Le mécanisme complexe et encore occulte du MALDI

De nombreuses découvertes ont rapidement eu lieu en chimie et en biomédecine depuis la mise en place du MALDI-TOF alors que ses aspects mécanistiques n’ont émergé que dix ans plus tard.^45,46 La qualité des analyses MALDI a donc majoritairement progressé de manière empirique et les observations révèlent qu’elle dépend aussi bien de la méthode de préparation de l’échantillon avant introduction dans la source, que des paramètres d’irradiation laser. En parallèle des ces optimisations se sont multipliées des études et des modélisations sur les phénomènes de dynamique moléculaire possibles pour « la plume ».

Ce terme correspond au nuage formé par les analytes une fois désorbés de la cible métallique. Nous résumons ici quelques unes des investigations qui ont éclairé ou amélioré le procédé de désorption/ionisation (DI) de la technique MALDI.

4.2.1. Le protocole de préparation des échantillons

On sait maintenant que l’efficacité varie selon la nature de la matrice organique, la méthode de dépôt de l’échantillon, le pH et la nature du solvant, le ratio matrice/analytes (fixé à 1000/1 car la matrice en large excès limite l’agrégation des molécules et la formation d’ions moléculaires M₂⁺), la présence de tensioactifs (molécules amphiphiles), et finalement selon les caractéristiques intrinsèques des analytes.

Les modes de dépôts de l’échantillon les plus employés sont la méthode de la goutte séchée et la méthode en sandwich. La première technique consiste à déposer le mélange matrice/analyte sur la plaque MALDI et à le laisser sécher tandis que pour la seconde l’analyte est inséré entre deux couches de matrice. Il n’y a pas eu de règle générale établie ; le choix du mode de dépôt est empirique et dépend de l’échantillon à analyser. Toutefois, si de nombreux groupes s’accordent à dire qu’il n’y a aucune relation entre la morphologie de la matrice et la qualité des analyses MALDI, le fait d’incorporer les analytes dans la matrice ou non a été et demeure un long débat.⁴⁵ Horneffer et al. ont de leur coté souligné l’importance de déposer les analytes dans un solvant et non pas directement sur le dépôt sec de la matrice.⁴⁷

4.2.2. L’irradiation laser

• Longueur d’onde du laser et spectre d’absorption de la matrice

Comme nous l’avons vu, plusieurs lasers et plusieurs matrices peuvent être utilisés pour les analyses MALDI-TOF. La relation entre la longueur d’onde du laser et la longueur d’onde d’absorption de la matrice a été étudiée par de nombreux groupes.^48,49 Par exemple pour la gamme des UV, il en ressort quantitativement que la performance de l’analyse culmine

lorsque la longueur d’onde du laser correspond au maximum du spectre d’absorption de la matrice.⁵⁰ Néanmoins, il a aussi été démontré que lorsque le spectre d’absorption d’une matrice est suffisamment large (absorption sur une large gamme de longueur d’onde), une faible absorption à la longueur d’onde du laser peut être compensée par une puissance laser plus importante. Il y a tout de même un coefficient d’absorption critique en dessous duquel quelle que soit la puissance laser utilisée, il n’y a pas de signal MALDI.⁵¹

• Puissance du laser et taille du faisceau laser

On ne l’explique pas encore exactement, mais lorsque la taille du faisceau laser diminue (donc la surface irradiée diminue), la puissance laser doit être augmentée afin d’obtenir le signal optimal.^52,53 Une des raisons peut être que l’augmentation de la puissance du laser conduit à la désorption d’un plus grand nombre d’analytes par pulse laser et à des paquets d’analytes désorbés plus volumineux.⁵⁴

• Puissance laser et intensité du signal des ions

Il existe un seuil de puissance laser pour lequel le signal est optimal : il faut une certaine puissance afin de désorber un nombre d’analytes suffisant mais la puissance laser ne doit pas être trop élevée afin d’éviter la fragmentation des molécules ou la saturation du détecteur. Ce seuil a même été mis en évidence par des mesures de comptage d’ion unique par conversion des données numériques en temps (TDC pour Time to Digital Conversion).^53,55

• Durée du pulse laser

Si la durée du pulse laser est trop longue (>25 nanosecondes), les analytes se dégradent thermiquement avant qu’ils ne passent en phase gazeuse.⁵⁶ Vertes et al. ont souligné l’importance d’un passage rapide^56,57 de la phase condensée à la phase gaz, autrement dit d’un transfert rapide d’énergie de la matrice aux analytes. Ils ont montré que la rapidité est fonction de la durée du pulse laser, des propriétés physico-chimique de la matrice (absorption optique et profondeur de pénétration laser associée, densité, chaleur spécifique, conductivité thermique), mais aussi du rapport analytes/matrice. Une

concentration d’analytes trop élevée par rapport à la matrice conduit effectivement à un transfert d’énergie trop important de la matrice vers les analytes et à une dégradation thermique de ces derniers. La matrice permet en fait de dissiper l’énergie laser et d’éviter cette dégradation thermique. Deux types de dissipation d’énergie laser par la matrice entrent particulièrement en considération dans la littérature : le premier serait un transport de chaleur pris en charge par la matrice tandis que le second serait une dissipation d’énergie par ondes de stress mécanique dans le réseau matrice/analytes.⁴⁵

Vertes et al. ont aussi testé des durées de pulse laser de l’ordre de la femtoseconde et conclu à de moins bonnes performances (notamment dues à des phénomènes de fragmentations) qu’avec des durées de pulse laser de l’ordre de la nanoseconde. Ceci

suggère qu’il y ait un impact de la durée du pulse laser sur la dynamique de dissociation des molécules lors de leur éjection.

4.2.3. Ejection des molécules.

S’il y a peu de chance qu’il existe un modèle uni du phénomène d’expansion en phase gazeuse, quelques hypothèses reposent sur l’instabilité thermodynamique (surchauffage) ou la décomposition spinodale de l’échantillon. Des valeurs expérimentales semblent aussi concorder avec des lois de dépendance⁵⁸ entre le taux de molécules éjectées et les paramètres d’énergie d’activation, de densité, de chaleur spécifique, de température initiale des molécules, et également de paramètres optiques (coefficient d’absorption, fluorescence, profondeur de pénétration laser). Cependant, l’éjection de molécules individuelles est un cas simplifié. L’éjection de paquets de molécules de matrice/analytes et leur dissociation est un phénomène encore plus difficile à éclaircir.⁴⁵

4.2.4. L’ionisation

Deux grandes phases du processus d’ionisation ont été décrites par Knochenmuss et Vertes : l’ionisation primaire et l’ionisation secondaire.⁵⁹ L’ionisation primaire serait le résultat combiné de la photo-excitation des molécules de matrice (un électron passe à un niveau d’énergie électronique supérieur de la matrice) et d’un mécanisme thermique favorisé par une température locale très élevée. L’ionisation d’une molécule de matrice dépend aussi de son potentiel d’ionisation : ce dernier est connu pour les matrices en solution mais il l’est moins pour les matrices sous leurs formes cristallines. L’ionisation secondaire aurait lieu, elle, lors de la phase d’expansion, par transfert de protons en phase gazeuse.⁶⁰ Durant ces processus d’ionisation, l’affinité protonique est un paramètre essentiel qui favorise l’ionisation de l’analyte. Les protéines et les peptides ont une affinité protonique de l’ordre de 240 kcal/mol,⁶¹ supérieure aux affinités protoniques des matrices les plus couramment utilisées ( Tableau 1.5) : la protonation des analytes et la déprotonation des molécules de matrice sont donc thermodynamiquement favorisées. Si l’écart entre les valeurs d’affinités protoniques des analytes et des molécules de matrice est important, la réaction du transfert de protons peut être exothermique et expliquer la fragmentation de certains analytes.^62,63,64

Matrices 4-HCCA 2,5-DHB HPA SA Glycine Lysine Arginine

Affinité protonique mesurée (Kcal/mol)

223 183 201

204 202.4

204

214 214.5

214 204 212 210

210.5 235.6 244.8

Basicité mesurée en phase gazeuse

(Kcal/mol)

215 197 206 202.7 221.8 237

Tableau 1.5. Valeurs de basicité et d’affinités protoniques mesurées de matrices et d’analytes (glycine, lysine et arginine).⁶⁵

4.2.5. La dynamique de la « plume »

Les études expérimentales et à la fois les simulations de la dynamique moléculaire du panach (ou de la « plume » en anglais) dans la phase gaz sont très importantes et ont aidé à l’optimisation de l’instrumentation du MALDI. Les paramètres qui caractérisent la plume sont majoritairement sa composition (ions, molécules neutres, paquets de matrice/analytes, fragments, protons, électrons) et son évolution temporelle (désintégration des paquets, collisions, réactions intermoléculaires, mouvement « hydrodynamique », vitesse et vitesse initiale de chaque élément composant la plume).

Les mesures expérimentales des vitesses des molécules lors d’analyses MALDI utilisant un laser UV sont assez différentes selon les groupes.⁴⁵ Les conclusions sont aussi difficiles à tirer de par les différentes méthodes de mesures employées (méthode DE, méthode de dérivation du champ libre FFD). Les études s’accordent tout de même sur certains points : la vitesse des ions ne dépendraient pas de la masse des ions ou de la puissance du laser, par contre, la réduction de la taille du faisceau laser entraînerait une augmentation de la vitesse des ions. La vitesse des molécules neutres a aussi majoritairement été déterminée légèrement inférieure à celle des ions. Aussi, les vitesses axiales sont nettement supérieures aux vitesses radiales et les molécules co-désorbées ont leur nuage d’expansion moins diffus que celui des ions de la matrice. Finalement, il semble qu’il y ait deux phases selon le type de molécules co-désorbées (une phase d’évaporation et une phase d’expansion) alors que ce serait moins le cas pour les molécules de la matrice.

Malgré des tendances globales, les études montrent aussi que la dynamique moléculaire est largement dépendante du type d’analytes et de la matrice qui leur est associée. Par ailleurs, les simulations tendent à s’approcher des valeurs mesurées mais ne correspondent pas encore très précisément.

4.3. Limitations du MALDI et techniques alternatives de LDI-MS