Avaliação da Capacitação e Reação Acrossomal

As mudanças que ocorrem durante a capacitação, antes da reação acrossomal são muito mais difíceis de serem acessadas (PÉREZ et al., 1++6b). Uma variedade de métodos indiretos têm sido estabelecida para avaliar mudanças na membrana espermática indicativas de capacitação porém, características comumente avaliadas tais como a reação acrossomal e a capacidade fertilizante, representam eventos terminais os quais fornecem pouca informação sobre a transição para a capacitação (GILLAN et al., 1++7).

O desenvolvimento de técnicas para o acompanhamento da capacitação espermática tem grande importância para a análise da função espermática e comparação da eficácia de técnicas de reprodução (PÉREZ et al., 1++6b). A técnica de fluorescência pela clortetraciclina (CTC) tem sido aplicada em espermatozóides ovinos com a vantagem de permitir não apenas a diferenciação entre células com acrossomo intacto e reagido, mas também dividir as células com acrossomo intacto em duas categorias funcionalmente diferentes, não capacitadas e capacitadas (DasGUPTA et al., 1++3; GILLAN et al., 1++7; LAUSMANN et al., 2004).

A CTC é uma sonda fluorescente quelante de cálcio que foi introduzida como um antibiótico, a aureomicina, e mais tarde aplicada para examinar a mobilização de cálcio pela mitocôndria. Subseqüentemente, ela foi usada para determinar a morfologia acrossomal em espermatozóides de camundongo, primeiro como um corante vital (SALING & STOREY, 1+7+) e então em células fixadas (WARD & STOREY, 1+84). A CTC rapidamente penetra pelas membranas celulares, enquanto que para os anions e os íons cálcio (Ca2+)

essas estruturas são relativamente impermeáveis. A CTC se liga ao cálcio da membrana e pode ser prontamente visualizada por microscopia de fluorescência (CARDULLO & FLORMAN, 1++3; PÉREZ et al., 1++6b).

A distribuição da fluorescência da CTC muda durante a capacitação, desta maneira, o padrão de distribuição do brilho fluorescente está relacionado ao estágio de capacitação (CARDULLO & FLORMAN, 1++3; PÉREZ et al., 1++6b). Funcionalmente, espermatozóides maduros de camundongo apresentam padrões de CTC característicos que consistem da emissão intensa de fluorescência a partir da porção anterior da cabeça e da peça intermediária. A fluorescência da porção anterior da cabeça é perdida à medida que se processa a exocitose (CARDULLO & FLORMAN, 1++3).

A partir dos primeiros trabalhos em camundongos, foram estipulados e, têm sido usados nas mais variadas espécies, três padrões de fluorescência: padrão F do termo em inglês full advindo da aparência do espermatozóide com a cabeça “completa” de fluorescência, padrão B do termo em inglês banded advindo da aparência em forma de “faixa” da fluorescência distribuída apenas na região pós-equatorial e, padrão AR do termo acrosome reaction que corresponde à ausência de brilho fluorescente na cabeça e que significa reação acrossomal (ovinos - GILLAN et al., 1++7 e 1+++, MAXWELL et al., 1+++ e PERIS et al., 2004; camundongo - WARD & STOREY, 1+84 e CARDULLO & FLORMAN, 1++3; suínos - +E et al., 2001 e +UO et al., 2002; bovinos - FRASER et al., 1++5, T+UNDAT+IL et al., 1+++ e CORMIER et al., 1++7; eqüinos - SC+EMBRI et al., 2002; humanos: DasGUPTA et al., 1++3).

Em ovinos, Pérez et al. (1++6b) encontraram quatro formas diferentes de distribuição da fluorescência na cabeça do espermatozóide do sêmen recém colhido e submetido ao teste de CTC: I - distribuição homogênea da fluorescência sobre toda a cabeça, com uma banda (faixa) mais brilhosa na região equatorial; II - uniformidade na fluorescência embora menor do que na forma I, sendo a faixa equatorial perdida; III - fluorescência na porção anterior da cabeça e ausência na região pós acrossomal e; IV - ausência de fluorescência por toda a cabeça.

As quatro formas identificadas por Pérez et al. (1++6b) foram responsáveis por mais de +5% dos achados em 20 amostras de sêmen in

natura. Uma forma menos importante foi caracterizada por fluorescência na região pós-acrossomal sendo notada ocasionalmente. A forma I foi a mais abundante (78%) enquanto que as formas II e III foram relativamente escassas, 13 e 5% respectivamente. A forma IV foi virtualmente ausente, ou apareceu apenas ocasionalmente, menos que 1%. Segundo os referidos autores, a forma I, que corresponde ao padrão F descrito para outras espécies, é a mais abundante no sêmen imediatamente após a ejaculação e diminui durante a capacitação e reação acrossomal, representando o estágio não capacitado. A forma II parece ser única para o espermatozóide de carneiro, enquanto que a forma III se refere ao espermatozóide com padrão B. As formas II e III aumentam transitoriamente durante a exocitose acrossomal induzida pelo cálcio ionóforo, sugerindo que representam formas intermediárias. Durante a capacitação a forma II aumenta enquanto que a forma III se acumula, assim a forma II parece representar um estágio inicial de capacitação. A forma IV, referente ao padrão AR, foi observada apenas após a indução da exocitose acrossomal, sendo a mais provável representação do estágio de reação acrossomal. Assim, os autores sugerem que o aparecimento dos diferentes padrões durante a capacitação e subseqüente reação acrossomal segue a seguinte seqüência: I, II, III e IV.

Pérez et al. (1++6b) observaram por meio de análise do sêmen em microscopia de interferência de fase, que espermatozóides na forma II mostram acrossomos intactos, enquanto a maioria daqueles na forma III apresenta um estágio intermediário de perda acrossomal. Portanto as alterações estruturais de membrana parecem ter início na forma III, enquanto que a reação acrossomal completa é muito rara nesta forma. Isso, segundo os autores, leva a crer que espermatozóides na forma III já são capazes de sofrer reação acrossomal, enquanto que a forma IV aparece apenas mediante o término da exocitose. O aparecimento massivo da forma IV em amostras tratadas com cálcio ionóforo sugere que esta é uma forma completamente reagida.

Gillan et al. (1++7) adotaram para ovinos a mesma nomenclatura originalmente relatada por Saling & Storey (1+7+) e Ward & Storey (1+84) que propuseram a divisão dos espermatozóides nas seguintes categorias: padrão F - não capacitados e com acrossomos intactos, padrão B - capacitados e com

acrossomos intactos e, padrão AR - com reação acrossomal. Os referidos autores agruparam as categorias I e II descritas por Pérez et al. (1++6b) como padrão F, uma vez que as referidas categorias foram observadas em espermatozóides com acrossomo intacto que apresentavam um padrão de coloração diferente daquelas células capacitadas. Além disso, um padrão ocasionalmente observado no qual espermatozóides apresentavam-se com brilho fluorescente na região pós-acrossomal e ausência de fluorescência na região do acrossomo, foi agrupado dentro do padrão AR.

Corroborando com as observações anteriores, DasGupta et al. (1++3) verificaram que, de acordo com a FITC-PSA, todos os espermatozóides humanos que exibiram o padrão F apresentaram acrossomos intactos. A maioria das células do padrão B também apresentou acrossomo intacto, embora uma minoria tenha exibido um padrão de coloração intermediário da FITC-PSA. Com raras exceções, células com o padrão AR apresentaram acrossomos completamente reagidos. Esses resultados sugerem, segundo os autores, que os padrões F e B são encontrados em células com acrossomos intactos, embora algumas das células do padrão B devam ter iniciado exocitose, e que o padrão AR é observado em células que apresentam acrossomos completamente reagidos.

Com o intuito de excluir os espermatozóides mortos e danificados da análise dos espermatozóides criopreservados de ovinos, Pérez et al. (1++6a) realizaram a avaliação simultânea da integridade de membrana e do estágio de capacitação por meio de coloração dupla com +oechst 33258 e CTC. Segundo os autores, o grande número de células mortas nas amostras de sêmen descongelado pode influenciar ou levar a erros de interpretação dos resultados das provas de capacitação.