Variabilité des intensités de fluorescence entre les expériences

Nous devons faire face à une variabilité entre nos expériences réalisées sur la puce plasmide. En effet, d’une expérience à l’autre, les intensités de fluorescence peuvent fluctuer.

Plusieurs raisons sont à l’origine de cette variabilité et nous allons voir comment nous pouvons la maîtriser.

Les lames nous servant de support sont conditionnées par lot de 25 lames. Nous avons observé à plusieurs reprises une variabilité inter-lots de lames. La qualité du gel était contrôlée par le fournisseur (Perkin Elmer) mais d’un lot à l’autre, il se peut que la qualité ne soit n’est pas forcément rigoureusement la même. Les plasmides sont déposés le même jour, lors d’une même campagne de dépôts, sur toutes les lames d’un même lot. D’une campagne de dépôt à une autre, nous pouvons aussi avoir des différences (volume, taille des gouttes) ce qui impacte la reproductibilité des signaux de fluorescence obtenus. Deux lames provenant de deux lots différents pourront donc donner des signaux de fluorescence différents dus à la variabilité des gels et au dépôt des plasmides.

Nous avons également noté des différences de signaux de fluorescence entre deux expériences réalisées sur des lames d’un même lot mais avec des réactions d’ER menées à des jours différents. Il a été montré que l’ozone contenu dans l’atmosphère ambiante entraîne des variations du signal fluorescent (Branham et al., 2007). En effet, le Cy5 est détruit par l’ozone de l’air. Ainsi, suivant les conditions atmosphériques régnant le jour de l’expérience, nous pouvons obtenir des intensités de fluorescence très variables avec le même lysat cellulaire et les mêmes conditions réactionnelles.

Bien que l’intensité de fluorescence totale varie d’une expérience à l’autre, nous nous assurons systématiquement que la part relative de la réparation des 6 lésions reste constante.

En effet, nous vérifions que le camembert représentant la part prise par la réparation de chaque lésion soit le même d’une expérience à l’autre. De cette façon, nous nous assurons de la bonne conduite de l’expérience en dépit de la variabilité du signal.

D’autre part afin de standardiser notre test, chaque série d’expériences mises en œuvre au laboratoire est réalisée systématiquement en présence d’un lysat nucléaire de cellules HeLa. Ce lysat commercial, reçu en grande quantité (20 mL) et stocké en aliquots nous sert d’extrait de référence. Les résultats obtenus avec cet extrait nous permettent d’une part de déterminer la variabilité inter-expérience et d’autre part de normaliser nos résultats entre eux.

Dans notre étude, le lysat de cellules témoin (ie. non déficientes pour la réparation de l’ADN) constitue notre lysat de référence.

Chapitre II

Partie II

Etude préliminaire à partir du

modèle siRNA

Notre stratégie a consisté dans un premier temps à explorer le sujet à partir d’un modèle artificiel à savoir des cellules HeLa siRNA. Le système siRNA permet l’extinction de l’expression d’un gène spécifique. Dans notre cas, les cellules HeLa ont été transfectées avec un vecteur codant pour un ARN interférence (siRNA) permettant d’annuler l’expression soit du gène XPA soit du gène XPC. Ces lignées cellulaires ont été établies par le Dr. Denis Biard (Biard et al., 2005). Le vecteur EBV qui est transfecté dans les cellules HeLa permet une expression stable du vecteur et une extinction à long terme (plusieurs centaines de jours) de l’expression du gène ciblé. Ainsi, dans notre cas il n’y aura pas de protéine XPA ou XPC dans les cellules correspondantes.

Le modèle siRNA a été choisi pour sa commodité de culture et la facilité d’obtention de ces cellules. De par l’expression stable du vecteur, ces cellules peuvent être cultivées pendant plusieurs mois tout en conservant le phénotype éteint, ce qui permet de préparer un grand nombre de culots cellulaires pour pouvoir ensuite étudier la réparation sur la puce plasmide. Par ailleurs, nous avons choisi de commencer l’étude avec ce modèle pour s’affranchir de l’effet du patrimoine génétique sur la réparation. En effet, ici, toutes les lignées obtenues ont été construites à partir du modèle HeLa et possèdent donc toutes le même génotype. Ce n’est pas le cas, par exemple, quand nous utilisons des cellules issues de patients XP : toutes les lignées sont alors issues de fonds génétiques différents correspondant aux différents patients. Enfin, les lignées HeLa siRNA présentent une extinction totale de l’expression du gène ciblé. Contrairement aux cellules pouvant provenir de patients XP, où la protéine de la réparation peut être soit absente, soit partiellement tronquée, ici la protéine ciblée est totalement absente. Ainsi, le modèle HeLa siRNA permet de s’affranchir de la variabilité génotypique et donc phénotypique régnant au sein de la maladie XP.

Nous voulions commencer nos études avec un modèle simple modélisant la maladie complexe du Xeroderma pigmentosum. Les cellules HeLa siRNA ont donc été utilisées dans un but exploratoire. Il s’agissait d’avoir un premier aperçu de ce que nous pouvions obtenir en termes d’activités de réparation de l’ADN de cellules XP.

Les profils de réparation ont tout d’abord été étudiés au niveau basal (ie. sans traitement génotoxique) à partir de lysats nucléaires de HeLa siRNA. Les conditions de préparation des lysats nucléaires ainsi que les conditions expérimentales pour le test in vitro sur puce avaient été optimisées par J.F Millau (Millau et al., 2008b). Nous nous sommes donc appuyés sur ces conditions pour débuter l’étude.

Figure 34: Niveau relatif d’excision-resynthèse de lysats nucléaires HeLa siRNA déposés à 0,4 mg/mL de protéines (moyenne de 6 expériences indépendantes). Pour chaque lysat XP, l’intensité totale de fluorescence est exprimée en pourcentage de l’intensité de fluorescence du lysat témoin. L’intensité de fluorescence du lysat témoin est fixée à 100%.

0 20 40 60 80 100 120 140

pCPD-64 p8oxoG pAlkB pCisP pAbaS pGlycol

% par rapport au lysat témoin

Témoin siRNA XPC

XPA

Figure 34: Niveau relatif d’excision-resynthèse de lysats nucléaires HeLa siRNA déposés à 0,4 mg/mL de protéines (moyenne de 6 expériences indépendantes). Pour chaque lysat XP, l’intensité totale de fluorescence est exprimée en pourcentage de l’intensité de fluorescence du lysat témoin. L’intensité de fluorescence du lysat témoin est fixée à 100%.

0 20 40 60 80 100 120 140

pCPD-64 p8oxoG pAlkB pCisP pAbaS pGlycol

% par rapport au lysat témoin

Témoin siRNA XPC

XPA

I. Caractérisation d’activités de réparation de l’ADN au niveau