Activités d’excision d’un lysat nucléaire témoin : détermination des conditions de concentrations protéiques conditions de concentrations protéiques

Il a été nécessaire tout d’abord de déterminer la gamme de concentrations protéiques pour laquelle nous observons des taux de coupure spécifiques. Pour cela, nous avons réalisé une expérience sur la puce oligo en présence d’une gamme de concentration allant de 0 à 20 µg/mL pour un lysat nucléaire de fibroblastes témoin (Figure 48). Au-delà de 20 µg/mL, il a été vérifié à plusieurs reprises que la réaction n’est plus spécifique, les ODN présents sur le support étant dégradés de façon aspécifique. En effet, nous observons un taux de coupure de l’ODN témoin, ne comportant pas de lésion, supérieur à 30 %.

Pour chaque ODN présent sur la puce (comportant une base modifiée ou non), l’intensité de fluorescence obtenue avec le tampon réactionnel seul est fixée à 100 %. Ainsi, le profil d’excision obtenu dans la figure 48 A/ montre l’intensité de fluorescence totale obtenue pour un lysat nucléaire témoin par rapport à ce 100 % de fluorescence. Comme nous pouvons observer sur le graphe, plus la concentration en protéines augmente, plus l’intensité relative de fluorescence diminue et cela quelle que soit la lésion considérée. Il est important de noter que l’intensité de fluorescence diminue aussi pour l’ODN témoin c’est-à-dire ne contenant pas de base modifiée. La coupure de l’ODN témoin est cependant très faible lorsque la concentration protéique est inférieure ou égale à 1 µg/mL. Lorsque la réaction est réalisée en présence de 20 µg/mL de lysat nucléaire, 30 % des ODN témoin sont coupés. Enfin, nous observons que certaines lésions sont plus coupées que d’autres ; les performances de coupure ne sont donc pas les mêmes pour toutes les lésions présentes sur le support.

Les taux de coupure, calculés pour chaque lésion, rendent compte de cette différence d’activité (Figure 48 B/). En effet, toutes les lésions ne sont pas incisées avec la même efficacité. Par exemple, les sites abasiques (A-THF) sont excisés à 80 % dès la plus faible concentration protéique (0,1 µg/mL). Cette lésion est donc coupée avec un très grand rendement dans nos conditions expérimentales. Pour les diols de thymines (A-TG) et l’uracile (G-U et A-U), le taux coupure maximal est obtenu à la concentration de 20 µg/mL. Il est de 66 % et de 80 % respectivement pour ces deux types de lésions. Enfin, la lésion 8-oxoG (C- 8oxoG), l’adénine en face d’une 8-oxoG (8oxoG-A) ainsi que les mésappariements (CG-GT et G-T) présentent un taux de coupure nul, l’excision de ces lésions n’est donc pas efficace dans nos conditions expérimentales avec un lysat nucléaire témoin de fibroblaste. Il a déjà été montré une activité très faible de la coupure de la 8-oxoG dans des extraits totaux de fibroblastes (Cappelli et al., 2000). Dans cette étude, l’excision de la 8-oxoG est 5 fois moins efficace que la coupure de l’uracile et 50 fois moins efficace que l’incision d’un site abasique.

Dans notre cas, nous ne savons pas pourquoi cette lésion n’est pas excisée sur la puce oligo.

Nous avons, en effet, testé plusieurs séquences d’ODN portant la modification 8-oxoG et nous n’avons pas observé de différences dans les activités de coupure (ie. la lésion n’est pas excisée). Ainsi est-ce que l’enzyme OGG1 est en concentration limitante dans les conditions de concentration protéique que nous utilisons ? Est-ce dû au mode de préparation des lysats nucléaires (absence d’un cofacteur essentiel) ? L’enzyme d’OGG1 est-elle moins active dans les noyaux par rapport aux mitochondries ? Cependant, il est à noter que suivant la nature des cellules utilisées pour préparer les lysats nucléaires, le taux de coupure varie entre 0 et 20 %,

Figure 49: Profil d’incision des ODN de la puce oligo par un lysat nucléaire témoin et deux lysats nucléaires XP, en présence de deux concentrations protéiques différentes.

A/0,5 µg/mL de protéines. B/20 µg/mL de protéines.

-20 0 20 40 60 80 100

A-TG A-THF Témoin CG-GT A-dHT T-EthdA G-U A-U

taux de coupure (%)

Témoin XPC XPA

A/

B/

0 20 40 60 80 100

A-TG A-THF Témoin CG-GT A-dHT T-EthdA G-U A-U

taux de coupure (%)

Témoin XPC XPA

Figure 49: Profil d’incision des ODN de la puce oligo par un lysat nucléaire témoin et deux lysats nucléaires XP, en présence de deux concentrations protéiques différentes.

A/0,5 µg/mL de protéines. B/20 µg/mL de protéines.

-20 0 20 40 60 80 100

A-TG A-THF Témoin CG-GT A-dHT T-EthdA G-U A-U

taux de coupure (%)

Témoin XPC XPA

A/

B/

0 20 40 60 80 100

A-TG A-THF Témoin CG-GT A-dHT T-EthdA G-U A-U

taux de coupure (%)

Témoin XPC XPA

ce qui est en accord avec la littérature. Notre test d’excision sur support ne permet pas de mesurer des taux de coupure inférieurs à 10 %, à cause de la variabilité du test.

En conclusion, comme attendu, l’efficacité d’excision par un lysat nucléaire, de lésions réparées par des ADN N-glycosylases, est dépendant de la nature de la lésion et de très grandes disparités dans les efficacités sont observées. Cette première approche, avec un lysat nucléaire témoin, a permis de déterminer les concentrations protéiques à employer pour avoir une activité d’excision spécifique. Ainsi, aux vues de ces résultats préliminaires, nous avons choisi d’étudier l’excision en présence de deux concentrations protéiques : 0,5 et 20 µg/mL.

La plus faible concentration a été choisie afin de pouvoir observer des différences de taux de coupure pour les lésions dont le rendement de coupure est élevé (A-THF et G-U). En effet, l’excision de ces deux lésions étant très efficace, il est judicieux de se placer à une concentration pour laquelle la réaction n’est pas encore arrivée au plateau. La concentration de 20 µg/mL nous permettra d’étudier la coupure des lésions, excisées avec une efficacité moindre (par exemple les diols de thymine et de la lésion A-U).

Nous allons maintenant nous intéresser aux activités d’excision obtenues avec des lysats de cellules XP. Ces cellules sont déficientes pour la NER mais nous avons vu qu’il existe des interactions entre la voie NER et la voie BER. Par exemple, nous avons confirmé lors de l’étude des activités d’excision-resynthèse le rôle de XPC dans la réparation des lésions prises en charge par la BER. Il s’agit donc d’étudier à l’aide de la puce oligo, si nous mesurons des activités différentes d’excision entre un lysat témoin et un lysat XP.