Monitorização da diversidade genética através de marcadores proteicos

Os recursos genéticos vegetais representam a base para o desenvolvimento da agricultura e um reservatório da adaptação genética que actua como um tampão contra as alterações ambientais. Eles fornecem material em bruto que, quando usados de maneira correcta, produzem novas e melhores cultivares, e são uma fonte insubstituível de características como resistência a doenças e pragas, adaptação a diferentes ambientes e maiores produtividades [28, 29].

No que respeita ao castanheiro europeu, que se observa como uma espécie largamente difundida e que tem sido cultivada pelo Homem por um longo período de tempo, a sua variabilidade genética tem sido fortemente reduzida nas populações naturais, bem como nos povoamentos cultivados. Tal deve-se às perturbações ambientais, bem como aos fortes ataques dos parasitas a que está sujeito, nas últimas décadas [30].

Neste sentido, acresce a necessidade de programas que façam a monitorização da biodiversidade e projectem a sua preservação e exploração tecnológica e económica, pois impedir a perda da mesma deve ser um objectivo para a sociedade.

Qualquer “sinal”, desde um fenótipo, um fragmento DNA, uma proteína, cuja presença num conjunto de genótipos se manifesta como polimórfica é considerada como marcador genético, sendo susceptível de ser utilizado em combinação com outros marcadores, como característico de um determinado genótipo [31].

Solanille [32] classificou os marcadores genéticos em quatro grupos: morfológicos, bioquímicos, moleculares e citogenéticos. De acordo com Lefebvre e Chèvre [33] marcadores genéticos podem agrupar-se em dois grandes grupos: marcadores morfológicos e marcadores moleculares. Dentro destes últimos podem distinguir-se os marcadores bioquímicos (proteínas enzimáticas ou não enzimáticas) e marcadores de

DNA que podem ser obtidos mediante hibridação do DNA e baseados nas técnicas de reacção em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction).

As proteínas de reserva (proteínas não enzimáticas) têm sido utilizadas como importantes marcadores genéticos em várias espécies, devido ao seu elevado polimorfismo, o controlo genético simples, a sua independência ambiental e uma análise de resultados fácil, rápida e económica [34].

A análise de alelos de proteínas de reserva é bem conhecida por ser uma ferramenta robusta na genotipagem dos recursos genéticos, nomeadamente em cereais, como o trigo [35].

Apesar de outros métodos, tais como a PCR, poderem fornecer ferramentas interessantes em estudos de genotipagem de recursos genéticos, a utilização de electroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS- PAGE, Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis) continua a ser um método valioso, eficiente e económico para a identificação de alelos e distinção de genótipos [35].

A SDS-PAGE é um método de separação de proteínas de acordo com a sua massa molecular relativa, onde as amostras proteicas migram em géis com uma matriz de acrilamida pela aplicação de um campo eléctrico. Nesta técnica as amostras são tratadas com SDS, que tem como objectivo a desnaturação das proteínas e indução de carga negativa, pois estas são anfotéricas, ou seja, o seu pH varia consoante o meio onde estão inseridas. Após este processo, é possível visualizar e identificar as proteínas separadas em bandas pela diferença de massa molecular relativa através da coloração dos géis [36]. Assim, de forma a avaliar a diversidade genética do castanheiro europeu, uma possível abordagem passa pela utilização de proteínas como potenciais marcadores de diversidade genética.

As proteínas de sementes foram classificadas, empiricamente, de acordo com a sua solubilidade e extracção numa série de solventes [37]: albuminas, solúveis em água; globulinas, solúveis em soluções salinas (NaCl a 10% frequentemente usado), mas insolúveis em água; prolaminas, solúveis em etanol a 70% e as glutelinas insolúveis em todas as soluções anteriores, mas solúveis em ácido acético a 0,1M.

Este tipo de classificação ainda hoje é mantido apesar de terem sido incorporadas algumas mudanças no procedimento de extracção sequencial, nomeadamente a adição de um agente redutor (2-mercaptoetanol) para a extracção das prolaminas e a adição de um detergente (geralmente o SDS) e um agente redutor para a extracção das glutelinas [38].

Uma classificação mais recente divide as proteínas de sementes em proteínas de reserva, proteínas estruturais e proteínas biologicamente activas [39].

As proteínas de reserva têm como função biológica fornecer um reservatório de nutrientes essenciais. As proteínas de reserva atingem valores elevados do azoto total da semente, onde se encontra a maior acumulação. São estas as proteínas sintetizadas durante a formação da semente e permanecem estáveis desde a maturação até ao momento da germinação, sendo posteriormente degradadas, funcionando como fonte de carbono, enxofre e azoto para o crescimento das plântulas [40, 41].

As proteínas de reserva mais estudadas dizem respeito a espécies de angiospérmicas pertencentes à família Poaceae (gramíneas) e Fabaceae (leguminosas), salientando que o teor total de proteínas nas sementes em matéria seca varia desde 7% a 38%, respectivamente. Já as espécies de Fagaceaes possuem valores que variam entre 5% a 28%, apresentando a espécie em estudo valores de cerca de 5% (Tabela 6).

Dentro da família Fagaceae existem diferenças nas proteínas de reserva para os diferentes géneros, enquanto em F. sylvaica e Castanea as principais proteínas de reserva são as globulinas, em Quercus estas aparecem em valores muito baixos sendo neste caso as glutelinas as proteínas de reserva [42].

No caso da espécie C. sativa as globulinas são as principais proteínas de reserva com valores de cerca 46,9% da proteína total. Comparando C. sativa com C. crenata, as globulinas demonstram grande heterogeneidade. C. sativa apresenta os seus principais componentes com massa molecular relativa de cerca de 25 kDa e pI próximo de 8,5 [43]. As percentagens das fracções proteicas para o total de proteína presentes na semente são cerca de 21,1% para as albuminas, 29,9% para as glutelinas e 2,1% para as prolaminas (Tabela 6).

Tabela 6 – Conteúdo proteico, em percentagem do peso total e de diferentes fracções proteicas,

das sementes de espécies das famílias Fagaceae, Fabaceae e Poaceae.

Família Espécie Proteína

(% peso seco)

Fracções proteicas (% da proteína total) Albuminas Globulinas Prolaminas Glutelinas

Fagaceae [42, 43] C. sativa 5 21 47 2 30 C. crenata 7 24 44 3 30 F. sylvaica 27 15 77,4 1,2 6 Q. róbur 5 1 - 99 Poaceae [44, 45] Triticum aestivum 10-15 3-5 10-15 50-65 10-20 Avena sativa 8-14 1 60-65 10-15 25-30

Zea mays 7-13 Vestígios 5-6 65-70 15-20

Fabacea [46]

P. sativum 22,5 21 66 - 12

Glycine max 38 10 90 - 0

Estudos anteriores foram realizados com sucesso no uso de proteínas de reserva para avaliar a diversidade genética em Castanea sativa Mill., nomeadamente através da análise de albuminas [47] e globulinas [34].