CHAPITRE 5 IMMOBILISATION LOCALISEE DE CELLULES ET DE SPORES SUR NANOFILS DE SILICIUM
3. A NTI - ADHESION DE SPORES HYDROPHOBES SUR DES NANOFILS DE SILICIUM SUPERHYDROPHILES
3.2. Adhésion sélective de spores Bacillus Cereus sur nanofils de silicium dans des zones hydrophobes et
Grâce aux deux surfaces de silicium présentées plus haut, nous pouvons étudier l’adhésion des spores Bacillus Cereus sur deux types de chimie de surface, et deux topographies, mais aussi suivant des zones de différentes tensions de surfaces : superhydrophiles, hydrophiles, hydrophobes ou encore superhydrophobes. On peut schématiser les deux surfaces comme ci-dessous (Figure 5.17) suivant les angles de contact du tableau.
Figure 5.17. Schéma des surfaces de silicium et de nanofils de silicium avec les zones
‘SiO2/OTS’ en coupe et tableau avec la valeur des angles de contact associés à chaque zone.
Pour évaluer l’interaction préférentielle des spores avec une zone, on observe le nombre de spores ayant adhéré sur chaque zone après incubation et un rinçage doux à l’eau. Les spores Bacillus Cereus (ATCC 14579T) ont été marquées avec la GFP.13
Les spores sont produites à 30°C sur de la gélose (Spo8-agar) contenant 8 g.L-1 de nutriments (Biokar Diagnostics, Beauvais, France), 0.5 g.L-1 de MgSO4.7H2O, 0.9 g.L-1 KCl, 0.2 g.L-1 CaCl2.2H2O, 3.10-3 g.L-1 MnCl2.4H2O, 0.55.10-3 g.L-1 Fe2SO4.7H2O, et 1,5% de gélose. A 95% de confluence, les spores sont récoltées en grattant la surface puis lavées 5 fois dans de l’eau fraîche. Une suspension aqueuse contenant 106 spores/mL est préparée par dilution d’une solution de 10 mL contenant 108 spores que l’on agite aux ultrasons (Deltasonic Meaux, France, 40 kHz) durant 1 minute pour éliminer les agrégats.
La suspension contenant 106 spores/mL est bien agitée juste avant que les surfaces ne soient incubées verticalement pendant 30 minutes à température ambiante. Les surfaces sont ensuite rincées délicatement par trempage vertical dans une solution d’eau milliQ (5x) puis finalement séchées sous un flux d’air.
La Figure 5.18 montre les observations en fluorescence et au MEB après incubation et un doux rinçage pour les surfaces planes hydrophiles (zone carrée)/hydrophobes (zone autour du carré). Les spores se sont ‘attachées’ aux zones hydrophobes du silicium plat, tandis que très peu sont restées sur les zones hydrophiles. On observe aussi la surface après un rinçage plus drastique par agitation avec un vortex pendant 1 minute dans un tube de 35 mL d’eau milliQ. Malgré les turbulences lors de l’étape de rinçage par vortex, aucune
13The spores were tagged with a GFP. A BamHI fragment from pPE28 containing the gfp gene under the control of spoIIQ promoter was cloned into BamHI restriction site of pHT315, yielding the pYL300 vector. The pYL300 vector was electroporated into ATCC 14579T. Strain ATCC 14579T pYL300 was used to produce fluorescent spores as previously described [Faille, C et al. J. Food Prot. 2007, 70, 2346-2353].
spore ayant adhéré à la surface ne se décroche quelque soit le type de zone, et que la surface soit plane ou structurée de nanofils de silicium.
Figure 5.18. Image MEB14 (a) et en fluorescence (x1000) (b) des spores Bacillus Cereus après incubation avec les surfaces de silicium plat renfermant des zones carrées hydrophiles de 50 µm2 entourées de zones hydrophobes.
En ce qui concerne la surface des nanofils de silicium, les spores ont également adhéré sur les régions superhydrophobes et quasiment pas sur les régions superhydrophiles (Figure 5.19).
La terminaison chimique du silicium semble avoir un rôle de grande importance puisqu’il n’y a presque pas de spores dans les régions au contact du liquide. Les forces de répulsion entres les surfaces de terminaison chimique Si-OH et les spores hydrophobes sont donc non négligeables. Les forces d’attraction entre les chaînes apolaires des spores et le silicium méthylé semblent assez conséquentes puisque le rinçage par vortex ne permet pas de détacher les spores des surfaces.
Par ailleurs, il y a globalement moins de population sur les zones superhydrophobes des nanofils de silicium que sur les zones hydrophobes du silicium plat. On peut supposer que cela est dû au contact discontinu entre les spores et la surface comme l’a déjà montré l’étude d’Emmerson et al.266 De plus, la taille des nanofils et leur espacement favorise un état Cassie-Baxter (Annexe 1) si on considère l’angle de contact observé et la faible hystérésis mesurée sur ces nanofils superhydrophobes (Figure 5.17). L’air piégé entre les nanofils augmente la force de répulsion appliquée sur l’eau contenant les spores, ce qui pourrait expliquer qu’il y ait une probabilité de contact avec les spores plus faible et donc globalement moins de spores sur les zones superhydrophobes que sur les zones hydrophobes.
14 Les surfaces avec les spores adhérées sont métallisées avant l’observation au MEB.
20µm
20µm 50µm50µm
a) b)
Figure 5.19. Image MEB15 (a) et en fluorescence (b) des spores Bacillus Cereus après incubation avec les surfaces de nanofils de silicium renfermant des zones superhydrophiles de 50 µm2 entourées de zones superhydrophobes.
Sur la Figure 5.19, on remarque aussi une tendance des spores à se positionner et à s’aligner à l’interface superhydrophile/superhydrophobe. Lorsqu’on retire la surface de la suspension de spores, le liquide reste uniquement dans les zones superhydrophiles. Il est possible que les spores s’accumulent au bord de celles-ci étant donné leur peu d’affinité avec la terminaison chimique Si-OH, où aussi par effet donut.
En conclusion, la géométrie des nanofils de silicium (déterminant le caractère superhydrophobe Cassie-Baxter – Annexe 1) et la chimie de surface (interaction apolaire - Chapitre 2 .3.2.4) s’avèrent donc déterminants pour l’aspect anti-bactérien.