carbonarius utilizada. Sendo assim, a acção antifúngica do composto 4a pode ser

considerada semelhante à de alguns produtos comerciais testados por Bellí e co-autores (2006). Os efeitos antifúngicos do composto 4a, que acabamos de descrever, foram observados quando se realizaram os ensaios com o meio de cultura YES. Contudo, a mesma acção antifúngica não foi observada quando se utilizou o meio de cultura SNM. Esta perda de actividade biológica poderá dever-se à própria composição do meio de cultura (e.g. à sua acidez) que pode ter induzido a perda da conformação dimérica do composto 4a, que, como vimos anteriormente, parece ser essencial para a sua acção antifúngica. Seria, portanto,

importante confirmar os efeitos antifúngicos de 4a utilizando um outro meio de cultura, por exemplo o meio CYA, adequado, também, para determinar a produção de OTA.

Relativamente ao efeito sobre a produção de OTA, verificou-se que as maiores reduções foram observadas com a estirpe de A. alliaceus quando foi crescida na presença de 4a. Na presença de 50, 100 e 200 µM deste composto esta estirpe produziu, nos ensaios realizados em meio sólido, respectivamente, menos 32, 46 e 94% de OTA que o seu controlo e, nos ensaios realizados em meio líquido, respectivamente, menos 22, 63 e 93%. A produção de menos OTA na presença de 4a em meio sólido e líquido é consistente e deve-se, muito provavelmente, ao efeito que este composto tem sobre o crescimento das estirpes, mais do que a uma possível capacidade para inibir a via metabólica da mesma, uma vez que o mesmo efeito não foi detectado com estirpes de A. carbonarius e A. ochraceus. O composto 4b apresentou, também, alguma actividade sobre a produção de OTA, tendo-se verificado que

A. alliaceus e A. carbonarius produziram menos 48 e 61% de OTA quando foram crescidos

na presença de 200 µM deste composto. É importante relembrar que nenhum efeito sobre o crescimento das estirpes foi observado com este composto, podendo, à partida, as reduções de OTA serem devidas à inibição da sua síntese. No entanto, como já discutimos atrás, o composto 4b apresenta problemas de solubilidade em DMSO que podem ter influenciado os resultados obtidos. Seria, por isso, aconselhável, em estudos futuros, repetir os ensaios com este composto. Adicionalmente, verificou-se que o composto 4a não produziu os mesmos efeitos sobre a produção de OTA quando se utilizou o meio de cultura SNM. Este facto vem reforçar a ideia de que este composto é instável quando dissolvido neste meio de cultura, o que leva a que perca a sua actividade biológica.

Da mesma forma, testou-se, também, o efeito antifúngico do Na2EDTA em estirpes de

Aspergillus negros uma vez que é conhecido que este composto tem efeitos antifúngicos sobre

algumas leveduras (Sen et al., 2000; Siqueira & Sen, 2004; Kubo et al., 2005) e sobre

Aspergillus fumigatus (Hachem et al., 2006). Nestes ensaios verificou-se que o Na2EDTA foi capaz de inibir significativamente o crescimento das estirpes testadas. Nomeadamente, quando 1 mM foi utilizado, o crescimento de A. carbonarius, A. ibericus, A. niger ocratoxigénico e A. niger não ocratoxigénico foi inibido, respectivamente, em 32, 56, 36 e

16% enquanto que 10 mM de Na2EDTA inibiram o crescimento das mesmas estirpes em 88,

89, 87 e 82%, respectivamente. Os EC50 calculados foram de cerca de 2 mM para as estirpes

ocratoxigénicas e de 0,9 e 4,1 mM para A. ibericus e A. niger não ocratoxigénico,

situações, a produção de OTA pelas estirpes ocratoxigénicas. Nomeadamente, verificou-se,

quando 1 e 10 mM de Na2EDTA foram utilizados, que esta micotoxina foi apenas detectada

ao fim de, respectivamente, 4 e 8 dias de incubação apesar de, nos controlos, esta ter sido

detectada ao fim de 2 dias. Além do mais, verificou-se, quando 10 mM de Na2EDTA foram

utilizados, que A. carbonarius e A. niger ocratoxigénico produziram ao fim de 8 dias de incubação, respectivamente, menos 98 e 99,9% de OTA que os respectivos controlos. O efeito no crescimento das estirpes deve-se, muito provavelmente, à conhecida capacidade do

Na2EDTA para quelar os iões de zinco que são necessários para uma correcta construção da

parede celular tal como é sugerido por Brul et al. (1997) no seu estudo com leveduras. A redução na produção de OTA resulta, provavelmente, do efeito sobre o crescimento das estirpes mais do que da inibição da via metabólica desta micotoxina.

Em conclusão, o trabalho aqui apresentado demonstra que na concentração de 200 µM o composto 4a é capaz de controlar, sobretudo, o crescimento de A. alliaceus e os níveis de OTA que este produz, e que na concentração de 2 mM é capaz de inibir, totalmente, o crescimento das diferentes estirpes testadas. A sua utilização como fungicida poderia ter interesse para controlar a presença destes fungos nos produtos agrícolas onde são frequentemente encontrados e nos quais são responsáveis pela presença de OTA. Por exemplo, nos figos, nas uvas ou nos grãos de café, uma vez que a presença desta micotoxina se deve, na sua maioria e respectivamente, ao A. alliaceus (Bayman et al., 2002), ao

A. carbonarius (Serra et al., 2003; Bellí et al., 2004) e ao A. ochraceus (Magnani et al., 2005;

Martins et al., 2003). No entanto, para que o composto 4a possa vir a ser utilizado como fungicida são, de certo, necessários estudos mais aprofundados sobre a sua acção antifúngica, o seu modo de actuação, a sua estabilidade química ou sobre potenciais efeitos tóxicos para o

ser humano, animais ou mesmo plantas. No que diz respeito ao Na2EDTA, verificamos, de

uma forma geral, que 10 mM deste composto são capazes de controlar, significativamente, o crescimento dos aspergilli negros testados e os níveis de OTA que as estirpes ocratoxigénicas produzem. Como já vimos, este composto é um conhecido agente quelante que é bastante utilizado na agricultura para estabilizar as formulações de certos produtos químicos ou para fornecer micronutrientes às plantas (Oviedo & Rodriguez, 2003). Seria, portanto, interessante

verificar, em ensaios de campo, se produtos que contenham Na2EDTA podem de facto

contribuir para controlar a presença de fungos ocratoxigénicos e a respectiva presença de OTA. Além do mais, este composto é capaz de potenciar o efeito de outros agentes antimicrobianos, uma vez que destabiliza a integridade das membranas celulares (Oita, 2003).

Sendo assim, seria, também, interessante avaliar o seu efeito quando utilizado em conjunto com outros fungicidas comerciais ou mesmo com o composto 4a, aqui estudado.

Para terminar, é importante realçar que a abordagem laboratorial utilizada para desenvolver este estudo se revelou bastante limitativa à realização de mais ensaios de forma a se poderem testar, por exemplo, maior número de concentrações de composto activo, maior número de réplicas, outros meios de cultura, outras estirpes ou mesmo outras espécies de fungos filamentosos. Além do mais, o facto de se utilizar, com esta metodologia, grandes volumes de meio de cultura implica, à partida, a disponibilidade de maiores quantidades dos compostos a estudar, o que nem sempre é possível quando se trata de compostos produzidos à escala laboratorial. Seria, portanto, importante, para estudos futuros, implementar e validar um método em microplaca que pode ser desenvolvido tendo por base alguns já publicados (Pujol

et al., 1996; EspinelIngroff et al., 1997; Llop et al., 2000; Yamaguchi et al., 2002; NCCLS,

2002), o que possibilitaria, com certeza, testar maior número de compostos a uma gama mais alargada de concentrações, consumindo menos reagentes e menos tempo. Com tal método, penso que ficará facilitado o teste de novos compostos ou de modificações dos compostos já testados e que demonstraram possuir alguma actividade, aprofundando-se, assim, esta colaboração com a Professora Doutora Fernanda Proença.