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La protéine LFY FL a été analysée à deux reprises par cette technique. Lors du premier essai, nous avons dosé quatre éléments, à savoir le fer, le zinc, le magnésium et le cuivre. L’absence de fer et cuivre a pu être affirmée dès ce premier essai. En revanche, la détection de zinc et de magnésium à un ratio proche de 1 atome/protéine a nécessité une deuxième analyse. Cette dernière confirmera que les éléments zinc et magnésium sont présents en une concentration inférieure à un ratio 1/1 par rapport à celle de LFY, réfutant également l’hypothèse de la coordination de zinc et de magnésium par LFY.
2-microPIXE
L’analyse des éléments d’une protéine par technique de microPIXE repose sur l’étude de l’émission rayons X de particules induites par un microfaisceau de protons, émission caractéristique de chaque élément (Garman and Grime, 2005). Elle présente un avantage certain par rapport à l’ICP-MS, à savoir que le dosage des atomes de souffre présents dans les méthionines et les cystéines de la protéine apporte une calibration interne de la quantité de protéines présente. Nous avons donc demandé à Elspeth Garman d’analyser un échantillon de LFY-C et à son tour, elle nous a confirmé que LFY-C ne contenait pas d’ion métallique (moins de 0,1 atome lourd par molécule de LFY).
Il semble donc finalement exclu que LFY coordonne un ou des ion(s) métalliques.
91 réaliser une expérience de SPR dans les mêmes conditions qu’en AF ou EMSA, c’est à dire avec un oligonucléotide de 30pb. Mais il se pourrait aussi que cet écart vienne d’une différence de comportement de LFY sur l’oligonucléotide ou le promoteur AP1. En effet, nous y reviendrons dans le chapitre III, mais il se pourrait que LFY ait d’autres sites de liaisons au niveau du promoteur d’AP1.
2-Mise en évidence d’une coopérativité LFY-C/LFY-C sur l’ADN
LFY-C seule en solution est majoritairement monomérique. En revanche, en présence d’ADN, deux complexes au ratio LFY-C/ADN différent sont observés. Le plus petit complexe (C1) contient une protéine LFY-C, tandis que le complexe le plus important (C2) en contient deux. Le fait que le complexe majoritaire soit systématiquement ce complexe C2, indépendamment de la concentration en LFY-C, est le résultat d’un mécanisme de coopérativité.
Nous avons vu que cette coopérativité est dépendante de l’ADN: elle est davantage affectée par la mutation AP1m1 qu’AP1m2, ce qui suggère que chaque monomère contacterait un demi- palindrome avec une affinité différente.
Les protéines produites à partir du vecteur pCH43 (résidus 224-391; Fig.23) semblent avoir une coopérativité comparable à celle des protéines produites à partir de pCH28 où le complexe C2 est toujours majoritaire devant le complexe C1 indépendamment de la concentration protéique. Ces données suggèrent donc que la queue hydrophobe non conservée à l’extrémité C-terminale de LFY n’interviendrait pas dans ce mécanisme.
En revanche, même si les protéines produites à partir du vecteur pCH42 (résidus 241-421;
Fig.23) sont toujours capables de lier l’ADN sous la forme des complexes C1 et C2, elles semblent avoir une coopérativité affectée: la bande retardée correspondante au complexe C1 est d’intensité comparable à celle du complexe C2 (EMSA à 1000, 2000 et 3000nM de protéines; Fig.23). Cette observation pourrait suggérait que la région 230-241 comporte des résidus impliqués dans cette coopérativité, ou dans le bon repliement de la protéine.
Il est important de signaler que ces résultats ne permettent pas de définir quel est le mécanisme moléculaire à la base de cette coopérativité de liaison. En effet, rien ne permet jusqu’à présent d’affirmer s’il résulte d’un changement de conformation de l’ADN suite à la liaison du premier monomère, ou à une dimérisation de LFY. Peut-on vraiment parler ici de dimérisation ? Rien ne permet d’affirmer jusqu’ici que les deux monomères de LFY interagissent physiquement. Seule l’étude structurale du complexe LFY-C/ADN permettra de répondre à cette question.
3-Une hypothèse rejetée: le domaine C-terminal de LFY ne coordonne pas d’ions métalliques
L’alignement de séquence entre orthologues de LFY chez différentes espèces végétales révèle l’intrigante conservation de résidus cystéines et histidines qui nous a porté à croire que le domaine C- terminal de LFY pourrait coordonner un ou des ion(s) métallique(s). Cette hypothèse a été renforcée
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par une série de résultats préliminaires basés sur l’étude de l’effet de chélateurs de métaux sur la capacité de LFY à lier l’ADN. Pourtant, deux expériences indépendantes de dosage de métaux réfutent définitivement cette hypothèse.
b) Ce à quoi l’approche biochimique ne permet pas de répondre
Même si nos résultats délimitent un domaine minimal de liaison à l’ADN, ils ne nous permettent pas de définir comment est organisé le DBD: combien de résidus de LFY-C sont impliqués dans cette reconnaissance ? Où sont-ils localisés? Existe-t-il une région monofonctionnelle de liaison à l’ADN, ou ces résidus sont-ils dispersés tout au long du domaine minimal ?
Nous savons désormais que deux unités de LFY peuvent se lier simultanément à l’ADN. Mais comment chaque monomère se positionne-t-il l’un par rapport à l’autre sur ce brin d’ADN?
Interagissent-ils physiquement l’un avec l’autre? Cette question revient à identifier quel mécanisme moléculaire est à l’origine de cette coopérativité: est-ce le résultat d’une modification conformationnelle de l’ADN induite par C1, ou est ce le résultat d’une véritable dimérisation de LFY ? Seule l’étude structurale du complexe LFY-C/ADN permettra de répondre à ces questions.
c) Réflexions sur nos résultats 1-Les outils méthodologiques:
L’AF présente différents avantages: extrêmement facile à mettre en œuvre, elle permet de détecter des interactions en solution ce qui limite toute perturbation des équilibres réactionnels. Elle délivre les résultats en temps réel, ce qui donne potentiellement accès à toutes les constantes cinétiques. Dans le cas présent, nous n’avons pas étudié les constantes cinétiques d’association et de dissociation mais les mesures d’AF de LFY-C/AP1, réalisées sans temps d’incubation, suggèrent une cinétique d’association rapide et/ou de dissociation lente. Toutefois, malgré leurs avantages, les mesures en solution présentent également un inconvénient incontestable: elles ne permettent pas d’avoir accès aux différentes espèces en présence. Dans le cas d’une courbe de saturation typique de LFY-C en présence d’AP1, il n’est pas possible de distinguer le complexe C1 du complexe C2: l’AF donne une vision globale de la réaction, et permet donc d’estimer une affinité apparente résultante de l’affinité du complexe C1 et du complexe C2 pour l’ADN.
L’EMSA au contraire permet de visualiser trois des quatre espèces présentes dans la réaction de liaison de LFY-C à l’ADN, à savoir l’ADN libre, le complexe C1 et le complexe C2. Seul manque protéine libre dont nous pourrions cependant suivre la présence si nécessaire à l’aide d’un marqueur fluorescent. Ici l’inconvénient est l’utilisation d’un support, le gel d’acrylamide, et la nécessité de laisser migrer les espèces en présence sur un temps non négligeable (1h minimum), deux paramètres qui peuvent influencer les équilibres réactionnels.
93 Pouvoir travailler en AF et EMSA permet donc de s’affranchir des inconvénients inhérents à chacune de ces deux techniques, et constitue un outil indispensable à la caractérisation de liaison de facteurs de transcription à leur ADN cible.
La technique de SPR, simple, rapide et quantitative, offre quant à elle d’intéressantes perspectives pour l’identification de nouvelles cibles directes d’ADN de facteurs de transcription. En testant la capacité de liaison entre facteur de transcription et régions cis-régulatrices entières d’un gène donné, cette technique permet de travailler ‘à l’aveugle’ sans avoir idée de la séquence consensus de fixation du facteur de transcription.
2-Les limites rencontrées
La première série de résultats visant à identifier la nature des complexes C1 et C2 soulève la difficulté résidente dans la détermination du poids moléculaire d’un complexe en conditions non dénaturantes. Ces difficultés s’expliquent probablement dans le fait que les techniques utilisées ici ne sont pas uniquement fonction de la masse de la molécule considérée, mais également de sa conformation et/ou de sa charge. De plus, elles sollicitent une matrice qui pourrait ne pas être neutre sur les propriétés du complexe. Les stratégies de MALLS-SEC, de GEMSA et d’EMSA en présence de deux protéines de taille différente représentent une alternative efficace pour contourner ces difficultés.
Comment expliquer les effets de la phénantroline et de l’EDTA sur la liaison de LFY-C à l’ADN ? Nous avons déjà mentionné que ces chélateurs ont été utilisés à très forte concentration. Ainsi, il serait possible qu’ils viennent perturber la conformation de la protéine ou de l’ADN par la chélation indirecte d’ions du milieu environnant, ions tels le magnésium connus pour intervenir dans l’organisation du double brin d’ADN (Sines et al., 2000). Dans le cas de l’expérience de dénaturation/renaturation de LFY, le fait que la phénantroline agisse à des concentrations plus faibles pourrait s’expliquer par une fragilité de la protéine conséquente au traitement à la chaleur, fragilité qui la rend plus sensible à l’effet indirect de ce chélateur. Il aurait pu être bénéfique d’utiliser en complément des contrôles de liaison avec d’autres facteurs de transcription ne coordonnant pas d’ions métalliques.
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95 II. Etude structurale du domaine conservé C-terminal de LFY
L’analyse de LFY-C par approche biochimique classique a permis d’améliorer notre compréhension de son mode de liaison à l’ADN. Toutefois, cette approche ne permet pas d’identifier les résidus clés impliqués de ce processus, qu’il s’agisse des résidus nécessaires au contact à l’ADN et à l’éventuelle dimérisation de LFY-C. C’est pourquoi nous avons entrepris une étude structurale du complexe LFY-C/ADN.
La première étape critique à la réalisation d’une étude cristallographique est la production de la protéine d’intérêt en forte concentration. Dans cette optique, j’ai consacré une large partie de ma première année de thèse à essayer de produire la protéine LFY FL, mais les quantités obtenues se sont révélées toujours insuffisantes et n’ont permis d’aborder qu’une caractérisation biochimique de cette protéine, nous y reviendrons dans le chapitre III. Contrairement à la protéine LFY FL, la protéine LFY-C est très bien exprimée sans nécessité d’apporter une étiquette de solubilisation, se purifie selon un protocole simple et extrêmement reproductible, supporte le clivage de son étiquette 6his, et supporte d’être concentrée à un degré permettant la cristallogenèse.