Degradação da ocratoxina A por acção de um enzima isolado a partir de Aspergillus niger MUM 03.58

3.2.2.1 Material biológico

Utilizou-se a estirpe não produtora de ocratoxina A, Aspergillus niger MUM 03.58 e a estirpe produtora de ocratoxina A, A. alliaceus MUM 03.55. Estas estirpes foram isoladas a partir de uvas, identificadas e caracterizadas por Serra et al. (2003).

3.2.2.2 Soluções tampão

Utilizou-se uma solução de extracção constituída por tampão citrato/fosfato (50 mM a pH 5,6) suplementada com 0,24 mM de Triton X-100 (Sigma) e 0,1% de azida sódica. Utilizaram-se as soluções tampão a pH 3,0; 5,6; 7,5; 8,5 e 10,0 descritas na secção 3.2.1.2. 3.2.2.3 Preparação do inóculo

As estirpes utilizadas foram inicialmente crescidas em tubos de greiner de 15 mL com o meio de cultura MEA durante 7 dias a 25 ºC no escuro. A partir desta, prepararam-se suspensões de esporos para serem utilizadas com inóculo. Para tal, adicionou-se aos tubos de greiner 4 mL de solução de peptona (0,1% de peptona e 0,001% de Tween 80), homogeneizou-se utilizando o vortex durante 1 min e transferiram-se as suspensões para tubos estéreis novos.

MEA Extracto de Malte 20 g/L

(formulação de Blakeslee) Glucose 20 g/L

Peptona 1 g/L

Agar (Oxoid Nº 3) 20 g/L 3.2.2.4 Preparação dos meios de cultura para a produção do enzima

Utilizou-se um meio de gérmen de trigo (GT) composto por 30 g de gérmen de trigo dextrinado (Cem Porcento®), humedecidos com 13,5 mL de água destilada em matrazes de 500 mL e autoclavado a 121 ºC durante 15 min (uniclave 88, AJC). Utilizaram-se também duas modificações do meio GT de forma a verificar se a ocratoxina A induzia a produção do enzima em quantidades suficientes que permitissem a sua detecção e isolamento. Elaborou-se,

portanto, um meio enriquecido com ocratoxina A (GT-OTA) e, como controlo, um meio enriquecido apenas com biomassa fúngica (GT-niger). Para elaborar GT-OTA, inoculou-se o meio GT com 1 mL da solução de esporos da estirpe A. alliaceus MUM 03.55, incubou-se no escuro a 25 ºC (incubator, Sanyo) durante 16 dias para permitir o crescimento do fungo bem como a produção de OTA e autoclavou-se a 121 ºC durante 15 min. Para elaborar GT-niger, procedeu-se da mesma forma utilizando neste caso a solução de esporos da estirpe A. niger MUM 03.58 para inocular o meio GT. Procurou-se desta forma obter um meio de cultura sem OTA mas onde previamente tivesse crescido um fungo filamentoso, tal como em GT-OTA, de forma a ser utilizado como seu controlo.

3.2.2.5 Inoculação e condições de incubação para a produção do enzima

Foram inoculados matrazes com meio GT, GT-OTA e GT-niger, utilizando 1 mL da solução de esporos da estirpe A. niger MUM 03.58 e incubados no escuro a 25 ºC durante 10 dias para permitir o crescimento do fungo e a produção do enzima.

3.2.2.6 Preparação dos extractos enzimáticos de A. niger

Procedeu-se da seguinte forma para cada um dos meios de cultura onde cresceu o A. niger. Adicionaram-se 100 mL de solução de extracção fria, quebrou-se o substrato finamente com a ajuda de uma espátula e deixou-se em agitação magnética durante 2 horas a 4 ºC (Selecta asinoro). O homogeneizado assim obtido foi filtrado e espremido através de uma rede de nylon de forma a separar a fracção líquida da fracção sólida. A fracção líquida foi centrifugada a 604 RCF durante 10 min a 4 ºC (4K15, Sigma) e o sobrenadante filtrado por papel de filtro (500-A, la papelera del besós, S.a.). Deste filtrado guardou-se uma amostra de 0,5 mL a 4 ºC para quantificar a proteína e a actividade hidrolítica. De seguida, o filtrado foi congelado a -80 ºC (Ultra-low, Sanyo) e liofilizado (Christ alfa 2-4, B. Braun Biotech international). O liofilizado foi ressuspendido em 10 mL de tampão fosfato frio (100 mM, a pH 7,5) e 20 mL de acetona fria foram-lhe adicionados. Após uma breve agitação colocou-se no congelador durante 30 min de forma a permitir a precipitação da fracção proteica. De seguida, a amostra foi centrifugada (12225 RCF durante 15 min a 4 ºC), o sobrenadante descartado e o pellet lavado com 10 mL de acetona fria. Após uma nova centrifugação às condições anteriores, e depois de descartar novamente o sobrenadante, o pellet foi deixado secar ao ar antes de ter sido ressuspendido em 10 mL de tampão fosfato (100 mM a pH 7,5). Os extractos enzimáticos obtidos foram mantidos a 4 ºC e o seu conteúdo em proteína quantificado.

3.2.2.7 Quantificação da proteína

Para quantificar a proteína das amostras utilizou-se o método de Bradford (Bradford, 1976) tendo-se procedido da seguinte forma. Diluíram-se as amostras na proporção (1:10) utilizando tampão fosfato (100 mM, a pH 7,5). Prepararam-se soluções padrão de albumina de soro bovino (Sigma) com 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 mg/mL utilizando o mesmo tampão fosfato. Adicionaram-se, numa microplaca de 96 poços e em quadruplicado, 10 µL de cada amostra diluída a 290 µL de reagente de Bradford misturando bem com a ponta da micropipeta. Procedeu-se da mesma forma com cada uma das soluções padrão, de forma elaborar uma curva de calibração, e com a solução de tampão fosfato (100 mM a pH 7,5) para constituir os brancos. Deixou-se repousar à temperatura ambiente durante 20 min e registou-se a absorvência a 595 nm utilizando um espectrofotómetro para microplacas (Synergy HT, Bio-Tek). Representou-se graficamente a concentração de proteína das soluções padrão em função da absorvência registada e obteve-se uma curva de calibração por regressão linear dos dados a partir da qual se calculou a concentração de proteína presente nas amostras.

Reagente de Bradford Coomassie blue G250 100 mg

Etanol 50 mL

Àcido fosfórico (85%) 100 mL H2Odd (perfazer) 1000 mL (Filtrar por papel de filtro)

3.2.2.8 Detecção da actividade hidrolítica sobre a OTA

Utilizaram-se soluções com 1 µg/mL de OTA a pH 3,0; 5,6; 7,5; 8,5 e 10,0, elaboradas como descrito na secção 3.2.1.3, para avaliar a actividade hidrolítica dos extractos enzimáticos produzidos. Prepararam-se e incubaram-se a 37 ºC ensaios de degradação constituídos por 980 µL de solução de OTA e 20 µL de extracto enzimático. Recolheram-se amostras de 20 µL às 0, 3, 6, 9, 15 e 25 horas de reacção que foram imediatamente dissolvidos em 980 µL de fase móvel de HPLC. Estas amostras foram filtradas e analisadas por HPLC como descrito anteriormente. Ensaios de degradação com 0,5 mg/mL de CPA foram também realizados como controlos positivos e ensaios sem nenhum enzima como controlos negativos.

3.2.2.9 Determinação da actividade enzimática

Uma unidade de actividade hidrolítica sobre a OTA (U) foi definida como a produção de 1 ng/min de OTα a pH 7,5 e 37 ºC. Esta foi calculada utilizando a quantidade de OTα

detectada ao fim de 3 horas de incubação nessas condições. A actividade específica foi expressa em unidades de actividade por mg de proteína (U/mg).

3.2.2.10 Purificação do extracto de GT-OTA por cromatografia de troca aniónica Preparou-se uma coluna de cromatografia (1,0 x 4,0 cm) com a resina aniónica Macro-Prep High Q (Biorad). Diluíu-se o extracto enzimático produzido a partir do meio de cultura GT-OTA de forma a ficar com 1 mg/mL de proteína e injectaram-se 0,2 mL na coluna previamente equilibrada com tampão fosfato (100 mM a pH 7,5). Eluíu-se com um gradiente de NaCl a 1,0 M em 60 minutos e a um caudal de 0,5 mL/min, ver Figura 3.3.8 na página 101. Recolheram-se fracções de 1 mL a cada 2 min e quantificou-se a proteína total como descrito acima. Determinou-se, também, a actividade hidrolítica sobre a OTA em cada uma das fracções. Para tal, adicionou-se 1 µg de OTA (20 µL de stock a 50 µg/mL em tampão fosfato, 100 mM a pH 7,5) a cada uma das fracções e após 3 horas a 37 ºC quantificou-se a OTA e OTα por HPLC, como descrito atrás. O sistema de FPLC utilizado era constituído por duas bombas Pharmacia LKB P-500 e um controlador LCC-500 plus, acoplados a um detector Diode Array Merck-Hitachi L-7455. A proteína eluída foi monitorizada por absorvência a 280 nm.

3.2.2.11 Efeito de inibidores na actividade hidrolítica sobre a OTA

O efeito dos inibidores EDTA e PMSF na actividade do extracto enzimático produzido a partir do meio de cultura GT-OTA foi testado. Prepararam-se, como já descrito, soluções com OTA a pH 7,5 com 10 mM de EDTA, 1 mM de PMSF e sem nenhum inibidor. Ensaios de degradação constituídos por 980 µL destas soluções com OTA e 20 µL de extracto enzimático foram preparados e incubados a 37 ºC durante um dia. As amostras foram processadas como já descrito para quantificar a OTA e OTα presentes ao fim de 0, 3, 6, 9, 15 e 25 horas de reacção. As percentagens de inibição da actividade foram calculadas como já referido no ponto 3.2.1.7.

3.2.2.12 Determinação dos parâmetros cinéticos

Os parâmetros cinéticos do extracto enzimático produzido a partir do meio de cultura GT-OTA foram determinados. Prepararam-se ensaios de degradação com 0,01; 0,1; 0,3; 0,6 e 1,3 mg OTA/mL em tampão fosfato (100 mM a pH 7,5) e 0,01 mg/mL de extracto enzimático de GT-OTA. Incubaram-se a 37 ºC e recolheram-se amostras de 20 µL aos 0, 15, 30, 45 e 60 min de reacção para serem processadas como já descrito atrás de forma a quantificar a OTA e

determinadas por regressão linear da representação gráfica da concentração de OTα em

função do tempo. A constante de Michaelis-Menten (Km) e a velocidade máxima da reacção

(Vmax) foram determinadas por regressão não linear e ajuste dos dados à equação de

Michaelis-Menten: