Análise bidimensional das cultivares ‘Judia’ 76 e ‘Rebolão’

Através da técnica bidimensional, separamos as proteínas através da massa molecular relativa e pelo ponto isoeléctrico a fim de obter melhor resolução das proteínas, ou seja, aumentando o grau de separação das mesmas com o objectivo de caracterizar e identificar as proteínas presentes nas amostras.

As tiras de gel IPG pH 3-10 de 13 cm, revelaram-se adequadas para a focalização isoeléctrica, obtendo-se spots bem distribuídos, permitindo uma boa visualização e a excisão precisa dos mesmos (Figura 17 e 18).

Figura 17 – Imagem do gel bidimensional da amostra da cultivar ‘Judia’ 76 com coloração

Coomassie G-250. Tira de gel IPG pH 3-10 de 13 cm.

Figura 18 – Imagem do gel bidimensional da amostra da cultivar ‘Rebolão’ com coloração

Coomassie G-250. Tira de gel IPG pH 3-10 de 13 cm. SDS-PAGE

IEF

Na amostra de ‘Judia’ foram identificados 87 spots (Figura 19-A), enquanto que na amostra de ‘Rebolão’ foram identificado 172 spots (Figura 19-B), o que permite concluir que a técnica de separação proteica decorreu do modo pretendido e em condições adequadas.

Figura 19 – Géis bidimensionais de referência com marcação de spots obtidos através do software

SameSpots. A - Gel correspondente à cultivar ‘Judia’ 76; B - Gel correspondente à cultivar ‘Rebolão’.

Todos os spots obtidos foram excisados, sujeitos a digestão in-gel e analisados por MALDI-TOF/MS. Os picos obtidos das identificações dos péptidos pretendidos foram comparados com os resultados obtidos das bases de dados NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para as sequências nucleotídicas do género Castanea, que são convertidas em sequências de aminoácidos e sofrem também digestão, in silico, no software Mascot.

Dos 87 spots excisados da amostra ‘Judia’ 76, foi possível obter 40 identificações para entradas no NCBI, das quais 9 tinham sequências proteicas associadas. Obtivemos a identificação para 3 proteínas distintas. Nos restantes 31 spots obtivemos identificação para sequências nucleotídicas de Castanea, que não possuem proteínas associadas, sendo mais tarde alvo de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) para sequências de aminoácidos presentes nas bases de dados do NCBI.

Dos 172 spots excisados para da amostra ‘Rebolão’ foi possível obter 32 identificações para entradas no NCBI, das quais em 17 tinham sequências proteicas associadas, correspondente a 4 proteínas distintas. Também os restantes 15 spots

identificados foram alvo de BLAST para sequências de aminoácidos presentes nas bases de dados do NCBI.

Estes resultados encontram-se descritos em Anexo 9, onde podemos consultar detalhes da identificação. As Tabelas 15 e 16 apresentam a informação detalhada, como por exemplo: cultivar da amostra, número de acesso, peso molecular relativo, valor de pI, mascot score e processo biológico da proteína, acerca dos spots em que se obteve uma identificação proteica imediata para as cultivares em estudo.

Tabela 15 – Proteínas em que se obteve uma identificação, por MALDI-TOF/MS, imediata de proteínas para a cultivar ‘Judia’ 76. Spot Numero de

entrada Nome da proteína Espécie

Nome do gene Peso molecular relativo (Da) pI Mascot score MS

coverage Porcesso biológco

A1 Q8LK20_CASCR Castanin Castanea _crenata N\A 70610 9,2 69 10 Armazenamento de substratos nutritivos

A3 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea

sativa N/A 61321 5,7 75 16 Armazenamento de substratos nutritivos

A6 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea _sativa N/A 61321 5,7 147 24 Armazenamento de substratos nutritivos

A7 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea

sativa N/A 61321 5,7 151 25 Armazenamento de substratos nutritivos

A9 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea _sativa N/A 61321 5,7 133 20 Armazenamento de substratos nutritivos

A39 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea

sativa N/A 61321 5,7 90 16 Armazenamento de substratos nutritivos

A48 Q597L0_9ROSI

Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase

large subunit

Castanea

seguinii rbcl 51506 6,1 105 16 Fixação de carbono e fotossíntese

A49 Q597L0_9ROSI

Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase

large subunit

Castanea

seguinii rbcl 51506 6,1 75 12 Fixação de carbono e fotossíntese

A50 A0A0D4BN71_9 ROSI Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit Castanea

Tabela 16 – Proteínas em que se obteve uma identificação, por MALDI-TOF/MS, imediata de proteínas para a cultivar ‘Rebolão’.

Spot Numero de _entrada Nome da proteína Espécie Nome do _gene Peso molecular _{relativo (Da)} pI Mascot _{score coverage} MS Processo biológico

8 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea _sativa N/A 61321 5,7 133 24 Armazenamento de substratos nutritivos 9 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea _sativa N/A 61321 5,7 116 24 Armazenamento de substratos nutritivos 10 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea _sativa N/A 61321 5,7 100 18 Armazenamento de substratos nutritivos 11 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea _sativa N/A 61321 5,7 89 15 Armazenamento de substratos nutritivos

13 E3SEU0_CASSA Class I chitinase isoform 2 Castanea _sativa N/A 32797 9,4 70 28 Metabolismo de hidratos de carbono _{Metabolismo da quitina}

25 Q8LK20_CASCR Castanin Castanea _crenata N/A 70610 9,2 93 21 Armazenamento de substratos nutritivos

26 Q8LK20_CASCR Castanin Castanea _crenata N/A 70610 9,2 95 21 Armazenamento de substratos nutritivos

27 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea _sativa N/A 61321 5,7 104 16 Armazenamento de substratos nutritivos 28 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea _sativa N/A 61321 5,7 126 20 Armazenamento de substratos nutritivos 39 Q597L0_9ROSI Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase

large subunit

Castanea

seguinii rbcl 51506 6,1 99 18 Fixação de carbono e fotossíntese

Spot Numero de

entrada Nome da proteína Espécie

Nome do gene Peso molecular relativo (Da) pI Mascot score MS

coverage Processo biológico

124 Q8LK20_CASCR Castanin Castanea _crenata N/A 70610 9,2 72 13 Armazenamento de substratos nutritivos

131 Q8LK20_CASCR Castanin Castanea _crenata N/A 70610 9,2 75 15 Armazenamento de substratos nutritivos

136 Q8LK20_CASCR Castanin Castanea _crenata N/A 70610 9,2 69 10 Armazenamento de substratos nutritivos

140 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea _sativa N/A 61321 5,7 80 16 Armazenamento de substratos nutritivos 144 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea _sativa N/A 61321 5,7 118 24 Armazenamento de substratos nutritivos 158 R4IW40_CASSA 11S globulin isoform 3 Castanea _sativa N/A 61321 5,7 74 14 Armazenamento de substratos nutritivos

Os restantes spots para o qual existiu também identificação de sequências nucleotídicas mas não encontramos proteínas associadas serão mais tarde alvo de BLAST.

Relativamente à cultivar ‘Rebolão’ foram identificadas 4 proteínas diferentes, das quais duas intervêm no armazenamento de substratos nutritivos, outra intervêm na fixação do carbono, e por último outra que intervém no metabolismo de hidratos de carbono. Relativamente à cultivar ‘Judia’ foram identificadas três proteínas, das quais duas intervém no armazenamento de substratos nutritivos e uma que intervém na fixação do carbono.

A isorforma 3 da 11S globulina foi identificada nos spots 8, 9, 10, 11, 27, 28, 97, 140, 144 e 158 para a cultivar ‘Rebolão’ e nos spots A3, A6, A7, A9 e A39 para a cultivar ‘Judia’. A 11S globulina é a principal proteína nas sementes de castanha, e tem como função molecular o armazenamento de substratos nutritivos [79]. Esta é uma proteína oligomérica, com peso molecular relativo de 240 a 260 kDa, composta por pares subunidades A e B ligadas por pontes dissulfeto. Os seus elevados níveis de Asx (asparagina e ácido aspártico) e Glx (glutamina ou glutamato) e baixos níveis de aminoácidos sulfurados (metionina e cisteína) são característicos deste tipo de proteínas de reserva.

A proteína castanin identificada no spot A1 na cultivar ‘Judia’ e também nos spots 25, 26, 124, 131 e 136 na cultivar ‘Rebolão’ também tem como função molecular o armazenamento de substratos nutritivos. Esta proteína difere da isorforma 3 da 11S globulina também identificada tanto no peso molecular relativo, 70610-61321 kDa respectivamente, como no seu ponto isoeléctrico, 5,7-9,2.

Também foi identificada a isoforma 2 da quitinase classe 1 que intervém em diversos processos metabólicos como o metabolismo de hidratos de carbono, catabolismo de macromoléculas na parede celular e catabolismo da quitina. As quitinases têm sido descritas como muito abundantes nas sementes de castanha, e o domínio quitina-ligante que esta proteína possui têm sido associado, noutras proteínas, à actividade antifúngica [80]. Esta proteína têm sido, também, referida com uma reacção cruzada com o alergénio do latex (heveína) na síndrome de latex-fruta através do domínio Cas s 5 que se comporta como antigénio neste tipo de doentes [81].

A subunidade maior da ribulose -1,5- bifosfato carboxilase-oxigenase foi identificada nas duas cultivares em estudo. Na cultivar ‘Rebolão’ identificamos no spot 39, e na cultivar ‘Judia’ no spot A48, A49 e A50. Esta proteína está envolvida na fixação de carbono no ciclo de Calvin, processo pelo qual o carbono é incorporado em compostos orgânicos, e também na fotossíntese.

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Figura 20 – Géis de referência com marcação de spots onde se obteve uma identificação proteica. Do

lado esquerdo o gel referente à cultivar Judia e do lado direito o corresponde à cultivar ‘Rebolão’ Os

spots indicados com a seta vermelha apresentaram os péptidos onde ocorreu identificação após a

realização de BLAST.

A ferramenta BLAST permite comparar uma sequência nucleotídica em estudo com as sequências contidas nas bases de dados. Esta ferramenta é importante pois permite encontrar regiões de sequências similares, tanto a nível local como global. A variante utilizada neste trabalho foi o Blastx, uma vez que as sequências nucleotídicas vão ser alinhadas com sequências proteicas.

Várias sequências de nucleótidos foram identificadas por MALDI-TOF/MS, mas essas sequencias tinham proteínas associadas. Desse modo, a ferramenta de blast foi usada numa tentativa de encontrar melhores resultados. As próximas proteínas apresentadas são referentes a resultados positivos obtidos deste mesmo alinhamento.

A sequência 9577 from Patent WO2010046221, após realização do alinhamento, obteve uma correspondência para a proteína Cytosolic class I small heat-shock protein HSP17.5 (Figura 21). Este alinhamento obteve uma identidade de 100%. Esta proteína foi encontrada tanto na cultivar ‘Judia’ com os spots A53 e A58, como na cultivar ‘Rebolão’ nos spots 1 e 134. A Cytosolic class I small heat-shock protein HSP17.5 encontra-se em abundância nas sementes de castanha, chegando a níveis semelhantes aos das principais proteínas de reserva na castanha. Apresenta uma localização citosólica e possui actividade molecular de chaperona, estando envolvidas na tolerância ao stress térmico [80, 82].

Figura 21 – BLAST da sequência 9577 from Patent WO2010046221 obtida por MALDI-TOF/MS

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Dos restantes spots, em que as sequências nucleotídicas identificadas foram alvo de alinhamento com sequências de aminoácidos, obteve-se um excelente resultado para 4 spots, que é o caso relatado acima. O resultado de mais 7 alinhamentos realizados vão ser apresentados embora se tenha obtido uma baixa cobertura das sequências interrogadas nas bases de dados, estas coberturas revelam domínios proteicos conhecidos.

Nos spots A37, A47 da cultivar ‘Rebolão’ e 122, 137 da cultivar ‘Judia’, resultou um alinhamento das suas sequências com a proteína gag-pol, descrita na espécie Castanea mollissima. Este alinhamento cobre uma pequena parte da sequência interrogada no alinhamento. Possui dois domínios descritos, RNase H e Integrase catalytic. Estes domínios parecem intrevir na integração de DNA, processo em que um segmento de DNA é incorporado no interior de outro.

Para o spot A27 da cultivar ‘Judia’, resultou o alinhamento com uma proteina Starch synthase, chloroplastic/amyloplastic, descrita na espécie Citrus sinensis. Este alinhamento cobre uma pequena parte da sequência interrogada no alinhamento. Possui 2 domínios descritos, Glyco transf 5 e Glycos transf 1. Estes domínios estão relacionados com a biossíntese de amido, que é o polissacarideo de reserva mais importante nas plantas. A starch synthase catalisa a reacção: UDP-glucose + (1,4)-alpha-D-glucosyl(n) = UDP + (1,4)-alpha-D- glucosyl(n+1).

Para o spot A43 da cultivar ‘Judia’, resultou o alinhamento com uma proteína do gene B456 006G020800, descrita na espécie Gossypium raimondii. Este alinhamento cobre uma pequena parte da sequência interrogada no alinhamento. Possui um dominio descrito, Protein kinase. Este domínio está relacionado com a actividade de proteínas cinases, onde catalisam a fosforilação de um residuo de amioácido numa proteína alvo, geralmente de acordo com a reacção: proteína + ATP = fosfoproteína + ADP.

Para o spot A75 da cultivar ‘Judia’, resultou o alinhamento com a proteina NADH- ubiquinone oxidoreductase chain 4, descrita na espécie Trebouxia aggregata. Este alinhamento cobre uma pequena parte da sequência interrogada no alinhamento. Possui um dominio descrito, Proton antipó M. Este domínio está relacionados com a actividade de desidrogenase NADH, intervindo de catalisador da reacção de NADH + H+ _{+ ubiquinona = NAD}+ _{+ ubiquinol.}