Análise monodimensional

3.2.1. Extracção fraccionada das proteínas de reserva da castanha

Com o objectivo de obter material biológico (proteínas) que funcionasse bem para caracterização genotípica das diferentes cultivares recorreu-se a uma técnica de extracção diferencial das proteínas de reserva de acordo com a sua solubilidade, permitindo a separação de fracções proteicas solúveis em água, solução salina, alcoólica e alcalina com posterior diálise. O protocolo de extracção utilizado por Collada e colaboradores [43] foi utilizado com algumas modificações, como por exemplo, a eliminação do processo inicial de remoção de lípidos, uma vez que a castanha apresenta baixos níveis dos mesmos (Figura 5).

Foram pesados 1,5 g de farinha de cada amostra de castanha para um falcon e foi extraído três vezes consecutivas com solução salina (NaCl 0,5M) numa relação 10:1 (v/p) a 4ºC, com agitação durante 1 hora, centrifugando-se a 30.000g, durante 20 minutos a 4ºC. No fim de cada centrifugação separou-se o sobrenadante para um novo falcon. O sobrenadante obtido na extracção salina sofreu diálise contra água para remover o sal e precipitar as globulinas, realizando novamente uma centrifugação a 30.000g, durante 20 minutos a 4ºC. Transferiu-se o sobrenadante, que continha as albuminas, para um novo falcon, permanecendo o precipitado no mesmo. Estas amostras foram desidratadas por liofilização.

O precipitado obtido na extracção salina foi extraído três vezes consecutivas com solução alcoólica (Isopropanol 55%, 2-Mercaptoetanol 2%) numa proporção de 10:1 (v/p) à temperatura ambiente, com agitação durante 1 hora, centrifugando-se a 30.000g, durante 20 minutos à temperatura ambiente. No fim de cada centrifugação o sobrenadante foi transferido para um falcon novo, sofrendo posterior diálise contra água e posterior desidratação por liofilização.

O precipitado obtido na extracção alcoólica foi extraído 3 vezes consecutivas com solução alcalina (Tetraborato de Sódio 0,012M pH 9, 2-mercaptoetanol 2%, SDS 0,5%) na proporção de 10:1 (v/p), a 60ºC, com agitação, durante 30 minutos. No fim centrifugou-se o falcon a 30.000g, à temperatura ambiente, durante 20 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo falcon e foi liofilizado contra água e posteriormente desidratado por liofilização. O precipitado obtido na extracção alcalina foi descartado.

Figura 5 – Extracção sequencial das proteínas de reserva da castanha (Adaptado de Collada e

colaboradores, 1986 [43]).

As fracções proteicas obtidas da liofilização foram solubilizadas em solução C com 1% DTT com uma proporção 1:50 (p/v), para serem usadas posteriormente na electroforese monodimensional.

3.2.2. Electroforese monodimensional do tipo SDS-PAGE

A electroforese monodimensional do tipo SDS-PAGE permite a análise das proteínas de reserva de alta e baixa massa molecular relativa. O protocolo usado tem por base a metodologia descrita por Singh e colaboradores [67] com algumas modificações, nomeadamente a utilização de um gel sem gradiente de concentração de acrilamida (concentração constante), o grau de porosidade e a temperatura de migração. A metodologia apresenta algumas condicionantes como a necessidade de utilizar material calibrado, introduzir o gel imediatamente após a adição dos catalisadores, ter especial atenção ao sentido da ligação dos geradores e monitorização obrigatória do momento da saída da frente de migração do gel.

A montagem de placas para electroforese foi realizada mediante a metodologia descrita por Igrejas [68]. Os elementos envolvidos na montagem e necessários para a migração encontram-se ilustrados na Figura 6.

Figura 6 – Placas e elementos do sistema da tina de electroforese vertical. A) Tampa da tina; B)

Tina de electroforese; C) Bandeja superior; D) Nível; E) Pente; F) Parafusos; G) Espaçador; H) Braçadeira; I) Vidros; J) Suporte; K) Dispositivo de refrigeração. (Fonte: Igrejas, 1996 [69]).

Inicialmente procedeu-se à preparação de um gel SDS-PAGE de 16x18 cm, 1 mm de espessura e de 15 poços. A Tabela 8 apresenta as quantidades necessárias das soluções para a preparação do gel de separação para as proteínas de reserva de alta e baixa massa molecular relativa, tendo sido utilizado a concentração de T: 12,52% e C: 0,97%.

Após a mistura dos primeiros quatro reagentes, a solução foi depositada num kitasato selado e com a ajuda de uma bomba de vácuo procedeu-se à desgaseificação durante 10 minutos. Após a desgaseificação adicionaram-se os restantes reagentes pela ordem apresentada na Tabela 8. O TEMED deve ser adicionado à solução com a ponta da micropipeta e ressuspendido, para uma melhor polimerização. A solução foi transferida para um copo e com o auxílio de uma seringa depositou-se nas placas de electroforese, deixando uma margem de 3 cm até ao topo, para que posteriormente seja também depositado o gel de concentração. Após a deposição da mesma, são adicionados 180 μl de butanol ao longo da sua superfície, de modo a prevenir a formação de novas bolhas de ar. Enquanto ocorria a polimerização do gel de separação, ordenaram-se as amostras por ordem de inserção e preparou-se um registo para as amostras e condições de migração. Verificou-se a polimerização do gel e preparou-se o gel de concentração a ser adicionado superiormente ao gel de separação (T = 2,88 e C = 1,42%) (Tabela 9), em que os passos necessários para a realização deste gel foram idênticos ao gel de separação.

Antes que ocorra a polimerização do mesmo, foi introduzido um pente de 15 poços. Após a polimerização do gel, retirou-se o pente e lavaram-se os poços três vezes. Antes de proceder à deposição das amostras, estas foram pré aquecidas na estufa a 70ºC e centrifugadas durante 5 minutos, a 10.000 rpm. Depositou-se aproximadamente 10 μl de amostra por poço. Colocou-se a bandeja superior na tina de electroforese. Cobriu-se a bandeja com tampão de electroforese, ligando-a depois a uma fonte de alimentação. As condições de migração são de 30 mA/gel a 14 °C. A migração foi parada no momento em que a frente de migração saiu das placas.

Tabela 8 – Preparação dos géis de separação (T: 12,52% e C: 0,97%).

1 gel 2 géis 4 géis 6 géis

Acrilamida 40% _{7,655 ml 15,31ml 30,62 ml 45,93 ml}

Bisacrilamida 2% _{1,5 ml 3 ml 6 ml 9 ml}

Água bidestilada _{5,25 ml 10,5 ml 21 ml 31,5 ml}

Tampão Tris-HCL pH 8.8 _{9,4 ml 18,8 ml 37,6 ml 56,4 ml} Desgaseificação (com bomba de vácuo)

SDS 10% _{0,25 ml 0,5 ml 1 ml 1,5 ml}

APS 1% _{0,625 ml 1,25 ml 2,5 ml 3,75 ml}

TEMED _{12,5 ul 25 ul 50 ul 75 ul}

Tabela 9 - Gel de concentração (T: 2,88% e C: 1,42%).

1 gel 2 géis 4 géis 6 géis

Acrilamida 40% 0,84 ml 1,68 ml 3,36 ml 5,04 ml

Bisacrilamida 2% 0,245 ml 0,49 ml 0,98 ml 1,47 ml

Água bidestilada 8,67 ml 17,34 ml 34,68 ml 52,02 ml

Tampão Tris-HCL pH 8.8 1,405 ml 2,81 ml 5,62 ml 8,43 ml Desgasificação (com bomba de vácuo)

SDS 10% 0,1 ml 0,2 ml 0,4 ml 0,6 ml

APS 1% 0,5 ml 1 ml 2 ml 3 ml

TEMED 11,25 ul 22,5 ul 45 ul 67,5 ul

Tempo de Polimerização: aproximadamente 45 minutos.

3.2.3. Coloração com Azul de Coomassie R250

Após o término da migração, os géis foram colocados numa tina com cerca de 400 ml (por gel) de solução de Coomassie R250, durante pelo menos 24 horas e em agitação. Seguidamente, descoraram-se os géis em água destilada em agitação durante no mínimo 16 horas. Na manhã seguinte, transferiram-se os géis para uma solução TCA a 6%, onde permaneceram entre 4 a 5 horas. Depois, colocaram-se numa solução de glicerol a 5 %, onde permaneceram pelo menos 1 a 2 horas. Se não for necessário a excisão das bandas, devem-se colocar os géis entre duas folhas de papel celofane, previamente embebidas na solução de glicerol a 5% e deixando-os secar em placas de vidro.

3.2.4. Análise estatística

A análise dos diferentes perfis electroforéticos foi realizada através de um software informático, o Phoretix 1D Pro (http://www.totallab.com/products/1d/). Através desse software foi possível analisar todos os perfis monodimensionais com o mesmo critério e ainda compará-los entre si.

Devido à ausência de um sistema de nomenclatura para os alelos das proteínas de reserva da castanha, as diferentes bandas proteicas foram identificadas de acordo com a sua mobilidade electroforética: banda 1 para a banda de menor mobilidade electroforética

e maior massa molecular relativa, banda 2 para a seguinte e seguindo esta ordem para as restantes. A similaridade genética entre as cultivares de Castanea sativa Mill. foi calculada de acordo com o modelo descrito por Nei [70, 71] e Wright [72]. A presença/ausência de cada alelo foi pontuada numa matriz binária (Anexo 5 e 6).

Os genótipos foram agrupados segundo uma análise de clusters de acordo com a sua relação usando o método de ligação média (UPGMA, Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) no software NTSYS-pc, version 2-10a [73].