Electroforese bidimensional do tipo IEF x SDS-PAGE

Na electroforese bidimensional as proteínas foram separadas de acordo com o seu ponto isoeléctrico (pI) por focalização isoeléctrica (IEF), na primeira dimensão, e de acordo com sua massa molecular relativa por meio de electroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE), na segunda dimensão. Desta separação

resulta um mapa bidimensional – proteoma – e cada spot deverá corresponder a um conjunto de péptidos iguais.

Na primeira dimensão os péptidos são organizados em tiras de gel IPG (Immobilized pH Gradients) segundo o seu ponto isoeléctrico. Assim, inicialmente as tiras de gel IPG devem ser rehidratadas, seguindo-se então a focalização isoeléctrica e a equilibração das mesmas.

3.4.3.1. Rehidratação tiras de gel IPG

As tiras de gel IPG utilizadas nesta metodologia foram Immobiline DryStrip pH 3-10 de13 cm da GE Healthcare. Com o objectivo de serem submetidos à focalização isoeléctrica, as tiras de gel IPG desidratados foram rehidratados durante cerca de 16 horas, overnight, com DeStreak Rehydration solution (GE Healthcare). A utilização de DeStreak Rehydration solution aumenta a reprodutibilidade e qualidade dos géis 2D prevenindo a formação de streaks e eliminando spots extra causados pela oxidação não especifica das proteínas.

Foram depositados 250 μl de solução Destreak Rehydratation na ranhura do suporte (reswelling tray). As tiras de gel IPG foram colocadas voltadas para baixo em cima da solução nas ranhuras do suporte, eliminando as bolhas que possam surgir. As strips foram cobertas com 2,5 a 3 ml de parafina (dry strip cover fluid, Amersham) e deixou-se em contacto durante a noite.

3.4.3.2. Focalização com IPGphor

A focalização isoeléctrica foi realizada num IPGphor com um programa previamente definido (Tabela 12) e tem com objectivo a separação das proteínas sobre um gradiente de pH em função do seu pI.

Tabela 12 – Parâmetros específicos da focalização isoeléctrica.

Características da focalização

Temperatura 20ºC

Corrente máxima 50 μA por tira de gel

Voltagem máxima 7000 V

Fase Duração Voltagem esperada

Gradiente 2 h 500 V

Gradiente 3 h 1000V

Gradiente 3 h 3000 V

Gradiente 3 h 7000 V

Step 5:10h 7000 V

Para um correcto e eficaz funcionamento da focalização isoeléctrica, depois da rehidratação, as tiras de gel foram lavadas 2 vezes com água desionizada e secas sobre papel absorvente para eliminar os resíduos de parafina. De seguida, cobriu-se o prato de cerâmica do IPGphor com 100 ml de parafina e colocaram-se as tiras de gel voltadas para cima, fazendo-as deslizar sobre a parafina (lado - para o cátodo e lado + para o ânodo). Seguidamente, humedeceram-se duas mechas de papel de filtro por tira de gel (tamanho 4 x 10 mm) com água desionizada, e aplicou-se nos extremos do ânodo e cátodo da tira de gel IPG. Posicionaram-se os eléctrodos contra as mechas sobre as tiras de gel e verificou-se a conexão do eléctrodo sobre a parte dourada do suporte. Colocou-se o cup- loading na extremidade anódica e procedeu-se ao depósito de 150 μl de amostra com a concentração de 1 μg de proteína por 1 μl de solução de solubilização.

3.4.3.3. Equilibração das tiras de gel IPG

Antes da separação por electroforese dos péptidos, na segunda dimensão, as tiras de gel IPG foram submetidas a um processo de equilibração que permite a separação completa dos péptidos por interacção com o SDS.

O protocolo utilizado neste trabalho prático consiste na incubação das tiras de gel IPG durante períodos de 15 minutos em duas soluções, tendo na sua base de constituição

Tris-HCl (pH 8,8) 50 mM, 2% (p/v) SDS, 6% ureia e 30% (p/v) glicerol. A primeira solução de equilibração é aplicado de forma a reduzir as proteínas presentes nas tiras de gel IPG, sendo para isso acrescentado 1% (p/v) DTT 1% à solução base. A segunda solução de equilibração contém iodoacetamida 4% (p/v), actuando como agente alquilante sobre o DTT livre, impedindo a sua migração, reacção conhecida point- streaking [56]. A iodoacetamida é também responsável pela alquilação de grupos sulfídricos e previne a re-oxidação. Este procedimento simplifica a preparação da amostra biológica para identificação de spots através de espectrometria de massa [56, 68].

O procedimento para a realização desta metodologia consistiu em preparar a solução de equilibração base, 20 ml por tira de gel focalizada. De seguida dissolveu-se o 100 mg de DTT em 10 ml da solução anterior e adicionou-se 50 μl de azul bromofenol. Depois colocaram-se as tiras de gel focalizados em tubos individuais, e adicionaram-se 10 ml do tampão de equilibração com DTT a cada tubo. Estes foram selados com parafilme e colocados num agitador de rolos a baixa rotação. Passado 15 minutos removeu-se a solução anterior. Seguidamente, dissolveu-se 0,4 g de iodoacetamida em 10 ml de tampão de equilibração base e adicionou-se 50 μl de azul bromofenol. A solução anterior foi adicionada aos tubos e voltou a selar-se, sendo mantidos durante 15 minutos em agitação. Após a remoção da solução anterior, as tiras de gel foram lavadas em tampão de electroforese, e procedeu-se à electroforese, SDS-PAGE.

3.4.3.4. Gel 2-DE

A electroforese SDS-PAGE utilizada na segunda dimensão apresenta condições similares às usadas nos géis monodimensionais, tendo o objectivo de separar as proteínas por massa molecular relativa. O procedimento utilizado foi o similar ao já descrito para a preparação dos géis de acrilamida 1-DE, com ligeiras modificações. O gel de separação é colocado até 0,5 cm do topo dos vidros, e o gel de concentração é substituído por agarose a 1,5%.

Assim, após a polimerização do gel de separação e depois da equilibração das tiras de gel focalizadas, estas foram cortadas à medida da do gel de separação e foram introduzidas entre os vidros, pressionando com uma espátula de forma a entrar em contacto com o gel de separação. De seguida, adicionou-se 0,15 g de agarose a 10 ml de tampão de electroforese e aqueceu-se no microondas cerca de 10 segundos, deixou-se

arrefecer ligeiramente e cobriu-se a tira de gel até o topo dos vidros. Depois montou-se a bandeja superior da tina de electroforese e introduziram-se os géis na tina, adicionando- se tampão de electroforese. A tina de electroforese foi ligada à fonte de alimentação. A corrida electroforética iniciou-se com uma amperagem de 15 mA por gel a 14 ºC, até à entrada da frente de migração no gel de separação, aproximadamente meia hora. Após essa hora a fonte de alimentação foi regulada para 30 mA. A corrida demorou cerca de 2,5 a 3h até à frente de migração sair do gel das placas.

3.4.3.5. Coloração com Coomassie G-250

Após o término da migração dos péptidos, os géis foram colocados num recipiente com 400 ml de solução de fixação (40% metanol e 10% de ácido acético), durante uma hora com leve agitação. Depois substituiu-se a solução de fixação por solução de azul de Coomassie G-250 e mante-se em agitação overnight. A descoloração foi realizada com solução de descoloração (20% metanol) durante 1h e com agitação, repetindo o passo mais 2 a 3 vezes.

3.4.3.6. Aquisição digital da imagem do gel

Após a descoloração do gel procedeu-se à captura de imagem digital dos géis através do software Image Master (Amersham Biosciences). De seguida utilizou-se o software SameSpots (Totallab) para seleccionar os spots de interesse, que neste caso foram todos os spots presentes uma vez que pretendemos identificar através da espectrometria de massa o maior número de péptidos.

3.4.3.7. Excisão dos spots

Uma vez seleccionados os spots de interesse procedeu-se à excisão dos spots. O gel 2-DE foi colocado sobre um transiluminador e utilizando pontas de micropipetas, devidamente seccionadas de acordo com o tamanho do spot pretendido, cada spot foi

recolhido e armazenado num eppendorf devidamente identificado. Os eppendorfs com os spots foram devidamente armazenados numa arca -20ºC.