotypiques, majoritaires dans la cellule, dans lesquelles la même lysine est toujours impliquée dans la liaison entre 2 Ub au sein de la chaîne ; les chaînes hétérotypiques (ou chaînes mixtes) avec des liaisons impliquant différentes lysines et les chaînes hétérologues formées par l’assemblage d’Ub et de protéines Ubiquitin-like (Ikeda et Dikic, 2008 ; Trempe, 2011 ; Figure 31).
Le type de chaîne majoritairement formé est une chaîne d’ubiquitines reliées par la lysine 48 (chaînes K48) et conduit à la fonction la plus connue de l’ubiquitination : la dégradation de protéines par le protéasome 26S (Van Nocker et Vierstra, 1993 ; Trempe, 2011). L’apposition des autres types de chaînes polyUb et la monoubiquitination sont quant à elles impliquées dans des fonctions non-protéolytiques. Les chaînes en lysine 63 (chaînes K63) ont été montrées impliquées dans l’activation d’une protéine kinase humaine, dans la réparation de l’ADN et dans l’endocytose (Weissman, 2001 ; Haglund et Dikic, 2005). Un étiquetage par des chaînes en lysine 11 (chaînes K11) intervient dans le contrôle du cycle cellulaire et dans la voie de dégradation ERAD (Endoplasmic Reticulum-associated Degradation)/Proteasome. Les chaînes en lysine 6 (chaînes K6) ont été décrites dans la réparation de l’ADN (Wu-Baer et al, 2003 ; Sobhian et al, 2007). Bien qu’il ait été montré in vivo la formation des chaînes en lysine 27, 29 et 33 (K27, K29 et K33 respectivement), leur fonction est encore inconnue (Trempe, 2011). La monoubiquitination conduit à l’endocytose, la réparation de l’ADN, la régulation des histones, le tri endosomal, l’export nucléaire et le bourgeonnement viral Haglund et Dikic, 2005).
Ces différentes étiquettes peuvent ensuite être reconnues par des domaines protéiques appelés UBD (Ubiquitin-Binding Domain). A l’heure actuelle, 9 UBDs différents ont été identifiés (Haglund et Dikic, 2005).
4.4Les enzymes déubiquitinases (DUBs)
Les DUBs interviennent à plusieurs étapes de la voie d’ubiquitination : elles génèrent d’une part les monomères d’ubiquitine à partir de leur précurseur comme mentionné précédemment, mais recyclent également les monomères d’ubiquitine après dégradation des protéines polyubiquitinées et sont capables d’inverser la réaction d’ubiquitination. Le génome d’Arabidopsis compte 64 gènes de déubiquitinases (Vierstra, 2009).
Figure 32 : Structure tridimensionnelle de protéines Ubiquitin-like (Site internet du Laboratoire de RD Vierstra). RUB, Related Ubiquitin ; HUB, Homologous to Ubiquitin ; SUMO, Small Ubiquitin-like Modifier ; UFM1, Ubiquitin-fold modifier 1 ; ATG8, Autophagy-defective 8 ; MUB, Membrane-anchored Ubiquitin fold.
4.5Les protéines Ubiquitin-like (UBLs)
Depuis la découverte de la protéine ubiquitine, d’autres protéines apparentées ont été identifiées (Smalle et Vierstra, 2004). Chez les plantes, ce sont entre autres les protéines RUB1 (Related Ubiquitin 1 ou NEDD8), SUMO (Small Ubiquitin-related Modifier), APG8 (Autophagy-defective 8), APG12 (Autophagy-defective 12), URM (Ubiquitin-Related Modifier) et HUB (Homologous to Ubiquitin). Bien qu’elles partagent peu d’homologie de séquence avec l’ubiquitine, toutes présentent la conformation tridimensionnelle globulaire de l’Ub avec une extension C-terminale flexible similaire (Figure 32). Tout comme l’ubiquitine, elles constituent une étiquette qui sera apposée sur une protéine cible selon une réaction dépendante de l’ATP impliquant des enzymes E1 et E2 et quelques fois une enzyme E3. Des protéines DUB-like peuvent également les retirer du substrat. A l’exception de SUMO qui peut être retrouvée attachée à la protéine cible sous forme de polymères, les UBLs sont attachées sous forme de monomère. Tout comme l’Ub, les conséquences de l’apposition d’UBL peuvent être diverses (Smalle et Vierstra, 2004). Par exemple, un étiquetage par RUB1 modifie de manière réversible l’activité de E3s de type SCF en se liant à la sous-unité Cullin (Smalle et Vierstra, 2004). Une modification de type SUMO peut affecter l’activité d’une protéine ou sa localisation subcellulaire, ou encore protéger des protéines d’une ubiquitination. Dans au moins 2 protéines de mammifère, une même lysine peut être soit sumoylée ou ubiquitinée ; la sumoylation bloquant la dégradation de la protéine par la voie Ubiquitine-Protéasome 26S. Kurepa et ses collaborateurs (2003) suggèrent qu’un tel mécanisme de protection de protéines contre la protéolyse par sumoylation existerait aussi chez les plantes, notamment en cas de stress.