Influence du milieu d’ajustement osmotique pour le biotest bactérien

L’inhibition de la luminescence de la bactérie marine Vibrio fischeri est utilisée depuis de nombreuses années pour la mesure de la toxicité des composés chimiques et de diverses matrices environnementales (Blaise et al., 1994). Cependant, l'utilisation de chlorure de sodium nécessaire pour l'ajustement osmotique des échantillons pose des problèmes conceptuels quant à la validité des résultats pour des échantillons d'eau douce. Ce point a déjà été relevé dans la littérature (Carlson-Ekvall and Morrison, 1995a), et d'autres sels ont été testés à la place du NaCl. D'autre part, des molécules comme le sucrose, n'ayant pas a priori d'effet sur la spéciation, ont été proposé comme alternative (Ankley et al., 1990 ; Villaescusa et al., 1997). Cependant, il n'a pas été démontré que l'augmentation de la sensibilité du biotest pour les métaux grâce à l'utilisation d'ajustements osmotiques alternatifs était due uniquement à des changements de spéciation ou aussi à des effets sur le métabolisme des bactéries.

L'objectif est ici de tester les alternatives au chlorure de sodium dans le test d'inhibition de la bioluminescence de Vibrio fischeri par les métaux en relation avec la concentration en ion libre calculée.

L’influence du sel d’ajustement osmotique sur la toxicité du cuivre, du zinc, du cadmium et du plomb a été testé pour trois solutions : NaCl 20 g/L, NaNO3 30.2 g/L ou Sucrose 206 g/L dans l’eau ultrapure, ajusté à pH=5.5 et à l’équilibre avec l’atmosphère. L’inhibition de la luminescence à 5, 15, 30 et 45 min a été mesurée par essai en microplaque et les CE50

moyennes calculées à partir de 6 réplicats. Les résultats, présentés en figure 17, sont exprimés en concentration de métal total et de métal libre (calcul de spéciation chimique à l’équilibre par MINEQL+). Les différences significatives (P<0.05, n=6) sont indiquées par une astérisque.

3.2.1 Toxicité du cuivre

La CE50 du cuivre (exprimée en concentration totale) dans le milieu standard du test (NaCl) est significativement supérieure aux CE50 dans les deux milieux alternatifs, et la CE50 dans le NaNO3 est supérieure à celle dans le sucrose, quel que soit le temps. Cependant, les différences de toxicité entre les trois milieux ont tendance à s’amenuiser avec le temps (la différence entre NaNO3 et sucrose à 45 min n’est plus significative). Exprimées en concentrations en ion libre, les CE50 à 30 min et 45 min ne sont pas significativement différentes quel que soit le milieu considéré, ce qui est en accord avec le modèle d'activité de l'ion libre (FIAM). Cependant, à 5 et 15 min, les différences sont significatives entre les trois milieux, même si l'on exprime les CE50 en concentrations en ion libre. Ces différences de cinétique pourraient être dues à l'interaction des ions du milieu sur la membrane bactérienne.

0 1500 3000

5 min 15 min 30 min 45 min

0 100 200 300 400 1500 3000

NaCl NaNO3 Sucrose NaCl NaNO3 Sucrose NaCl NaNO3 Sucrose NaCl NaNO3 Sucrose

CE50 (µg/L)

Cuivre

0 100 200 300 400 500 2000 4000 6000 8000

5 min 15 min 30 min 45 min

0 100 200 300 400 500 2000 4000 6000 8000

NaCl NaNO3 Sucrose NaCl NaNO3 Sucrose NaCl NaNO3 Sucrose NaCl NaNO3 Sucrose

CE50 (µg/L)

Zinc

+ CE50 exprimée en concentration de métal total

CE50 exprimée en concentration de métal libre (calculé par MINEQL+)

*

[*]

* [*]

* [*]

* *

*

* * *

[**] différent du NaCl différent du NaCl et du NaNO₃

Figure 18 : Toxicité des métaux (CE50 avec intervalle de confiance, n = 6, P = 0.05) pour la bactérie Vibrio fischeri dans trois milieux d’ajustement osmotique.

10 100 1000 10000 100000

5 min 15 min 30 min 45 min

10 100 1000 10000 100000

NaCl NaNO3 Sucrose NaCl NaNO3 Sucrose NaCl NaNO3 Sucrose NaCl NaNO3 Sucrose

CE50 (µg/L)

Cadmium

5 min 15 min 30 min 45 min

NaCl NaNO3 Sucrose NaCl NaNO3 Sucrose NaCl NaNO3 Sucrose NaCl NaNO3 Sucrose

CE50 (µg/L)

nd

Plomb

0 50 100 150 200 300 400 500 600

*

[*] [*]

[*]

[*]

*

* *

*

*

*

*

[*]

[*] [*]

[**]

différent du NaCl différent du NaCl et du NaNO₃

+ CE50 exprimée en concentration de métal total

CE50 exprimée en concentration de métal libre (calculé par MINEQL+)

Figure 17 (suite)

En termes de possibilités d'utilisation de cette méthode, la CE50 à 45 min du cuivre se rapproche de concentrations réalistes de milieux contaminés (CE50 45 min = 108±11 µg/L de cuivre total dans le milieu NaCl 20g/L), et est améliorée d'un facteur 2 en utilisant les milieux alternatifs comme le NaNO3 ou le sucrose (CE50 45 min = 57 ± 9 et 40 ± 8 µg/L de cuivre total, respectivement).

3.2.2 Toxicité du zinc

Les résultats concernant la toxicité du zinc sont similaires à ceux du cuivre, avec une sensibilité un peu plus faible. Cependant, on peut noter que les CE50 calculées en concentrations en ion libre dans le milieu NaNO3 sont 2 fois plus élevées que dans les autres milieux, en désaccord avec le FIAM. Deux hypothèses peuvent être avancées :

ƒ une surestimation des concentrations en ion libre par le calcul MINEQL+ : Dans la base de donnée de MINEQL+ utilisée, la complexation du zinc par les nitrates n'est pas prise en compte, par approximation, car l'affinité de ce métal pour les nitrates est plus faible qu'avec les autres métaux testés, comme le plomb (LogK=1.17) et le cadmium (LogK=0.4). Mais compte tenu des fortes concentrations en nitrates présentes dans le milieu, il est possible que cette approximation surestime la concentration en ion libre. D'autre part, nous n'avons pas pris en compte la cinétique de complexation.

ƒ une sensibilité plus faible des bactéries au zinc en présence de nitrates, par un effet sur la membrane ou sur le métabolisme lié à l'indicateur d'effet (la bioluminescence).

3.2.3 Toxicité du cadmium

Pour le cadmium, la situation est la même que pour le zinc, c'est à dire que les concentrations en ion libre calculées par MINEQL+ dans le milieu NaNO3 sont surestimées par rapport aux autres milieux.

On note aussi des CE50 très élevées dans le milieu NaCl, en relation avec la forte affinité du cadmium pour les ions chlorure et de l'utilisation du sel CdCl2. L'utilisation d'un milieu alternatif (sucrose) pour l'étude de la toxicité de ce métal paraît donc très souhaitable.

3.2.4 Toxicité du plomb

La toxicité du plomb dans le milieu NaCl est faible, et augmente peu au cours du temps, contrairement aux autres métaux. L'utilisation de NaNO3 a pour effet de diminuer la sensibilité du test malgré des concentrations en ion libre plus fortes que dans le milieu NaCl (4% d'ion libre dans le milieu NaCl contre 20% dans le milieu NaNO3).

3.2.5 Conclusions

Le calcul par MINEQL+ n'a pas permis de valider la toxicité de l'ion libre dans le milieu NaNO3 pour le zinc et le cadmium. Les constantes de complexation de MINEQL+ seraient à vérifier. D'autre part, l’ion libre ne permet pas toujours d'expliquer l'effet observé. Certains auteurs mentionnent que des complexes inorganiques peuvent être toxiques dans une moindre mesure : CuOH⁺ et Cu(OH)2 par exemple ont une toxicité équivalente à 0.75 et 0.70 fois celle de l’ion libre, respectivement (He et al., 2001). Mais ce n’est pas le cas pour nos résultats car les complexes avec les hydroxydes sont toujours négligeables (<1% du métal total), quel que soit le métal et le milieu considéré. Les complexes présents significativement le milieu NaCl sont MeCl⁺ (44,% 38%, 36% et 56% du Cu, Zn, Cd et Pb total, respectivement) et MeCl2

(8,% 14%, 52% et 30% du Cu, Zn, Cd et Pb total, respectivement). Dans le milieu NaNO3

seul le complexe Me(NO3)⁺ est significativement présent en plus de l’ion libre (47% et 84%

du Cd et du Pb total, respectivement – concentrations <1% pour le Cu et Zn). Enfin, dans le sucrose, aucun des métaux n’est considéré comme étant complexé, et les concentrations en ion libre supérieures à 99%.

Au vu des fortes concentrations de complexes parfois présents, il est probable que les complexes inorganiques des métaux, même s'ils sont peu toxiques, aient un effet non négligeable. C'est pourquoi, même si le sel d'ajustement osmotique est modifié, le test bactérien avec Vibrio fischeri reste peu réaliste pour le test de la toxicité des métaux en eau douce.

Les résultats obtenus n'ont permis de valider que partiellement les effets observés par rapport aux concentrations calculées en ion libre, en particulier pour les autres métaux que le cuivre.

Plusieurs paramètres entrent en compte, dont les approximations de MINEQL+ qui demanderaient à être vérifiées.

Mais plus généralement, le test d'inhibition de la bioluminescence de la bactérie marine reste critiquable pour une utilisation en eau douce, en particulier pour tester l'effet des métaux.

L'utilisation de sucrose pour l'ajustement osmotique du milieu augmente significativement la sensibilité du test pour les métaux étudiés, mais ne permet pas d'atteindre une sensibilité comparable au test algal.