Introdução geral
1.2.7 Amostragem e análise em produtos alimentares contaminados
- sem limite legal estabelecido
1.2.7 Amostragem e análise em produtos alimentares contaminados
Métodos de análise específicos, sensíveis, precisos e reprodutíveis são necessários para controlar os níveis de ocratoxina A nos alimentos e assim fazer cumprir os limites legais, para avaliar a exposição humana a esta micotoxina e para a investigação laboratorial.
Nos métodos analíticos para a OTA, tal como acontece com as outras micotoxinas, é necessário proceder de forma sequencial a uma correcta amostragem, à preparação da amostra recolhida, à extracção da totalidade ou de parte da amostra preparada, à limpeza do extracto obtido e, finalmente, à quantificação e confirmação da OTA.
Como já foi referido anteriormente, uma correcta amostragem é essencial para garantir a validade do método pois esta constitui uma fonte de erros significativos, sobretudo, quando se
quer analisar matrizes sólidas (Whitaker, 2003). No que diz respeito à OTA e para efeitos de controlos oficiais, a directiva comunitária 2005/5/EC estabelece, para diversos produtos alimentares e relativamente à dimensão dos lotes, o número de amostras que é necessário recolher e a sua dimensão (EC, 2005).
Depois de recolhida, a amostra necessita de ser preparada antes de ser extraída. Esta preparação é feita, sobretudo, quando são analisados alimentos sólidos, sendo necessário proceder à sua trituração de forma a obter uma boa homogeneização e a reduzir o tamanho das partículas a analisar. Normalmente, quanto menor for o tamanho das partículas obtidas, menores serão os erros associados ao método analítico (Spanjer et al., 2006).
A extracção das amostras, para o caso particular da OTA, é feita utilizando solventes orgânicos como o metanol, o acetonitrilo, o acetato de etilo ou o clorofórmio (normalmente
acidificados), soluções aquosas de NaHCO3 (entre 1 a 5%) ou misturas destes. Algumas
misturas de solventes utilizadas são: metanol/H2O, acetonitrilo/KCl, clorofórmio/metanol,
misturas de solventes orgânicos com ácido fosfórico diluído ou misturas de metanol e
NaHCO3 em várias proporções (Betina, 1985). Mais recentemente, tem sido estudada a
aplicação de técnicas como a extracção com recurso a microondas ou a extracção líquida pressurizada de forma a reduzir a quantidade de solventes utilizados e o tempo dispendido com este passo analítico, aumentando as taxas de recuperação da OTA (Liazid et al., 2007).
Os processos de purificação das amostras incluem a partição com solventes e processos cromatográficos (Betina, 1993). No caso da OTA, devido aos grupos com carácter ácidos da sua molécula, é possível purificá-la com bastante eficiência depois de ter sido extraída com um solvente orgânico. É necessário, para tal, proceder à sua partição em solução aquosa de
NaHCO3 e re-extraír a micotoxina dessa solução com um solvente orgânico depois de a
acidificar (Frisvad & Thrane, 1993). No entanto, hoje em dia, a utilização de colunas de imunoafinidade está muito generalizada na maior parte dos métodos descritos na literatura (Castegnaro et al., 2006). Técnicas como a extracção em fase sólida (SPE) (Hernandez et al., 2006) ou a micro-extracção em fase sólida (SPME) (Aresta et al., 2006) têm vindo, também, a ser implementadas e utilizadas com maior frequência. Recentemente, polímeros molecularmente impressos começaram a ser desenvolvidos para a purificação e concentração de OTA, procurando substituir as colunas de imunoafinidade demasiado caras e passíveis de ser utilizadas apenas uma única vez (Baggiani et al., 2001; Yu & Lai, 2006).
Finalmente, para a detecção e quantificação da OTA são sobretudo utilizados técnicas cromatográficas como o TLC e o HPLC. O TLC foi durante muitos anos a técnica mais
utilizada para esse fim, tendo vindo gradualmente a ser substituído pelo HPLC devido, essencialmente, à maior sensibilidade, precisão e reprodutibilidade desta última técnica mas, também, devido à possibilidade de automação. No entanto, o TLC continua a ser muito útil em determinadas situações, sendo considerado que pode continuar a desenvolver um papel importante nos países sub-desenvolvidos ou em vias de desenvolvimento, continuando a existir, por isso, para certas micotoxinas, programas de validação de métodos que utilizam esta técnica (Gilbert & Anklam, 2002). Para a determinação da OTA por TLC utilizam-se placas de sílica gel ou placas de sílica gel pré-tratadas com ácido oxálico e, como fase móvel, composições de solventes de várias naturezas, como sejam, a título de exemplo, o tolueno/ acetato de etilo/ácido acético (6:3:1, v/v/v) e o benzeno/ácido acético (4:1, v/v). Outros ainda, podem ser encontrados no artigo de revisão de Betina (1985). Depois de efectuada a separação, a sua visualização é feita expondo as placas à luz ultravioleta (366 nm), uma vez que a OTA emite fluorescência azul esverdeada e a sua identificação é feita comparando os Rf obtidos com valores de referência ou com o Rf de um padrão aplicado na própria placa. Adicionalmente, a sua confirmação é feita expondo as placas de TLC a vapores de amónia ou
pulverizando as mesmas com soluções aquosas de NaHCO3 ou de NaOH de forma a alterar a
sua fluorescência para azul escuro. Pode ser ainda confirmada por derivatização com trifluoreto de boro, comparando o Rf do derivado ester metílico com padrões (Betina, 1993).
Actualmente, os procedimentos de detecção de OTA que utilizam o HPLC são os mais frequentes. Alguns desses procedimentos utilizam detectores de ultravioletas; contudo, está, hoje em dia, mais generalizada a utilização de detectores de fluorescência, uma vez que são mais sensíveis e mais específicos. Detectores de espectro de massa têm também vindo, mais recentemente, a ser utilizados.
Colunas de fase reversa têm sido quase exclusivamente adoptadas para a separação
cromatográfica da ocratoxina A, bem como a utilização de eluentes como acetonitrilo/H2O,
metanol/H2O ou acetona/H2O acidificados com ácidos como o ácido fosfórico, o ácido
acético, o ácido fórmico ou o ácido trifluoracético (Frisvad & Thrane, 1993).
O ELISA tem, também, sido utilizado para a detecção e quantificação da OTA. Estes ensaios baseados em reacções antigénio-anticorpo possibilitam análises rápidas, específicas e sem a necessidade de utilizar grandes equipamentos. No entanto, e embora por vezes os limites de detecção sejam comparáveis com alguns métodos cromatográficos, existe a possibilidade de ocorrerem falsos positivos devido à reacção cruzada do anticorpo com outras ocratoxinas e de ocorrerem falsos negativos devido à falta de sensibilidade da técnica
(Visconti & de Girolamo, 2005). Outras técnicas mais recentes têm sido também desenvolvidas e implementadas. São elas, por exemplo, os aparelhos de fluxo lateral (constituídos por anticorpos imobilizados em membranas), as matrizes de biossensores, os imunoensaios de fluorescência polarizada e os imunoensaios de eléctrodos impressos (Visconti & de Girolamo, 2005).
Para alguns produtos alimentares, nomeadamente cevada, milho, trigo, rins, vinho e cerveja, estão desenvolvidos métodos oficiais para a análise e detecção de ocratoxina A, como se indica na Tabela 1.2.9.
Tabela 1.2.9 Métodos validados para a detecção de OTA em alguns produtos alimentares (elaborado
segundo os artigos de revisão: Gilbert & Anklam, 2002; Monaci & Palmisano, 2004; Visconti & de Girolamo, 2005)
Matriz Método oficial
(referência) Limpeza da amostra Técnica cromatográfica
Cevada AOAC 2000.03
CEN 14132
IAC HPLC-FD
Grãos de café verde AOAC 975.38 CC TLC
Grãos de café verde AOAC 2004.10 - HPLC-FD
Café torrado AOAC 2000.09
CEN 14132 SPE + IAC HPLC-FD Milho, cevada e rins AOAC 991.44 CC HPLC-FD Cerveja, vinho branco e tinto AOAC 2001.01 CEN 14133 OIV 16/2001 IAC HPLC-FD Cevada, milho e farelo de trigo CEN 15141-2 CC HPLC-FD Cevada, farelo de trigo e centeio NMLK 143 CC HPLC-FD
Alimentos de bebés em aprovação pela CEN
(Burdaspal et al., 2001)
IAC HPLC-FD
Pó de cacau em aprovação pela CEN
(Brera et al., 2005)
IAC HPLC-FD
Frutos secos em aprovação pela CEN
(MacDonald et al., 2003)
IAC HPLC-FD
CC- coluna cromatográfica, HPLC-FD- cromatografia líquida de alta resolução com detecção por fluorescência, NMLK- Nordic committee on food analysis