Utilisation des m´ethodes optiques en vue de l’´etude

Ces derni`eres ann´ees, plusieurs groupes ont utilis´e les m´ethodes optiques afin d’´etudier l’action de diverses prot´eines sur l’ADN. Ce paragraphe d´ecrit trois de ces exp´eriences. Dans tous les cas, deux grandes ´etapes sont n´ecessaires `a la r´ealisation de telles exp´eriences :

– Les mol´ecules d’ADN sont sous forme de pelotes en solution. Or le contour de telles pelotes ne peut pas ˆetre observ´e en microscopie optique. Il est donc n´ecessaire de d´eplier les mol´ecules d’ADN.

– Les biomol´ecules que l’on souhaite observer doivent ˆetre coupl´ees `a un ou quelques fluorophore(s).

Observation du mouvement de l’enzyme de restriction EcoRI le long de l’ADN (groupe de M. Washizu, Japon, 2000)

Kabata et al. ont ´etir´e des mol´ecules d’ADN parall`element entre deux ´electrodes.

Ils ont ensuite introduit au voisinage de ces mol´ecules des enzymes EcoRI coupl´ees

`a quelques mol´ecules de rhodamine, dans un flux de direction diff´erente de celle des mol´ecules d’ADN ´etir´ees. Comme le montre la figure 1.26, la trajectoire des enzymes marqu´ees alterne des mouvements dans la direction du flux, in- terpr´et´es commme un mouvement en solution, des mouvements dans la direction de l’ADN, interpr´et´es comme le glissement d’enzymes li´ees `a l’ADN, et des pauses interpr´et´ees comme la fixation d’EcoRI `a sa s´equence-cible [18]. Cette exp´erience semble d´emontrer la possibilit´e pour EcoRI d’un mouvement le long de l’ADN.

(a) (b)

Fig.1.26 – exp´erience de M. Washizu : (a) Observation du mouvement d’enzymes marqu´ees dans un flux en pr´esence de mol´ecules d’ADN ´etir´ees dans une direction non parall`ele au flux. (b) Une des trajectoires observ´ees.

Cependant, la pr´esence d’un flux dans cette exp´erience induit une direction pri- vil´egi´ee pour le mouvemement d’EcoRI. Le sliding d’EcoRI le long de l’ADN est donc biais´e par la pr´esence de ce flux, de sorte que cette exp´erience ne permet pas d’acc´eder directement aux caract´eristiques de la diffusion d’EcoRI le long de l’ADN.

Observation du sliding d’une ARN polym´erase le long de l’ADN (groupe de T. Yanagida, Japon, 1999)

L’exp´erience de Harada et al. pr´esent´ee sur la figure 1.27 combine l’utilisation de techniques de micromanipulation pour ´etirer l’ADN, et de techniques optiques pour observer l’interaction avec l’ADN d’une ARN polym´erase marqu´ee avec du Cy3 . La combinaison de ces deux techniques n’est exp´erimentalement pas ais´ee. L’´equipe de T. Yanagida y est n´eanmoins parvenue en ´etirant les mol´ecules d’ADN au-dessus de surfaces structur´ees, ce qui permet de limiter l’illumination des enzymes marqu´ees au voisinage de la mol´ecule d’ADN par l’utilisation d’une onde ´evanescente. Ce mode de d´etection supprime le fond lumineux dˆu aux en- zymes situ´ees loin de cette mol´ecule et am´eliore donc la pr´ecision avec laquelle les enzymes marqu´ees interagissant avec l’ADN peuvent ˆetre localis´ees [11]. Cette exp´erience a permis d’observer le sliding d’ARN polym´erases individuelles le long de l’ADN. Cependant, le coefficient de diffusion correspondant n’a ´et´e caract´eris´e que semi-quantitativement au terme de cette ´etude.

Observation de la polym´erisation d’ARN par une ARN polym´erase (groupe de B. Berge, Lyon, 2002)

Gu´eroui et al. ont r´ealis´e en 2002 une exp´erience visant `a ´etudier l’action d’une ARN polym´erase par microscopie de fluorescence. Ils ont pour cela d´epli´e et ac- croch´e sur une surface des mol´ecules d’ADN en utilisant la technique de ”peignage

1.3. EXP´ERIENCES `A L’´ECHELLE DE LA MOL´ECULE UNIQUE

5 µm

Fig. 1.27 – exp´erience de T. Yanagida : (a) L’ADN est coupl´e `a deux billes di´electriques et ´etir´e au moyen de pinces optiques au-dessus d’une surface pr´esentant une ”marche”, ce qui permet l’utilisation d’une onde ´evanescente.

(b) Observation des billes. (c) Trois images extraites d’un film, montrant le d´eplacement d’ARN polym´erases marqu´ees (point´ees par des fl`eches) le long de l’ADN.

DNA

(a) (b)

5 µm

Fig. 1.28 – exp´erience de B. Berge : (a) Principe de l’exp´erience : des mol´ecules d’ADN peign´ees sont mises en pr´esence d’ARN polym´erase et de nucl´eotides fluorescents. (b) Les images r´ealis´ees montrent que les ARN polym´erases ont r´eussi `a synth´etiser des mol´ecules d’ADN (points lumineux).

mol´eculaire”, qui sera d´ecrite dans le chapitre suivant de cette th`ese. L’incorpo- ration de nucl´eotides fluorescents par une polym´erase non marqu´ee conduit `a la pr´esence de chapelets de mol´ecules d’ARN fluorescentes le long des mol´ecules d’ADN (figure 1.28) [13]. Cette exp´erience d´emontre qu’il est possible de faire

agir des prot´eines sur des mol´ecules d’ADN individuelles peign´ees sur une sur- face. N´eanmoins, cette ´etude ´etait essentiellement ”statique”. La cin´etique de la polym´erisation d’ARN n’a pas ´et´e examin´ee : il semble en effet tr`es difficile de quantifier la quantit´e d’ARN produite au cours du temps dans cette exp´erience.

Notons de plus que dans cette exp´erience, ce n’est pas l’enzyme ´etudi´ee qui a ´et´e visualis´ee, mais les brins d’ARN produits par son action. Une telle approche n’est pas possible avec une enzyme de restriction.

1.3.2.3 Strat´egie utilis´ee dans nos exp´eriences

molécule d'ADN étirée

enzyme

fluorophore

Fig. 1.29 – Strat´egie exp´erimentale.

Notre exp´erience vise `a l’observation directe du sliding d’une enzyme de res- triction EcoRV le long d’une mol´ecule d’ADN individuelle. Une repr´esentation tr`es sch´ematique du dispositif utilis´e est donn´ee sur la figure 1.29. Nous avons utilis´e des protocoles d’´etirement de l’ADN et de couplage des enzymes `a des fluorophores un peu diff´erents de ceux pr´esent´es dans le paragraphe pr´ec´edent.

Etirement de l’ADN

Nous avons d´evelopp´e une technique pour placer les mol´ecules d’ADN dans une configuration ´etir´ee ”en arche”, qui permet leur interaction ult´erieure avec des prot´eines. La description de cette technique fait l’objet du chapitre suivant.

Cette m´ethode d’´etirement est plus simple `a mettre en œuvre exp´erimen- talement que celle utilis´ee par T. Yanagida, qui requiert l’utilisation de pinces optiques et la fabrication de surfaces structur´ees. Elle conduit de plus `a un accro- chage sp´ecifique des extr´emit´es de l’ADN, et non `a de nombreux points d’ancrage des mol´ecules d’ADN sur les surfaces comme c’est le cas avec la technique utilis´ee par Gu´eroui et al..

Couplage d’EcoRV `a un fluorophore

Les deux imp´eratifs majeurs li´es `a ce couplage sont de ne pas gˆener l’action des enzymes et de permettre leur d´etection avec des r´esolutions spatiale et temporelle suffisantes pour caract´eriser quantitativement leurs mouvements sur l’ADN. Ces contraintes ont pu ˆetre satisfaites par le couplage d’EcoRV `a des nanocristaux, qui sont des fluorophores inorganiques dont les propri´et´es d’absorbance et de photostabilit´e sont excellentes. Le dernier chapitre de ce m´emoire est consacr´e aux r´esultats obtenus.

Chapitre 2

Comment placer les mol´ ecules d’ADN dans une configuration optimale pour l’observation de leur interaction avec les

prot´ eines ?

10 µm

Observation de moléculesd'ADNétirées

Détectionde moléculesd'ADNavecdesnanocristaux

2.1. ETIREMENT DES MOL´ECULES D’ADN

2.1 Etirement des mol´ ecules d’ADN

En solution aqueuse, les mol´ecules d’ADN se pr´esentent sous forme de pelotes, dont la position et la conformation varient rapidement au cours du temps. Ces pe- lotes ne peuvent pas ˆetre r´esolues en microscopie optique. Il est donc n´ecessaire de les d´eplier et de les immobiliser. Pour cela, des techniques tr`es diff´erentes ont d´ej`a ´et´e mises en œuvre : couplage de billes di´electriques/magn´etiques (ma- nipulables avec des pinces optiques/magn´etiques) aux extr´emit´es des mol´ecules d’ADN [5, 52, 53], ancrage sur une surface d’une extr´emit´e des mol´ecules puis

´etirement dans un champ ´electrique [54, 55] ou dans un ´ecoulement [2, 56].

L’observation en microscopie de fluorescence de l’interaction de prot´eines avec des mol´ecules d’ADN ´etir´ees par ces diff´erentes m´ethodes n’est pas ais´ee. En ef- fet, les billes coupl´ees aux mol´ecules d’ADN dans les dispositifs de pinces op- tiques/magn´etiques diffusent fortement la lumi`ere, d´egradant le rapport signal

`a bruit de d´etection en ´epifluorescence. Leur taille microm´etrique ne rend pos- sible l’utilisation d’une imagerie en onde ´evanescente qu’au prix d’un dispositif exp´erimental complexe [11]. La pr´eparation de surfaces permettant l’utilisation de techniques ´electrophor´etiques est longue et d´elicate, et les champs ´electriques

´elev´es utilis´es (sup´erieurs `a 10⁶ V/m dans [54]) peuvent avoir un effet perturba- teur. Enfin, l’interaction des prot´eines avec l’ADN est fortement modifi´ee dans un ´ecoulement, en raison de la force hydrodynamique qui s’exerce alors sur les prot´eines.

Le peignage mol´eculaire constitue une autre technique permettant de d´eplier les mol´ecules d’ADN, [57, 58]. Cette technique permet d’´etirer parall`element un grand nombre de mol´ecules d’ADN sur une surface. Le peignage est une tech- nique simple `a mettre en œuvre puisqu’il ne requiert que l’utilisation de surfaces hydrophobes et ne n´ecessite aucune modification chimique des mol´ecules d’ADN.

Nous avons fait usage `a plusieurs reprises de cette technique, notamment pour ac- crocher des nanocristaux aux extr´emit´es de mol´ecules d’ADN peign´ees (cf partie 2.3). N´eanmoins, le sur´etirement des mol´ecules d’ADN et leurs nombreux points d’ancrage `a la surface limitent l’utilisation du peignage pour observer l’interac- tion ADN-prot´eines. C’est pourquoi nous avons d´evelopp´e une nouvelle technique, baptis´ee ”´etirement”, qui repose sur un principe voisin mais ne souffre pas de ces inconv´enients. Cette partie d´ecrit bri`evement le dispositif exp´erimental utilis´e pour observer les mol´ecules d’ADN en fluorescence, puis les techniques de pei- gnage et d’´etirement. L’analyse d´etaill´ee de la conformation ´etir´ee des mol´ecules fera l’objet de la partie suivante.

2.1.1 Observation de mol´ ecules d’ADN individuelles en