Ferramentas Proteómicas

1.5.1. Técnicas de separação proteica

Existe uma variedade de processos de separação de proteínas que têm sido utilizados previamente a uma análise por espectrometria de massa (MS). A separação de proteínas pode ser realizada consoante a sua carga eléctrica, a sua massa molecular relativa ou a sua afinidade com um substrato. A electroforese tem sido dos processos mais utilizados e melhor adaptados, assim como a cromatografia líquida.

A electroforese em gel poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) é uma técnica que se baseia na separação das proteínas através da sua massa molecular relativa. SDS-PAGE é o meio de separação mais utilizado em proteómica, devido à sua elevada capacidade de separar grandes quantidades de proteínas [52]. Nesta metodologia é utilizado o SDS, um detergente, responsável pela quebra de pontes de hidrogénio e eliminação de interacções hidrofóbicas, permitindo a estabilização das proteínas na sua forma desnaturada. Os polipéptidos adquirem carga negativa conferida pelas moléculas de SDS, tornando-se passíveis de migração ao longo de um gel de poliacrilamida quando exercida uma corrente eléctrica. Os péptidos com maior massa molecular ficam retidos mais cedo no gel e os de menor massa ficam depositados no fundo do gel [53]. A grande desvantagem desta técnica é o limite de resolução, visto que o excesso de bandas podem levar à sua sobreposição, dificultando a sua interpretação. A SDS-PAGE é por isso mais eficiente na análise de um reduzido número de proteínas [54]. A SDS-PAGE quando combinada com a focalização isoeléctrica (IEF) representam uma forte ferramenta de análise de misturas de proteínas extraídas de uma

amostra biológica, pois permite a separação das proteínas pelo seu ponto isoeléctrico (1ª dimensão) e permite também a separação pela sua massa molecular relativa (2ª dimensão), electroforese bidimensional (IEF x SDS-PAGE ou 2-DE) [53]. Esta técnica foi descrita inicialmente por O’Farrell [55] e a base do seu elevado poder de resolução são precisamente as duas dimensões, ou seja, as proteínas serem separadas sequencialmente por dois critérios físicos.

A focalização isoeléctrica requer a utilização de anfólitos por ser um método com capacidade de separar as proteínas de acordo com o ponto isoeléctrico. Uma vez que as proteínas são moléculas anfotéricas, estas podem apresentar diferentes cargas dependendo da sua composição em aminoácidos e do pH que as rodeia. Consoante a relação do pH do tampão com o pI da proteína, esta move-se ou permanece na fase estacionária (pH=pI) [53]. O ponto isoeléctrico de uma proteína é o valor específico de pH em que a carga eléctrica líquida da proteína é zero, de modo a estabilizar através da aplicação de um campo eléctrico [56]. A presença de um gradiente de pH é por isso essencial na focalização isoeléctrica, pois vai permitir que as proteínas se movam para a posição do gradiente onde a sua carga é zero, quando aplicado um campo eléctrico. A focalização isoeléctrica é realizada ainda na presença de ureia, detergentes iónicos e ditiotreitol (DTT). A ureia é responsável pela quebra das ligações de hidrogénio, no entanto não afecta a carga eléctrica intrínseca das proteínas.

Tanto para os géis monodimensionais ou bidimensionais existe uma variedade de métodos para a sua coloração, e respectiva marcação das proteínas, sendo o azul de Coomassie e o nitrato de prata os mais utilizados. As vantagens do azul de Comassie em relação ao nitrato de prata são, essencialmente, a sua simplicidade de execução e compatibilidade com os protocolos de espectrometria de massa, enquanto que o nitrato de prata apesar de possuir um maior limite de detecção revela incompatibilidades com alguns protocolos de MS [57]. As limitações desta técnica estão relacionadas com problemas de resolução e de reprodutibilidade na separação de determinadas proteínas, como é o caso de proteínas muito ácidas ou muito básicas, apresentando problemas na solubilização [58].

1.5.2. Espectrometria de massa

Nas últimas décadas, a espectrometria de massa tornou-se uma das técnicas mais preponderantes na detecção e caracterização de proteínas [51]. A espectrometria de massa tem sido considerada um dos pilares da proteómica. Apresenta uma elevada capacidade na identificação proteica com base em fingerprints de massa peptídica e sequências de aminoácidos, apresenta uma elevada sensibilidade na detecção proteica, bem como elevada capacidade de throughput e integração com métodos quantitativos de identificação de proteínas diferencialmente expressas [51].

A espectrometria de massa é composta por três unidades funcionais: uma fonte de iões que ioniza e transfere as moléculas até à fase de gás, um analisador de massa que separa os iões de acordo com uma razão massa/carga (m/z) e um detector que capta e transforma o sinal em corrente eléctrica, onde a extensão do sinal eléctrico em função da razão m/z é convertida por um processador de dados, dando origem a um espectro de massa correspondente [59]. O analisador de massa é ponto fulcral da tecnologia. Os principais parâmetros da espectrometria de massa, no contexto da proteómica, são: a sensibilidade, resolução, precisão de massa e a capacidade em gerar espectros de massa ricos em informação.

Ao longo dos anos foram sendo desenvolvidos diferentes métodos clássicos de ionização, destacando-se a ionização química e o impacto de electrões. A ionização por electrodifusão (ESI) e a ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) são as duas técnicas de ionização mais utilizadas em espectrometria de massa. Ambas as técnicas permitem a passagem das amostras da fase condensada para a fase gasosa por ionização, mas de acordo com princípios diferentes, visto que no ESI os péptidos ionizados são gerados a partir de uma fase líquida, enquanto no MALDI os péptidos ionizados são gerados a partir de uma matriz sólida [59, 60].

Actualmente existem quatros tipos de analisadores de massa usados em estudos proteómicos: ion trap, time-of-flight (TOF), quadropole e Fourieir transform ion cyclotron (FT-MS).

1.5.2.1. Identificação das proteínas utilizando MALDI-TOF/MS

A espectrometria de massa por MALDI é uma ferramenta analítica para péptidos, proteínas e muitas outras biomoléculas, muito difundida. Na análise por MALDI- TOF/MS, inicialmente o analito é co-cristalisado com uma matriz apropriada, com a capacidade de absorver a luz UV do laser. Uma matriz de MALDI tem de obedecer a dois propósitos fundamentais, capacidade de absorver a energia dos fotões procedentes do laser e transferi-la como energia de excitação para o sistema funcionar como solvente da amostra, reduzindo as forças intermoleculares e impedindo a agregação das moléculas do analito [61].

A mistura matriz-analito recebe um feixe de laser pulsado, ionizando indirectamente as moléculas. O feixe de laser foca apenas uma porção da matriz, de modo a prevenir a destruição da amostra e para aumentar a sensibilidade [62]. As moléculas da matriz são excitadas por ressonância, absorvendo essa energia proveniente do laser e transferindo-a para o analito acidificado, através de um processo de protonação (a matriz transfere os protões acídicos). Consequentemente, a excitação electrónica das moléculas da matriz que absorvem a energia do laser, provoca a dessorção da matriz e dos iões [M+H]+ _{do analito para o estado gasoso, voando até ao analisador por um tubo, em vácuo.} Esta ionização necessita de várias centenas de disparos do laser para alcançar uma razão de signal-to-noise plausível [63]. O analisador de massa TOF determina razões de massa por carga, separando os iões de acordo com a diferença de tempo entre o sinal de partida (ponto de formação) e o pulso gerado quando o ião atinge o detector (ponto de detecção), denominando-se tempo de voo (TOF) [64]. A aplicação de um campo electroestático a um material ionizado gera um ião com carga (z) e com aceleração, suportando o tempo de voo neste princípio. Os iões movem-se no tubo de vácuo dependendo exclusivamente da energia cinética do passo de aceleração [62]. O tempo de voo exigido para chegar ao detector é dependente da massa (m) e carga (z) do analito e é proporcional à raiz quadrada m/z. Assim sendo, quanto mais rápido e leve for o ião, mais rápido atinge o detector, e consequentemente, menor é o seu tempo de voo. Os analitos com m/z diferentes que compõem a amostra complexa são separados, de acordo com o seu tempo de voo, criando um espectro de massa caracterizado pelo m/z e a intensidade dos iões. Normalmente, o MALDI produz iões com carga única (z=1), demonstrando que o m/z de um analito corresponde ao valor da sua massa [65].

Como resultado da sua simplicidade, excelente precisão de massa, alta resolução, sensibilidade e tolerância a contaminantes, o MALDI-TOF seve para identificar proteínas, por aquilo que é conhecido como mapeamento de péptidos, também referido como peptide mass fingerprinting. Neste método, as proteínas são identificadas pela correspondência entre uma lista experimental de massas peptídicas e uma lista de todas as massas calculadas de cada péptido através do acesso a uma base de dados específica, ou seja, massas obtidas no passo anterior são comparadas com bases de dados proteicas. É de salientar que esta técnica é relativamente rápida e permite a obtenção de uma grande quantidade de dados em pouco tempo, partindo de uma quantidade reduzida de amostra [66].