Adição de Ácidos Graxos ao Sêmen

Diversos estudos têm tentado explorar a relação entre sobrevivência espermática e características físico/químicas da membrana plasmática a exemplo da sua composição e fluidez (W+ITE, 1++3). Teorias atuais sobre fusão de membrana sugerem que a fluidez de membrana é um pré-requisito para função normal da célula e que essa característica é principalmente dependente da sua composição lipídica (LENZI et al., 1+++). A fluidez da membrana é modulada pelo nível de colesterol, grau de insaturação da cadeia acil dos fosfolipídios, composição dos fosfolipídios e pelas proteínas de membrana (DARIN-BENNETT & W+ITE, 1+77). As altas proporções de moléculas capazes de difundir-se livremente das membranas observadas em todas as regiões dos espermatozóides vivos do touro, carneiro, cachaço, camundongo e porco da Índia, em conjunto com os rápidos coeficientes de difusão, sugerem que a fase fluida de lipídeos predomina na membrana plasmática destas espécies. Isso corresponde à alta proporção de ácidos graxos poli-insaturados nos fosfolipídios dos espermatozóides que, teoricamente, favoreceriam uma rápida difusão de moléculas (WOLFE et al., 1++8). O grau de insaturação dos ácidos graxos que compõem os fosfolipídios de membrana é um indicador de que os espermatozóides são extremamente sensíveis a estímulos externos. A função fertilizante do espermatozóide poderia explicar porque a célula espermática tem uma membrana fluida, flexível e muito ativa podendo ser facilmente desestabilizada e ativada (LENZI et al., 1+++).

Análises da composição da membrana plasmática da porção anterior da cabeça. dos espermatozóides de carneiros, revelaram uma mudança na

presença de fosfolipídios ligados a ácidos graxos durante o trajeto do espermatozóide da cabeça à cauda do epidídimo passando da dominância de grupos acil saturados (16:0) para a dominância exercida pelos grupos acil altamente insaturados (22:6) (PARKS & +AMMERSTEDT, 1+85). Essa mudança tenderia a contra-balancear o efeito do aumento do colesterol desde que é de se esperar que a substituição do grupo acil possa aumentar a fluidez da membrana (ROTTEM et al., 1+73; C+APMAN, 1+82).

A taxa de ácidos graxos insaturados em relação aos saturados influencia nas propriedades físicas das membranas e conseqüentemente sua resistência ao frio (STUBBS & SMIT+, 1+84) porém a relação entre a susceptibilidade do espermatozóide à criopreservação e o nível de insaturação dos ácidos graxos dos fosfolipídios de membrana tem sido bastante controversa. A fluidez da membrana plasmática dos espermatozóides é específica para cada espécie e existe ainda uma variação entre indivíduos (GIRAUD et al., 2000) o que talvez justifique em parte os diferentes resultados encontrados na literatura.

Como dito anteriormente, o espermatozóide de carneiro é mais sensível ao estresse do choque térmico do que aqueles de outras espécies como o dos bovinos, coelhos ou humanos (WATSON, 1+75; FISER & FAIRFULL, 1+8+), e as diferentes respostas a este estresse são basicamente devido às diferenças na composição lipídica da membrana plasmática. O espermatozóide de carneiro possui uma elevada taxa de ácidos graxos poli-insaturados/saturados e uma reduzida taxa molar de colesterol/fosfolipídeo quando comparada a outras espécies (DARIN-BENNETT & W+ITE, 1+77). A proporção de ácidos graxos poli-insaturados na membrana espermática influencia a fluidez dos lipídeos e isso tem sido sugerido como sendo responsável pela determinação da susceptibilidade do espermatozóide ao choque térmico que promove a desorganização da membrana e subseqüente injúria (DARIN-BENNETT & W+ITE, 1+77; WATSON, 1+81; W+ITE, 1++3; OLLERO et al., 1++8b).

Além disso, essa grande quantidade de ácidos graxos poli-insaturados nas membranas espermáticas de carneiros (SCOTT et al., 1+67; DARIN- BENNETT & W+ITE, 1+77; WOLFE et al., 1++8) faz com que os espermatozóides fiquem susceptíveis aos danos peroxidativos (FORCE et al., 2001) indutores da formação de espécies reativas ao oxigênio (ROS), que é

uma das maiores causas da redução da viabilidade e fertilidade da célula espermática de ovinos por provocar danos irreversíveis à membrana plasmática particularmente na região acrossomal e à membrana externa do próprio acrossomo além de reduzir ou anular a capacidade de movimento da célula com perdas das atividades respiratória e frutolítica (JONES & MANN, 1+77a, 1+77b). O grau de insaturação dos fosfolipídios das membranas espermáticas é desta forma, um parâmetro essencial de mensuração da capacidade do espermatozóide em manter o equilíbrio em um ambiente oxidativo (LENZI et al., 1+++). A adição de algumas substâncias com ação anti- oxidante de combate a formação de ROS no sêmen ovino tem demonstrado ser benéfica à manutenção e incremento da sobrevivência, motilidade, integridade do acrossomo e fertilidade in vitro e in vivo dos espermatozóides (MAXWELL & STOJANOV, 1++6; UPRETI et al., 1++7).

Entretanto, existe outro conceito geral de que a maior tolerância ao frio está associada com o aumento da fluidez da membrana. A adaptabilidade da membrana aos efeitos danosos da congelação-descongelação é marcadamente superior nos espermatozóides com elevada fluidez de membrana. Elevados índices de motilidade e viabilidade foram associadas com alta fluidez de membrana em células espermáticas humanas (GIRAUD et al., 2000).

a) Ácido Oléico-Linoléico

A temperatura reduzida durante o processo de resfriamento provoca mudanças como a separação ou a transição de fase dos componentes lipídicos das membranas, resultando em diminuição da sua fluidez (WATSON, 1+81). Giraud et al. (2000) observaram perda de permeabilidade pelo decréscimo na fluidez da membrana de espermatozóides humanos provocada pela congelação-descongelação. Espermatozóides permeabilizados de ovinos também apresentaram uma elevada e irreversível rigidez e imobilidade da membrana plasmática (LAD+A et al., 1++7). Essa rigidez pode provocar prejuízos à célula visto que funções da membrana são dependentes de uma fluidez adequada e mudanças na dinâmica da membrana podem alterar sua

função de barreira (GIRAUD et al., 2000). Desta forma, vários autores têm relatado a adição de ácidos graxos insaturados com o objetivo de aumentar a fluidez de membrana e a sua resistência à criopreservação: espermatozóides - Arav et al. (2000) e Peréz–Pé et al. (2001); oócitos - Zeron et al. (2002) e; embriões - Imai et al. (1++7) e +ochi et al. (1+++).

O efeito positivo do ácido linoléico ligado à albumina (LAA) durante o cultivo in vitro na sensibilidade de congelação dos embriões pode ser explicado pelo aumento da fluidez de membrana ou nível de insaturação, devido à incorporação direta de ácido linoléico à dupla camada lipídica. Especula-se que a afinidade do ácido linoléico à dupla camada lipídica da membrana plasmática facilitaria o acesso da albumina ligada ao colesterol de membrana (+OC+I et al., 1+++).

Imai et al. (1++7) observaram que a adição de LAA em meio de cultivo in vitro, não influenciou a habilidade dos embriões bovinos oriundos de FIV evoluírem para os estágios de blastocisto e blastocisto expandido, porém aumentou a sobrevivência destes após a criopreservação. Já Okazaki et al. (1++7), também investigando o efeito do LAA como suplemento ao meio de criopreservação de blastocistos bovinos oriundos de FIV, não observaram aumento significativo da proporção de blastocistos sobreviventes ou em eclosão após a congelação. +ochi et al. (1+++) por outro lado, relataram que as mórulas bovinas produzidas in vitro e expostas em meio de cultura contendo LAA mostraram ser relativamente tolerantes à criopreservação, 76% das mórulas em 0,1% de LAA puderam sobreviver após a congelação.

Segundo Peréz-Pé et al. (2001), a adição de ácido oléico-linoléico teve um efeito benéfico na preservação da viabilidade de espermatozóides ovinos. O melhor efeito foi encontrado com 37 µM, com um valor médio de 57,5% de viabilidade espermática contra 26,7% no grupo controle no início da incubação a 37ºC, e de 48,5% contra 25% após a incubação por uma hora. Os autores também obtiveram efeito benéfico das proteínas plasmáticas do sêmen quando adicionadas juntamente com o ácido oléico-linoléico o que, segundo conclusão dos autores baseada nos relatos de Watson (1+81), ocorreu possivelmente pelas modificações de fluidez lipídica e/ou estabilização dos elementos protéicos na matriz lipídica da membrana.