Adição de Proteínas ao Sêmen

A diferença entre a composição das membranas espermáticas é, juntamente com outros fatores como oxidação, temperatura, capacitação e reação acrossomal, a base molecular para as diferenças em fertilidade. A identificação das proteínas da membrana plasmática que estão envolvidas no processo de fertilização pode ajudar a formulação de melhores protocolos de criopreservação do sêmen (OLLERO et al., 1++8a).

Afora os efeitos osmóticos, a diluição do sêmen em procedimentos relacionados com a manipulação e criopreservação presumivelmente removem as proteínas ligantes, os antioxidantes naturais e outros componentes benéficos no plasma seminal requeridos para a manutenção da integridade da membrana e função do espermatozóide. A remoção desses componentes benéficos pela diluição pode também criar diferentes cargas entre os espermatozóides resultando em aglutinação, um problema que pode ser reduzido pela adição ao meio de pequenas quantidades de proteínas como por exemplo a albumina sérica bovina (BSA) ou o próprio plasma seminal (MAXWELL & JO+NSON, 1+++).

A capacidade da BSA em se aderir a diferentes lipídeos é bem conhecida e este efeito poderia ser responsável pela preservação da superfície celular contra o rompimento lipídico o que, conseqüentemente, evitaria a perda dos componentes de membrana (OLLERO et al., 1++6). Upreti et al. (1++5) relataram benefícios à motilidade dos espermatozóides ovinos e à manutenção da sua cinética durante o período de incubação (24 horas) após a adição de BSA no sêmen refrigerado. Por sua vez, Ollero et al. (1++6), avaliando a ação crioprotetora sobre o sêmen ovino de várias substâncias, obtiveram resultados superiores na preservação da viabilidade celular com o uso da BSA comparativamente ao grupo controle (22% e 20% respectivamente, P<0,05) o que revelou o efeito protetor dessa proteína sobre a membrana plasmática do espermatozóide. A BSA por outro lado, não apresentou efeito sobre o potencial de membrana mitocondrial quando adicionada ao sêmen ovino antes ou após o choque térmico (WINDSOR & W+ITE, 1++5).

O plasma seminal tem o papel de promover a fertilidade agindo como diluidor e veículo para o espermatozóide e exercer um efeito estimulante sobre a motilidade. Além do simples efeito de diluição, essa ativação do espermatozóide é também devido à presença de substâncias específicas nas secreções das glândulas acessórias (MAXWELL & JO+NSON, 1+++).

Maxwell et al. (1+++) encontraram que os espermatozóides ovinos congelados-descongelados e re-suspendidos em uma solução de 20% (v/v) de plasma seminal em PBS não exibiram a mesma capacitação precoce avaliada pelo teste da CTC que aqueles re-suspendidos somente em PBS e levaram a uma maior taxa de prenhez após a inseminação intracervical. Corroborando com esses achados Lausmann et al. (2004) também observaram que o plasma seminal adicionado ao sêmen ovino após a descongelação exerceu um efeito protetor sobre os espermatozóides prevenindo a reação acrossomal precoce. A redução na proporção de espermatozóides capacitados, indicando aumento da estabilização da membrana plasmática, após a adição do plasma seminal no meio de descongelação, levou Mortimer & Maxwell (2004) sugerirem que fatores presentes no plasma seminal seriam responsáveis por esse incremento. Peréz-Pé et al. (2001) avaliaram se as proteínas do plasma seminal associadas ou não a adição de ácidos graxos preveniam os danos provocados pelo choque de frio e se mantinham a viabilidade dos espermatozóides de carneiros. A adição das proteínas ao meio antes do tratamento de choque térmico teve efeito benéfico imediato sobre a sobrevivência espermática. Após o choque de frio a integridade de membrana que no sêmen in natura era de 72% passou para 25% no grupo não tratado e para 41% para o grupo tratado com as proteínas do plasma seminal.

Ollero et al. (1++8a) identificaram, no sêmen bovino, maiores perdas de proteínas da membrana plasmática em espermatozóides congelados- descongelados expostos a substâncias com ação detergente que em espermatozóides não criopreservados submetidos ao mesmo tratamento. Segundo os autores, o incremento na quantidade de proteína extraída a partir dos espermatozóides criopreservados pode ser interpretado como resultado da injúria provocada pela criopreservação, a qual tornaria a membrana espermática mais sensível à ação do detergente.

a) Į-Lactoalbumina

Os componentes da superfície espermática são alterados no epidídimo por glicosilação, processo pelo qual os açúcares se ligam às proteínas para formar as glicoproteínas. Enzimas glicosiltransferases particularmente a ȕ-1,4- galactosiltransferase (GalTase), estão presentes nas células espermatogênicas (SCULLY et al., 1+87) e espermatozóides (S+UR & BENNETT, 1+7+; LOPEZ et al., 1+85) de camundongos e podem estar envolvidas nas modificações da superfície espermática durante a maturação epididimária. +á evidências que a GalTase pode ser regulada pela Į-lactoalbumina presente no fluido do epidídimo (+AMILTON, 1+81; QUASBA et al., 1++3) e na superfície do flagelo do espermatozóide (KLINEFELTER & +AMILTON, 1+85) apesar disso, alguns estudos indicam que a atividade detectada da Į-lactoalbumina pode ser na verdade um artefato (+OLPERT & COOPER, 1++0).

O oligossacarídeo que funciona como substrato específico da GalTase espermática reside sobre a glicoproteína ZP3 presente na membrana pelúcida que é conhecida por ser responsável pela ligação do espermatozóide à membrana pelúcida e pela indução da reação acrossomal (S+UR & +ALL, 1+82; MACEK et al., 1++1). Parece que a agregação entre a GalTase e os múltiplos oligossacarídeos da ZP3 resulta em fusão e vesiculação da membrana plasmática e da membrana externa do acrossomo com conseqüente reação acrossomal (MACEK et al., 1++1). Uma linhagem de camundongos que tem uma predisposição genética para aumento da habilidade fertilizante também apresentou elevada atividade da GalTase na superfície do espermatozóide (S+UR & BENNETT, 1+7+).

Experimentos têm mostrado claramente que a GalTase da superfície reconhece e se liga aos resíduos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) presentes na membrana pelúcida (S+UR & +ALL, 1+82; LOPEZ et al., 1+85) durante a fertilização (S+UR & +ALL, 1+82). A presença da proteína do leite Į- lactoalbumina modifica a especificidade a substrato da GalTase da superfície do espermatozóide de forma desfavorável aos resíduos de GlcNAc e favoravelmente à glicose inibindo simultaneamente a ligação aos resíduos de GlcNAc da membrana pelúcida (S+UR & +ALL, 1+82). Apesar disso, Macek et

al. (1++1) não observaram nenhum efeito significativo da Į-lactoalbumina sobre a reação acrossomal de espermatozóides de camundongos.

Ollero et al. (1++6), avaliando a ação crioprotetora de várias substâncias sobre o sêmen ovino, obtiveram os melhores efeitos com a Į-lactoalbumina bovina. A Į-lactoalbumina foi significativamente mais efetiva na preservação da viabilidade celular (32%) que o grupo controle (20%), indicando claramente o efeito protetor dessa proteína sobre a membrana plasmática do espermatozóide. Além disso, a congelação com a Į-lactoalbumina, propiciou a manutenção da heterogeneidade observada originalmente em espermatozóides presentes no sêmen in natura. Ollero et al. (1++8b), adicionando ao meio diluidor 11 µM de Į-lactoalbumina, reduziram as perdas de viabilidade espermática após a descongelação de 87% para 41%, obtendo uma boa resposta ao desafio do teste hiposmótico, e diminuindo também as perdas em motilidade de +3% para 43%. Segundo Ollero et al. (1++6) a capacidade da Į-lactoalbumina em se aderir a diferentes lipídeos é bem conhecida e este efeito poderia ser responsável pela preservação da superfície celular contra o rompimento lipídico o que, conseqüentemente evitaria a perda dos componentes de membrana.