TC-NER
B. Activité de réparation de l’ADN en réponse à une irradiation UV Nous avons constaté que les lysats de cellules Hela siRNA XPA et XPC, irradiées à
une dose entraînant environ 50 % de cytotoxicité (80 J/m²), présentent des activités non spécifiques d’ER. Le niveau de fluorescence pour ces deux lysats augmente fortement lorsque les cellules sont irradiées avec 80 J/m² (Figure 36) mais nous observons que cette augmentation est non spécifique, puisque le niveau d’ER du plasmide contrôle augmente lui aussi grandement. Une hypothèse serait que les cellules XP, plus sensibles que les cellules témoin à une irradiation UV, initieraient des processus d’apoptose à une dose de 80 J/m². Une des caractéristiques de l’apoptose est la fragmentation de l’ADN par des nucléases, pour former des fragments de taille spécifique (multiple de 180 pb). Ces nucléases sont activées lors de l’apoptose (Samejima et al., 2005). Ainsi, l’apoptose pourrait se traduire sur la puce plasmide par des incisions non-spécifiques de l’ADN fixés, par les nucléases du lysat de cellules ayant déclenchées la voie de l’apoptose. Les polymérases contenues dans le lysat pourraient alors ensuite incorporer des nucléotides fluorescents au niveau de ces sites.
Ainsi, lorsque le traitement entraîne 50 % de létalité, la réponse en termes d’activités d’ER, mesurée avec notre test, est aspécifique. Nous avons donc fait le choix de travailler avec des doses d’UVB n’entraînant que très peu de mortalité cellulaire (< 15 %) pour ne pas biaiser la réponse observée sur la puce.
Les cellules HeLa siRNA ont donc été irradiées à des doses comprises entre 5 et 20 J/m². Nous avons analysé le niveau d’ER sur la puce plasmide 24 h après l’irradiation. La réaction d’excision-resynthèse a été réalisée avec 0,4 mg/mL de protéine nucléaire et a duré 2 h à 30 °C. L’intensité de fluorescence totale obtenue pour le lysat de cellules irradiées est exprimée par rapport à celle obtenue avec le lysat de cellules non-irradiées (pourcentage de variation entre l’échantillon irradié et le non-irradié).
L’analyse de ces pourcentages de variation de l’intensité de fluorescence après une irradiation des cellules témoins avec 5 J/m², montre une stimulation de l’excision-resynthèse
Figure 37: Pourcentage de variation de l’excision-resynthèse, en présence de 0,4 mg/mL de protéines, entre le lysat de cellules irradiées et le lysat de cellules non-irradiées (moyenne de 4 expériences indépendantes). Pour chaque lysat de cellules irradiées à 5 et 20J/m² d’UVB, a été calculé un pourcentage de variation de l’intensité totale de fluorescence par rapport au lysat préparé sur des cellules non-irradiées
-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60
Témoin siRNA
5J/m²
Témoin siRNA 20J/m²
XPA 5J/m²
XPA 20J/m²
XPC 5J/m²
XPC 20J/m²
% de variation par rapport au non-irradié pCPD-64p8oxoG
pAlkB pCisP pAbas pGlycol
Figure 37: Pourcentage de variation de l’excision-resynthèse, en présence de 0,4 mg/mL de protéines, entre le lysat de cellules irradiées et le lysat de cellules non-irradiées (moyenne de 4 expériences indépendantes). Pour chaque lysat de cellules irradiées à 5 et 20J/m² d’UVB, a été calculé un pourcentage de variation de l’intensité totale de fluorescence par rapport au lysat préparé sur des cellules non-irradiées
-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60
Témoin siRNA
5J/m²
Témoin siRNA 20J/m²
XPA 5J/m²
XPA 20J/m²
XPC 5J/m²
XPC 20J/m²
% de variation par rapport au non-irradié pCPD-64p8oxoG
pAlkB pCisP pAbas pGlycol
du lysat de cellules irradiées par rapport au lysat de cellules non irradiées (Figure 37). En effet, nous pouvons observer que le pourcentage de variation est positif, l’intensité de fluorescence du lysat de cellules témoin irradiées avec 5 J/m² est plus élevée que celle du lysat de cellules témoin non-irradiées. Cette stimulation est particulièrement prononcée pour la lésion 8-oxoG en comparaison avec les autres lésions : l’incorporation de nucléotide fluorescent est augmentée d’environ 50 % pour cette lésion en réponse à une irradiation UVB.
En revanche, la stimulation observée pour les photoproduits (environ 10 %) est relativement faible comparée aux autres lésions et elle ne concerne ni les diols de pyrimidine ni les adduits cisplatine. Ainsi, la stimulation des activités de réparation en réponse à une irradiation UVB concerne paradoxalement essentiellement les dommages pris en charge par la BER. En effet, nous aurions pu nous attendre à une stimulation majoritaire de la réparation des lésions spécifiques de la NER à savoir les photoproduits et les adduits cisplatine.
Il est à noter que l’augmentation de l’incorporation de nucléotides fluorescents dans l’ADN du support n’est pas due à une augmentation de la réparation non-spécifique puisque l’intensité de fluorescence du plasmide contrôle n’augmente pas (données non montrées).
Contrairement à ce qui est observé avec la dose de 5 J/m², lorsque les cellules témoins sont irradiées avec 20 J/m², la stimulation des activités d’ER n’est plus observée. En effet, le niveau de réparation de l’ensemble des lésions présentes sur la puce chute lorsque les cellules ont été irradiées à cette dose. Les mécanismes de réponse au stress, mis en place suite à l’irradiation, sont différents après une irradiation aux deux doses de 5 et 20 J/m². Selon la quantité mais aussi la nature des lésions formées par l’irradiation UVB, les réponses sur la puce en terme d’activités de réparation ne sont donc pas les mêmes. Nous pouvons penser qu’à la plus faible dose, la cellule n’a pas besoin de s’arrêter pour réparer les lésions induites alors qu’après 20 J/m², la cellule a besoin de faire une pause dans le cycle pour mettre en place une réponse adaptée. Ainsi, les activités de réparation que nous voyons stimulées 24 h après une irradiation des cellules avec 5 J/m² ne le sont pas si les cellules ont été irradiées avec une dose plus forte.
Seule la dose de 5 J/m² conduit à une stimulation des activités de réparation et cet effet est toujours visible 24 h après l’irradiation. Ce résultat sera étayé, par la suite, avec le modèle fibroblaste où cette stimulation de la réparation sera confrontée à une analyse de la survie et du cycle cellulaire.
Contrairement à ce que nous avons vu avec les cellules témoins irradiées avec 5 J/m², lorsque les cellules XP sont irradiées aux faibles doses (5 et 20 J/m²), le niveau relatif (ie. par
rapport au non-irradié) d’ER des deux lysats XP diminue et ceci pour toutes les lésions (Figure 37). Ainsi, l’intensité de fluorescence obtenue avec un lysat XP de cellules irradiées est inférieure à l’intensité de fluorescence obtenue avec un lysat de cellules XP non-irradiées.
La réparation est donc moins efficace dans les lysats XP après une irradiation des cellules.
En conclusion, la réponse des cellules HeLa siRNA aux UVB montre une stimulation de l’excision-resynthèse du lysat nucléaire témoin lorsque les cellules sont irradiées avec 5 J/m² d’UVB. Cette stimulation ne concerne pas les lysats XP, l’irradiation a, au contraire, un effet inhibiteur sur les activités de réparation.
L’irradiation à de faibles doses d’UVB, peu cytotoxiques, permet l’obtention de réaction de réparation spécifique dans nos conditions expérimentales. Cette analyse aux faibles doses d’UVB montre que la réponse est différente pour les cellules témoins et les cellules XP.
Cette première approche avec le modèle HeLa siRNA a permis de dégager une hypothèse : dans nos conditions expérimentales, le niveau basal n’est pas informateur pour différencier les signatures en termes d’activités de réparation entre un lysat témoin et un lysat XP. En revanche, nous montrons que la réponse est différente pour un phénotype normal par rapport à un phénotype XP lorsque les cellules ont été traitées aux UV. Les UV entraînant des lésions spécifiquement réparées par la voie NER, et les cellules XP étant déficientes pour cette voie de réparation, il est assez logique de mettre en évidence des réponses divergentes en terme d’activités de réparation entre un lysat témoin et un lysat XP lorsque les cellules ont été traitées au préalable par des UVB. Nous observons également, que les activités spécifiques de la BER sont également stimulées dans le lysat témoin en réponse à l’irradiation UVB. Afin d’explorer cette hypothèse de façon plus précise, nous avons choisi d’analyser, par la suite, les phénotypes de réparation de l’ADN de lignées fibroblastiques obtenues à partir de patients XP (Institut Gustave Roussy, équipe du Pr. Alain Sarasin).
Chapitre II
Partie III
Etude à partir de lignées de
fibroblastes de patients XP
β-Actine
1 2 3 4 5 6
XPA
Figure 38: Détection de la protéine XPA dans différents lysats de fibroblastes.
1 à 3: lysats nucléaires (1/ Témoin; 2/ XPC; 3/ XPA). 4 à 6: lysats totaux (4/ Témoin;
5/ XPC; 6/ XPA). La « bande XPA » est située entre la bande 35 et la bande 49 kDa du marqueur de poids moléculaire (PM théorique de XPA: 31 kDa) et la « bande contrôle actine » est située approximativement au même niveau que la bande 49 kDa du
marqueur de poids moléculaire (PM théorique de l’actine: 45 kDa).
β-Actine
1 2 3 4 5 6
XPA
β-Actine
1 2 3 4 5 6
XPA
Figure 38: Détection de la protéine XPA dans différents lysats de fibroblastes.
1 à 3: lysats nucléaires (1/ Témoin; 2/ XPC; 3/ XPA). 4 à 6: lysats totaux (4/ Témoin;
5/ XPC; 6/ XPA). La « bande XPA » est située entre la bande 35 et la bande 49 kDa du marqueur de poids moléculaire (PM théorique de XPA: 31 kDa) et la « bande contrôle actine » est située approximativement au même niveau que la bande 49 kDa du
marqueur de poids moléculaire (PM théorique de l’actine: 45 kDa).