En analysant l’alignement des séquences des différents orthologues de LFY, plusieurs cystéines et histidines sont conservées dans le domaine conservé C-terminal: cinq histidines et six cystéines sont présentes du LFY de Mousse Physcomitrella patens au LFY d’A. thaliana (Fig.29A). Or
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ces résidus sont connus dans certains cas pour assurer la coordination d’ions métalliques tels le cobalt, le cuivre, le nickel, le fer, le magnésium ou encore le zinc, et de très nombreux facteurs de transcription coordonnent un ou plusieurs atomes de zinc comme démontré récemment pour les facteurs de transcription SBP par exemple (Fig.29B; Yamasaki et al., 2004). Nous avons donc souhaité étudier si tel était le cas pour le domaine C-terminal de LFY.
Les expériences développées ici nécessitent peu de protéine. Ainsi, sachant que le but ultime de notre projet est d’étudier la protéine LFY FL (LFY FL, Full Length), les expériences ont été menées en parallèle sur LFY-C, portion de la protéine qui contient les histidines et cystéines conservés, et sur LFY FL dont la prodution sera décrite dans le chapitre III.
b) Résultats préliminaires par EMSA et AF
Pour étudier si une protéine coordonne un ou des ion(s)s métallique(s), une stratégie classique consiste à étudier sa fonctionnalité suite à un traitement par un chélateur d’ions métalliques. Il existe de nombreux chélateurs dont le spectre d’action peut considérablement varier, certains étant spécifiques d’un ion métallique en particulier, d’autres pouvant chélater plusieurs ions. Etant donné que nous n’avons aucune idée de la nature du métal qui pourrait être coordonné par LFY, nous avons eu recours à un chélateur à large spectre d’action, l’EDTA. En parallèle, vu le grand nombre de facteurs de
87 transcription coordonnant du zinc (Jacobs, 1992), nous avons ciblé un chélateur fort, spécifique du zinc, à savoir la 1,10-phénantroline.
1-Conséquences d’un traitement simple EDTA ou phénantroline
L’effet d’un traitement EDTA ou phénantroline semble affecter l’affinité aussi bien de LFY FL que de LFY-C pour l’ADN, ce qui se traduit par une baisse d’AF ou une diminution d’intensité de la bande retardée en EMSA (Fig.30). Remarquons néanmoins que LFY-C semble plus sensible que LFY FL. Les résultats obtenus jusqu’ici, bien qu’encourageants, sont difficilement exploitables à eux seuls car ils sont réalisés en très large excès de chélateur par rapport à la protéine, excès qui pourrait être
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rendu nécessaire en partie par une différence d’affinité entre ces chélateurs et LFY pour le métal, ou par une inaccessibilité de l’ion métallique lorsqu’il est associé à LFY.
2-Dénaturation à la chaleur et traitement phénantroline
De nombreuses protéines coordinatrices d’ions métalliques renferment ces ions en plein cœur de leur structure tridimensionnelle, les rendant difficilement accessible à tout chélateur extérieur (Nielsen et al., 2003; Whittaker et al., 2006). Pour tester si tel était le cas pour LFY, nous avons étudié si un cycle de dénaturation de LFY en présence du chélateur suivi d’une renaturation augmentait l’effet du chélateur. Mentionnons que nous nous sommes seulement intéressés ici à l’effet de la phénantroline dont le suivi en EMSA est plus aisé que celui de l’EDTA (l’EDTA perturbant visiblement la migration de l’ADN).
Pour dénaturer LFY, nous lui infligeons un traitement de 2min à 95°C suivi d’un retour immédiat à 4°C. Une grande partie de cette protéine dénaturée semble mal se replier, nécessitant de réaliser l’expérience avec une concentration 10 fois plus élevée en protéines (Fig.31). Mais de façon intéressante, la part qui parvient tout de même à se renaturer semble plus sensible à la phénantroline:
alors qu’il était nécessaire de traiter les protéines à 20mM pour pouvoir voir un effet significatif chez les protéines non dénaturées, une concentration de 5mM suffit ici.
Nous nous sommes ensuite intéressés à la capacité d’ions métalliques à restaurer la perte de liaison résultant du traitement phénantroline. Le principe de cette expérience est de tester quels ions métalliques permettent de renaturer LFY après un traitement phénantroline, et donc de connaître la nature des ions coordonnés par LFY. Plusieurs ions ont été testés à ces fins: le zinc, le nickel, le manganèse, le chlore, le cuivre et le fer. De ces différents ions un seul à entraîné un effet visible sur la capacité de LFY à lier l’ADN, le zinc (Fig.32). LFY semble donc coordonner un ou des ion(s) zinc.
89 3-Bilan des résultats préliminaires
Ces résultats suggèrent que LFY pourrait coordonner un ou des ion(s) métallique(s), ion(s) zinc vraisemblablement.
Je n’ai pas abordé tout au long de ce premier descriptif la grande difficulté de reproductibilité que j’ai rencontré tout au long de ces manipulations, difficulté particulièrement prononcée dans le cas de l’expérience de dénaturation/renaturation. Il est donc devenu nécessaire de faire appel à d’autres méthodologies plus sensibles pour tester si LFY est effectivement un coordinateur de métaux, et si tel est le cas, pour déterminer le ratio protéine/ion(s) métallique(s).
c) Analyses fines par dosage des métaux
Pour cela, nous avons eu recours à deux techniques indépendantes de dosage d’ions métalliques présents en trace à partir d’une préparation de LFY en solution. L’ICP-MS a été réalisée en collaboration avec Corinne Rivasseau, chercheur au sein de notre laboratoire, tandis que le microPIXE est le fruit d’une collaboration avec Elspeth Garman (Université d’Oxford, Royaume-Uni).
1-ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry)
L’ICP-MS est une technique de spectrométrie de masse couplée à un plasma inductif. Cette technique d’analyse repose sur la séparation, l’identification et la quantification des éléments constitutifs d’un échantillon en fonction de leur masse. Elle est basée sur le couplage d'une torche à plasma générant des ions à partir de l’échantillon et d’un spectromètre de masse (Thermoelectron X7 dans le cas de l'ICP-MS) qui sépare ces ions en fonction de leur masse. Pour cela, cette technique nécessite une étape préalable de minéralisation de l’échantillon à partir d’un mélange d’acide nitrique et d’acide chlorhydrique chauffé à 200°C.
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La protéine LFY FL a été analysée à deux reprises par cette technique. Lors du premier essai, nous avons dosé quatre éléments, à savoir le fer, le zinc, le magnésium et le cuivre. L’absence de fer et cuivre a pu être affirmée dès ce premier essai. En revanche, la détection de zinc et de magnésium à un ratio proche de 1 atome/protéine a nécessité une deuxième analyse. Cette dernière confirmera que les éléments zinc et magnésium sont présents en une concentration inférieure à un ratio 1/1 par rapport à celle de LFY, réfutant également l’hypothèse de la coordination de zinc et de magnésium par LFY.
2-microPIXE
L’analyse des éléments d’une protéine par technique de microPIXE repose sur l’étude de l’émission rayons X de particules induites par un microfaisceau de protons, émission caractéristique de chaque élément (Garman and Grime, 2005). Elle présente un avantage certain par rapport à l’ICP-MS, à savoir que le dosage des atomes de souffre présents dans les méthionines et les cystéines de la protéine apporte une calibration interne de la quantité de protéines présente. Nous avons donc demandé à Elspeth Garman d’analyser un échantillon de LFY-C et à son tour, elle nous a confirmé que LFY-C ne contenait pas d’ion métallique (moins de 0,1 atome lourd par molécule de LFY).
Il semble donc finalement exclu que LFY coordonne un ou des ion(s) métalliques.