Mise en ´evidence exp´erimentale du sliding

Fig. 1.16 – Structure du complexe non sp´ecifique BamHI-ADN (l’ADN est repr´esent´e en bas sur ce sch´ema), obtenue apr`es cristallisation. La mani`ere dont l’enzyme entoure l’ADN est compatible avec sa diffusion le long de la mol´ecule d’ADN.

La structure de quelques complexes non sp´ecifiques prot´eine-ADN a pu ˆetre obtenue par cristallisation. Viadu et Aggarwal ont ainsi cristallis´e en 2000 l’en- zyme BamHI li´ee `a un fragment d’ADN non sp´ecifique. Selon ces auteurs, la configuration de l’enzyme dans ce complexe, interm´ediaire entre sa configura- tion libre et celle qu’elle adopte sur sa s´equence-cible, ne permet pas le clivage de l’ADN, mais sugg`ere la possibilit´e d’un sliding de BamHI le long de l’ADN (figure 1.16) [42]. Cet argument semble aussi valable pour EcoRV, dont la struc- ture est pr´esent´ee au d´ebut du dernier chapitre de ce m´emoire. Ces sp´eculations g´eom´etriques ont ´et´e compl´et´ees par des exp´eriences qui ont montr´e l’implication du sliding in vitro.

1.2.4.1 Action sur des mol´ecules d’ADN contenant deux s´equences- cibles proches d’une extr´emit´e

cible 1

cible 2

Fig. 1.17 – Action d’une enzyme sur une mol´ecule d’ADN contenant deux s´equences-cibles proches d’une extr´emit´e.

Ces exp´eriences consistent `a synth´etiser des mol´ecules d’ADN contenant deux s´equences-cibles proches d’une extr´emit´e (figure 1.17), et `a comparer la vitesse de clivage de ces deux cibles. Le groupe d’A. Pingoud a ainsi analys´e en 1994 l’action d’EcoRI sur des mol´ecules d’ADN de 900 pb avec deux sites `a 5 et 13 pb d’une mˆeme extr´emit´e [43], puis en 1998 celle d’EcoRV sur des substrats similaires [39].

Dans les deux cas, une coupure pr´ef´erentielle de la s´equence-cible ”int´erieure”

est observ´ee. Ce r´esultat est interpr´et´e par l’existence de sliding. En effet, les processus de hopping n’ont aucune raison de favoriser fortement une des cibles par rapport `a l’autre, alors que le sliding induit en revanche une nette pr´ef´erence pour la cible ”int´erieure”. En effet, une enzyme s’´etant associ´ee au centre de la mol´ecule d’ADN atteindra d’abord la cible ”int´erieure” par sliding. Apr`es son clivage, elle n’atteindra pas n´ecessairement la seconde s´equence-cible : elle peut se dissocier de la mol´ecule d’ADN apr`es le clivage de la premi`ere cible, ou rester sur le fragment qui ne contient pas la seconde s´equence-cible.

1.2.4.2 Influence de la pr´esence d’obstacles le long de l’ADN

cible obstacle

Fig. 1.18 – Action d’une enzyme sur une mol´ecule d’ADN contenant une s´equence-cible en pr´esence d’un obstacle.

En 1994, l’´equipe d’A. Pingoud a ´egalement analys´e l’action d’EcoRI sur des mol´ecules d’ADN contenant une s´equence-cible proche d’une extr´emit´e de la mol´ecule, et une triple h´elice `a son voisinage (figure 1.18) [43]. Ces exp´eriences indiquent que la pr´esence d’une triple h´elice r´eduit fortement l’efficacit´e de la

1.2. ENZYMES DE RESTRICTION DE TYPE II

localisation des s´equences-cibles. La modification r´ealis´ee n’aa prioriaucun effet sur les m´ecanismes 3D (hopping). On con¸coit en revanche que les triples h´elices constituent un obstacle pour la diffusion unidimensionnelle le long des mol´ecules d’ADN. Les r´esultats observ´es peuvent donc ˆetre interpr´et´es par la r´eduction du sliding sur l’ADN.

1.2.4.3 Utilisation d’une enzyme li´ee `a l’ADN de mani`ere covalente

Fig.1.19 – Repr´esentation sch´ematique de l’exp´erience men´ee par Schulze et al..

Les bras de l’enzyme EcoRV ont ´et´e li´es de mani`ere covalente autour de l’ADN.

En 1998, Schulze et al. ont r´eussi `a produire un mutant d’EcoRV dont les bras sont li´es de mani`ere covalente autour d’une mol´ecule d’ADN contenant une s´equence-cible (figure 1.19). Cette liaison ´elimine toute possibilit´e de d´eplacement tridimensionnel [44]. Le fait que ces enzymes soient malgr´e tout capables de loca- liser et de cliver leur s´equence-cible d´emontre la possibilit´e pour une enzyme de localiser sa cible par sliding uniquement, sans toutefois prouver que ce processus seul r´esume la dynamique des enzymes sauvages.

1.2.4.4 Pertinence de ces ´etudes pour l’interaction ADN-prot´eines in vivo

In vivo, l’ADN cellulaire est recouvert de nombreuses prot´eines [45], qui consti- tuent des obstacles `a la diffusion 1D le long du grand sillon de l’ADN. Le sliding, s’il consiste en une diffusion le long du grand sillon de l’ADN, ne peut donc avoir lieu in vivo que sur des longueurs inf´erieures `a celles s´eparant ces obstacles. Il est cependant raisonnable de penser que l’ADN des bact´eriophages est exempt de prot´eines juste apr`es son injection dans les bact´eries, de sorte que le sliding pourrait ˆetre utilis´e in vivo par les enzymes de restriction sur l’ADN des ba- ct´eriophages exactement comme in vitro. [43, 46]. De plus, une ´etude r´ecente de M. Kampmann [35] montre que le sliding pourrait avoir lieu `a deux dimensions sur toute la surface des mol´ecules d’ADN plutˆot que dans leur grand sillon ; en effet, cet auteur a montr´e que des obstacles ins´er´es dans le grand sillon qui n’en- cerclent pas enti`erement le double-brin d’ADN peuvent ˆetre d´epass´es par sliding.

Notons que ceci n’est pas le cas pour les triples h´elices utilis´ees comme obstacles

par l’´equipe d’A. Pingoud (voir plus haut), peut-ˆetre parce que ces obstacles en- cerclent compl`etement l’ADN et empˆechent mˆeme la diffusion 2D `a la surface des mol´ecules d’ADN.