TC-NER
C. Tests in vitro : mesure d’activité de réparation en dehors de la cellule
II. Les contraintes du test sur la puce plasmide
Nous avons vu dans le chapitre I, que le système de réparation par excision de nucléotides se divise en deux voies suivant si le gène dans lequel se trouve la lésion est en
cours de transcription ou non. Il existe donc une réparation liée à la transcription (TC-NER) et une réparation plus globale c’est-à-dire qui concerne l’ensemble des gènes qu’ils soient transcrits ou non (GG-NER). Grâce à notre test sur la puce plasmide, les activités NER mesurées correspondent à la voie globale (GG-NER) puisque l’ADN plasmidique du support n’est pas transcrit pendant la réaction d’ER.
Le test que nous utilisons pour mesurer des activités de réparation impose certaines conditions expérimentales de par l’utilisation de lysats cellulaires et de la mesure simultanée de la réparation de plusieurs lésions. Les différents paramètres expérimentaux ont été établis lors des travaux de J.F Millau. Les différents paramètres expérimentaux (concentration saline, ions et énergie nécessaire à la réaction, quantité de protéines) décrits dans la suite de ce paragraphe sont à comparer avec ceux de la méthode de référence (Chapitre I tableau 6).
La préparation des lysats nucléaires nécessite une forte concentration saline pour permettre la libération des protéines de ce compartiment. Ainsi, à la fin de la lyse, les protéines du noyau sont en solution dans un tampon contenant notamment 400 mM de KCl.
L’équipe de B. Salles a étudié l’effet de la concentration en KCl lors de réactions de réparation in vitro (Calsou et al., 1994; Coudore et al., 1997). Ainsi, l’excision-resynthèse ne peut être mesurée en dessous de 50 mM de KCl à cause d’une trop grande dégradation de l’ADN par les nucléases présentes dans le lysat. La réaction est optimale lorsque la concentration saline est comprise entre 50 et 80 mM. Ces observations ont été confirmées par J.F Millau ; une concentration en KCl de 80 mM lors de la réaction sur la puce plasmide permet l’obtention du meilleur signal. Ainsi, la concentration en sels du lysat nucléaire doit être diminuée d’un facteur 5 (de 400 à 80 mM) pour pouvoir conduire la réaction dans les conditions salines optimales. Le lysat est donc dilué au 1/5è dans le mélange réactionnel.
La concentration en MgCl2 a, elle aussi, été déterminée afin que la réaction sur notre puce soit optimale. Ainsi, lors de la réaction, la concentration en MgCl2 est de 7,3 mM. Les ions Mg2+ sont indispensables à la réaction d’ER car ils permettent aux réactions consommant de l’ATP d’avoir lieu. Dans la méthode de référence, la concentration en MgCl2 est fixée à 7,5 mM (Paz-Elizur et al., 2007).
La concentration en ATP, elle aussi, est importante lors de la réaction d’excision- resynthèse. J.F Millau a déterminé la gamme de concentration en ATP pour laquelle la réaction est optimale. Ainsi, une concentration comprise entre 1 et 2 mM d’ATP permet d’obtenir un signal maximum lors de la réaction d’excision-resynthèse du lysat. Nous avons choisi d’utiliser 2 mM ce qui est en accord avec le test de référence (Calsou et al., 1994).
Enfin, la gamme de concentration de lysat cellulaire a également été étudiée par J.F Millau à partir d’extraits de cellules HeLa. Ainsi, il a testé une gamme de concentration entre 0,5 et 2 mg/mL pour un lysat nucléaire commercial de cellules HeLa. Comme nous le verrons par la suite, nous avons travaillé dans une gamme de concentrations comprises entre 0,3 et 1 mg/mL. Par rapport au test de référence, nous nous sommes placés dans une gamme de concentration plus faible. En effet, par rapport aux travaux de Calsou et al., la réaction est conduite avec 10 fois moins de protéines (Calsou et al., 1996b).
Dans le cas du test de référence, la quantification des activités de réparation se fait par autoradiographie. Le temps d’exposition est choisi de telle façon à mesurer à la fois la radioactivité incorporée dans le plasmide contrôle et dans le plasmide comportant une lésion.
Cependant, il existe des études où la part de la radioactivité incorporée dans le plasmide contrôle n’apparaît pas (Robins et al., 1991; Szymkowski et al., 1993). Pourtant, il est impératif de connaître la part de la réparation dite gratuite lors de la réaction effectuée pour analyser la part de la réparation non spécifique qui a lieu lors de la réaction.
Dans le cas de notre test, la lecture de l’intensité de fluorescence nécessite le réglage du gain c’est-à-dire la puissance du photomultiplicateur du scanner. La lecture du signal fluorescent s’effectue au même gain pour toutes les réactions biochimiques mises en œuvre lors d’une expérience (ie. le même gain pour tous les lysats). Cela est indispensable pour pouvoir comparer les activités d’ER des différents lysats. Le gain est réglé de telle façon à obtenir une sensibilité maximale où l’incorporation de la fluorescence pourra être quantifiée au niveau de chaque plasmide présent sur le support. Ainsi, nous observons également un signal de fluorescence au niveau du plasmide contrôle.
Les conditions de formation des lésions ont été optimisées afin d’obtenir des signaux de fluorescence du même ordre de grandeur pour toutes les lésions présentes sur la puce.
Cependant, la nature et la quantité de nucléotides fluorescents incorporés lors de la réaction d’ER sont dépendantes de la nature des lésions présentes et de la voie de réparation concernée. Par exemple, les photoproduits et les diols de pyrimidine donnent lieu à des
Figure 31: Image en fausses couleurs obtenue après lecture du signal fluorescent à 635 nm avec un gain réglé sur 460 (A/). Chaque disque de couleur correspond à un type de plasmide. Plus le disque est rouge plus l’incorporation de Cy5-CTP a été importante.
B/Echelle de couleur correspondant à l’intensité de fluorescence du pixel Intensité de fluorescence
- +
A/
B/
Figure 31: Image en fausses couleurs obtenue après lecture du signal fluorescent à 635 nm avec un gain réglé sur 460 (A/). Chaque disque de couleur correspond à un type de plasmide. Plus le disque est rouge plus l’incorporation de Cy5-CTP a été importante.
B/Echelle de couleur correspondant à l’intensité de fluorescence du pixel Intensité de fluorescence
- +
A/
B/
0,E+00 1,E+07 2,E+07 3,E+07 4,E+07 5,E+07
Control CPD-64 A CPD-64 B CPD-64 C 8oxo_A 8oxo_B 8oxo_C AlkB_A AlkB_B AlkB_C CisP_A CisP_B CisP_C AbaS_A AbaS_B AbaS_C Glycol_A Glycol_B Glycol_C
Intensité de fluorescence totale
Figure 32: Profil d’excision-resynthèse obtenu après 2h de réaction d’un lysat témoin sur la puce plasmide. Ce profil correspond à la quantification de l’image obtenue dans la figure 1. Les 3 trois ratios quantité lésions/ quantité d’ADN (A, B et C) sont représentés pour chaque type de lésions.
0,E+00 1,E+07 2,E+07 3,E+07 4,E+07 5,E+07
Control CPD-64 A CPD-64 B CPD-64 C 8oxo_A 8oxo_B 8oxo_C AlkB_A AlkB_B AlkB_C CisP_A CisP_B CisP_C AbaS_A AbaS_B AbaS_C Glycol_A Glycol_B Glycol_C
Intensité de fluorescence totale
Figure 32: Profil d’excision-resynthèse obtenu après 2h de réaction d’un lysat témoin sur la puce plasmide. Ce profil correspond à la quantification de l’image obtenue dans la figure 1. Les 3 trois ratios quantité lésions/ quantité d’ADN (A, B et C) sont représentés pour chaque type de lésions.
intensités de fluorescence relativement élevées par rapport à ce qui est obtenu pour les sites abasiques ou les adduits cisplatine. Il s’agit donc de faire un compromis pour pouvoir mesurer les signaux au niveau de tous les plasmides modifiés et du plasmide contrôle présents sur la puce.
Nous mesurons l’incorporation du Cy5-dCTP dans l’ADN fixé sur le support. J.F. Millau a également réalisé des expériences en mesurant l’incorporation de Cy5-dGTP. La réparation de la 8-oxoG est associée à une plus forte intensité de fluorescence lorsque nous utilisons le Cy5- dGTP qu’avec le Cy5-dCTP ce qui est en faveur de l’incorporation d’un G à la place de la base lésée. Cependant, le bruit de fond obtenu avec le Cy5-dCTP est beaucoup plus faible qu’avec le Cy5-dGTP. Ainsi, nous avons fait le compromis d’avoir un signal fluorescent associé à chaque plasmide du support, tout en ayant le moins de bruit de fond possible.