Attachement des NCs sur les mol´ecules d’ADN

qu’en solution

Deux voies s’offraient `a nous au d´ebut de ce projet : attacher des NCs aux extr´emit´es de l’ADN puis peigner ces mol´ecules (1), ou proc´eder dans l’ordre inverse et attacher des mol´ecules d’ADN sur des mol´ecules d´ej`a peign´ees (2). La r´ealisation de (1) nous a sembl´e pr´esenter des obstacles beaucoup plus grands (sch´ematis´es sur la figure 2.25) que celle de (2). En effet, un nanocristal ´etant susceptible de se lier avec plusieurs groupements biotine (pouvant appartenir `a des extr´emit´es de mol´ecules d’ADN diff´erentes), l’exp´erience doit ˆetre conduite en large exc`es de NCs pour ´eviter le cross-linking des mol´ecules d’ADN, exp´erimenta- lement d´esastreux, ce qui pose le difficile probl`eme de leur purification ult´erieure.

De plus, il est exp´erimentalement difficile de trouver des conditions dans lesquelles on puisse peigner les mol´ecules d’ADN tout en ´evitant une interaction forte des

2.3. D´ETECTION DE MOL´ECULES D’ADN PEIGN´E `A L’AIDE DE NANOCRISTAUX

605

605 605

605

605

(1)

(2)

(a) (b)

Fig. 2.25 – (1)(a) Attacher en solution les NCs aux mol´ecules d’ADN pr´esente un risque de pontage des mol´ecules d’ADN ; (b) de plus, l’adsorption des NCs `a la surface risque de perturber le peignage des mol´ecules d’ADN. (2) L’attachement des NCs `a des mol´ecules d’ADN d´ej`a peign´ees ´evite ces deux probl`emes.

NCs avec la surface.

Nous n’affirmons pas que le protocole (1) n’est pas r´ealisable, mais il est vrai- semblablement plus complexe `a mettre en œuvre que (2). En effet, une fois con¸cu et fabriqu´e l’ADN d´ecrit pr´ec´edemment, le protocole (2) ne pr´esente plus qu’une difficult´e : d´eterminer des conditions exp´erimentales dans lesquelles l’adsorption non-sp´ecifique des NCs est la plus faible possible.

b) Traitement des lames contre l’adsorption non sp´ecifique des nano- cristaux

En l’absence d’un traitement appropri´e, les nanocristaux s’adsorbent massive- ment sur les surfaces, aussi bien hydrophiles (lame de verre non trait´ee) qu’hy- drophobes (lame de verre recouverte de polystyr`ene). Une ´etape de traitement des surfaces pr´ealable `a l’introduction des nanocristaux est donc imp´erativement requise. Les premiers essais utilisant des solutions dilu´ees de BSA ou le ”tampon d’incubation” fourni et recommand´e par Quantum Dots Corporation ont conduit

`a des r´esultats insuffisants. En revanche, comme le d´emontre la figure 2.26, l’uti- lisation d’une solution `a base de cas´eine (”Blocking Reagent”, Roche) supprime presque enti`erement l’adsorption non-sp´ecifique des nanocristaux sur la surface.

c) R´esultats : images et films exp´erimentaux

Des images r´ealis´ees `a partir de mol´ecules d’ADN pr´esentant une extr´emit´e

(a) (b) (c)

Fig. 2.26 – Adsorption des nanocristaux-streptavidine 605 nm sur des lames sans/avec traitement des lames avec une solution de cas´eine. Dans les 3 cas les lames sont recouvertes pendant 10 min de 100 µl d’une solution de nanocristaux (`a 2 nM dans le tampon Borate 40 mM pH 8.3, NaCl 100 mM) puis rinc´ees avec le tampon Borate 40 mM pH 8.3. (a) En l’absence de traitement pr´ealable, la lame de verre+polystyr`ene est recouverte de nanocristaux (b) Apr`es un traitement de la lame avec 1.5 mg/ml de ”Blocking Reagent”, seuls quelques spots de nanocristaux sont visibles sur la surface (c) Quand le ”Blocking Reagent” est en plus ajout´e (`a 0.3 mg/ml) dans la solution de nanocristaux, l’adsorption non-sp´ecifique des nanocristaux est quasiment supprim´ee.

10 µm

Fig.2.27 – D´etection des mol´ecules d’ADN peign´ees (images superpos´ees d’ADN et NC). L’ADN est marqu´e au YOYO-1 (en vert). Les extr´emit´es biotine sont d´etect´ees avec des NC-streptavidine 565 (D) ou 605 (A et C) (en rouge). Les extr´emit´es digoxig´enine sont d´etect´ees avec de l’anti-digoxig´enine de souris puis des NC anti-souris 655 (B et D) (en bleu). Quatre types d’ADN ont ´et´e uti- lis´es : une extr´emit´e biotine (A), une extr´emit´e digoxig´enine (B), deux extr´emit´es biotine (C), une extr´emit´e biotine et une extr´emit´e digoxig´enine (D)(barres : 10 µm).

biotine, une extr´emit´e digoxig´enine, deux extr´emit´es biotine ou une extr´emit´e biotine et une extr´emit´e digoxig´enine sont repr´esent´ees sur la figure 2.27. La figure 2.28 illustre la diff´erence de photostabilit´e d’un fluorophore organique comme le YOYO-1 et des nanocristaux. La fluorescence des mol´ecules d’ADN teint´ees au YOYO-1 d´ecroˆıt progressivement au cours du temps, alors que ce n’est pas le cas pour les nanocristaux.

2.3. D´ETECTION DE MOL´ECULES D’ADN PEIGN´E `A L’AIDE DE NANOCRISTAUX

10 µm

Fig. 2.28 – Observation simultan´ee de mol´ecules d’ADN et de nanocristaux. Les mol´ecules d’ADN ont ´et´e ligu´ees `a deux extr´emit´es biotine, marqu´ees au YOYO-1 et peign´ees. Les extr´emit´es sont d´etect´ees avec des nanocristaux streptavidine `a 605 nm. Un film de 60 images (temps d’exposition : 1 s) est r´ealis´e au moyen d’un filtre d’´emission passe-long. Comme le montrent les images extraites de ce film, la fluorescence des mol´ecules d’ADN marqu´ees au YOYO-1 diminue au cours du temps (fl`eches) et ne peut plus ˆetre observ´ee apr`es quelques dizaines de secondes, alors que les NCs (triangles) ne sont sujets qu’`a un clignotement intermittent.

2.3.2.3 Mat´eriels et m´ethodes