3.3 R´esultats
3.3.1 Dur´ees d’interaction des NC-EcoRV avec l’ADN
tels spots sont parfois observables lorsqu’ils diffusent au voisinage de la surface.
NC-EcoRV sur l’ADN Lorsqu’un NC-EcoRV est li´e `a l’ADN, il bouge beaucoup moins vite que par diffusion tridimensionnelle. Comme nous le verrons, les coefficients de diffusion associ´es au sliding sont de 3 `a 4 ordres de grandeurs inf´erieurs au coefficient en solution, et les fluctuations transverses d’une mol´ecule de T7 ´etir´ee `a 75% ont une amplitude de quelques dizaines de nanom`etres et un temps de corr´elation de l’ordre du temps d’exposition.
Le d´eplacement d’un NC-EcoRV li´e `a l’ADN pendanttexp=20 ms est donc de l’ordre de la dizaine de nanom`etres. Ce d´eplacement ´elargit donc l´eg`erement le spot associ´e sur chaque image. La r´esolution spatiale associ´ee `a la d´etection de ces spots n’est pas sensiblement d´egrad´ee par rapport `a celle mesur´ee dans le cas des spots fixes (10 nm environ).
3.3. R´ESULTATS
diffusion en solution, seuls les spots colocalis´es plus de 50 ms avec les mol´ecules d’ADN ont ´et´e pris en compte.
3.3.1.2 R´esultats
Les distributions obtenues dans chacune des trois conditions salines test´ees sont repr´esent´ees sur la figure 3.11, sur laquelle figurent ´egalement les cumu- latives associ´ees. Ces cumulatives donnent, pour une dur´ee donn´ee, le nombre d’´ev´enements de dur´ees inf´erieures, et ´evitent ainsi le regroupement de valeurs (binning) inh´erent `a la construction d’histogrammes.
- A 50 mM NaCl, la distribution des temps d’interaction est tr`es bien inter- pol´ee par une distribution exponentielle avec un temps τ=0.7 s (83 ´ev´enements analys´es).
- A 75 mM NaCl, la distribution obtenue est tr`es bien interpol´ee par une dis- tribution exponentielle `a condition de ne pas consid´erer les points correspondant
`a des temps d’interaction sup´erieurs `a 2 s (voir la figure 3.11) ; on obtient alors un temps τ=0.4 s (117 ´ev´enements analys´es). En effet, dans cette condition de salinit´e, la condition ´enonc´ee ci-dessus (ne consid´erer que les temps d’interac- tion inf´erieurs `a 10 s) n’est sans doute pas suffisante pour ´eliminer les spots ne correspondant pas `a l’interaction d’un NC-EcoRV uniquevia une seule enzyme.
- A 25 mM NaCl (66 ´ev´enements analys´es), l’interpolation de la distribution obtenue avec une distribution exponentielle donne un temps τ=2.1 s mais est moins satisfaisante. Nous pensons que la principale raison `a cette divergence est qu’aux faibles salinit´es EcoRV a davantage tendance `a s’agr´eger, de sorte qu’une partie importante des NC-EcoRV observ´es au cours de cette exp´erience ne correspondent sans doute pas `a un NC-EcoRV individuel.
Remarque : les temps d’interaction mesur´es sont l´eg`erement affect´es par le clignotement des nanocristaux et le hopping des NC-EcoRV. En effet, le clignote- ment des nanocristaux conduit `a une sous-estimation du temps d’interaction pour les spots qui s’associent ou se dissocient de l’ADN dans un ´etat noir. Par ailleurs, comme nous allons le voir, une partie des NC-EcoRV analys´es se r´eassocient `a l’ADN apr`es leur dissociation. L’amplitude de tels sauts est parfois trop faible pour permettre leur d´etection. Ceci conduit donc `a consid´erer parfois comme un unique ´ev´enement d’interaction une succession de plusieurs ´ev´enements d’asso- ciation/dissociation. Cela conduit `a une surestimation des temps d’interaction mesur´es sur de telles trajectoires.
3.3.1.3 Discussion
a) Distribution et ordre de grandeur des temps d’interaction
La mod´elisation la plus simple pour rendre compte de la cin´etique d’associa- tion/dissociation d’EcoRV `a un fragment d’ADN non sp´ecifique est un mod`ele `a deux ´etats :
E+ADN ⇋E−ADN. (3.2)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0
10 20 30 40 50
Nombre d'occurrences
temps d'interaction (s) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0
10 20 30 40 50
Nombre d'occurrences
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0
5 10 15 20 25 30 35
(a) 25 mM NaCl
τ=2.1 s
Nombre d'occurrences
temps d'interaction (s) temps d'interaction (s)
τ=0.7 s
τ=0.4 s
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0
10 20 30 40 50 60 70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0
20 40 60 80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0
20 40 60 80 100 120
0.0 1.0 2.0
0 40 80 120
Nombre d'occurrencesNombre d'occurrencesNombre d'occurrences
temps d'interaction (s)
temps d'interaction (s)
temps d'interaction (s) (b) 50 mM NaCl
(c) 75 mM NaCl
τ=2.2 s
τ=0.8 s
τ=0.6 s
τ=0.4 s
Fig. 3.11 – Histogrammes et cumulatives des temps d’interaction NC- EcoRV/ADN `a (a) 25 mM NaCl, (b) 50 mM NaCl et (c) 75 mM NaCl. Dans chaque cas, une interpolation correspondant `a une distribution exponentielle des temps d’interaction est pr´esent´ee, ainsi que le temps r´esultant. La courbe en- cadr´ee pour la distribution cumulative `a 75 mM correspond `a une analyse limit´ee arbitrairement aux ´ev´enements d’interaction dont la dur´ee est inf´erieure `a 2 s.
L’association est caract´eris´ee par une constante ka (en M−1.s−1) telle que d[E− ADN]/dt = ka[E][ADN], et la dissociation est caract´eris´ee par la constante kd
3.3. R´ESULTATS
telle que d[E −ADN]/dt =−kd[E −ADN] Ce mod`ele pr´evoit donc une distri- bution exponentielle des temps d’interaction avec l’ADN non sp´ecifique, avec un temps caract´eristique de 1/kd. Les distributions exp´erimentales, bien interpol´ees par des exponentielles, sont donc en accord avec ce mod`ele.
En raison de leur difficult´e, peu d’´etudes biochimiques ont ´et´e consacr´ees
`a la dissociation d’enzymes de restriction de fragments d’ADN non sp´ecifique.
Certains groupes sont cependant parvenus `a estimer, de mani`ere peu pr´ecise, la valeur de kd dans diff´erentes conditions.
– Erskine et al. ont ´etudi´e la cin´etique de dissociation d’EcoRV `a l’aide d’une m´ethode de blocage rapide par flux (”Quench-Flow”) [98]. Ils ont obtenu la valeur kd=1.2 s−1 pour la dissociation d’EcoRV d’un plasmide de 3658 pb auquel elle ´etait li´ee non sp´ecifiquement, en pr´esence de 100 mM NaCl et 10 mM Mg2+.
– En utilisant une m´ethode voisine baptis´ee ”stopped-flow fluorescence”, Alves et al. ont mesur´e une borne sup´erieure kd=14 s−1 pour la dissociation d’EcoRI d’un oligonucl´eotide non sp´ecifique de 13 pb, en pr´esence de 50 mM NaCl et 10 mM Mg2+ [99].
Ces ´etudes fournissent une id´ee de l’ordre de grandeur attendu pour les temps de d’interaction EcoRV-ADN. Cependant, les conditions de ces exp´eriences dif- f`erent de nos propres exp´eriences, effectu´ees avec des enzymes EcoRV coupl´ees `a des nanocristaux, en l’absence de Mg2+ et `a des concentrations de 25 `a 75 mM de NaCl. De plus, la dissociation d’une mol´ecule ´etir´ee est vraisemblablement plus rapide que celle estim´ee pour un plasmide en solution, car le temps mesur´e dans ce dernier cas mesure la dissociation du domaine d’ADN et peut cumuler plusieurs ´ev´enements d’association/dissociation, et d’autre part les enzymes n’in- teragissent pas de mani`ere identique avec des oligonucl´eotides ou avec des ADN plasmidiques (contrairement aux oligonucl´eotides, les plasmides sont entour´es par une atmosph`ere de contre-ions ; le lecteur d´esireux de pr´ecisions suppl´ementaires pourra se reporter `a la r´ef´erence [98]).
b) Effet de NaCl
Nos r´esultats exp´erimentaux (figure 3.12) montrent que la dur´ee de l’interaction des NC-EcoRV avec l’ADN diminue lorsque la concentration en NaCl augmente.
Ce r´esultat ´etait attendu : la pr´esence de sel r´eduit la port´ee des interactions
´electrostatiques entre EcoRV et l’ADN et diminue donc leur affinit´e.
c) Implication biologique
Nos exp´eriences ont montr´e qu’un NC-EcoRV restait li´e `a l’ADN pendant envi- ron 1 s avant de s’en dissocier. En supposant que l’ordre de grandeur de la dur´ee d’interaction d’une enzyme EcoRV non coupl´ee avec l’ADN est du mˆeme ordre de grandeur, et que pendant cette dur´ee l’enzyme ne diffuse pas le long de l’ADN, le temps moyen mis par une enzyme pour localiser sa s´equence-cible sur un ADN de plusieurs milliers de bases serait donc de l’ordre de l’heure, en supposant que l’enzyme se r´eassocie rapidement `a l’ADN apr`es chaque dissociation. Cette dur´ee
0 25 50 75 0
1 2
temps d'interaction (s)
[NaCl] (mM)
Fig. 3.12 – Temps moyens d’interaction mesur´es dans les 3 conditions test´ees (25, 50 et 75 mM NaCl).
est tr`es sup´erieure `a celle que que l’on obtiendrait par une diffusion 3D pure, sans interaction avec l’ADN non sp´ecifique. Elle est de plus incompatible avec la constante d’association d’EcoRV `a sa s´equence-cible sur un plasmide d’environ 4 kb, ka≃108 M−1.s−1, mesur´ee par Erskine et al. `a partir d’´etudes cin´etiques [98].
En effet, comme d[E−ADN]/dt=ka[E][ADN], cette valeur implique qu’en pr´esence de 10 nM de cibles, le temps n´ecessaire `a une enzyme pour localiser sa s´equence-cible est de l’ordre de 1 s. Les longues dur´ees d’interaction NC- EcoRV/ADN mesur´ees constituent donc un premier indice, sugg´erant l’existence d’un mouvement d’EcoRV sur l’ADN pendant la dur´ee de l’interaction, de mani`ere
`a explorer plus d’une paire de bases. La partie suivante de ce chapitre montre com- ment l’analyse des trajectoires des NC-EcoRV au cours de leur interaction avec les mol´ecules d’ADN permet de prouver directement l’existence d’un mouvement des NC-EcoRV le long de l’ADN.