5. Resultados
5.1. Análise das comunidades de arqueias de solos de mata nativa versus área cultivada
5.2.2. Análise da Correlação Entre os Dados Químicos e Filogenéticos
Foi realizada a Análise de Componentes Principais (ACP) dos três grupos estudados, com suas réplicas biológicas (Figura 16). Na primeira ACP das nove amostras, as quais representam os três grupos estudados (grupo 0: amostras 0.1.1, 0.2.1 e 0.3.1; grupo 5: amostras 5.1.1, 5.2.2 e 5.3.1 e grupo 8: amostras 8.1.2, 8.2.2 e 8.3.1) e suas correlações com os dados químicos, a correlação entre os eixos x e y foi de 99,9%; onde o eixo vertical capaz de explicar 99% das posições dos pontos no gráfico em questão (figura 16a). Foi possível observar que o ponto 5.3.1, pertencente ao grupo 5, se encontrou mais distante de todos os demais em relação aos dados químicos, estando os demais pontos mais próximos entre si. Em relação à ACP das nove amostras e suas correlações com a filogenia em nível de gênero, a correlação entre os eixos foi de 87,52%; sendo o eixo x capaz de explicar 68,29% das posições dos pontos do gráfico (figura 16b). Foi possível observar que apenas as amostras do
grupo 0 se mantiveram mais próximas entre si, estando as amostras dos grupos 5 e 8 distantes entre si. Os agrupamentos de sequências classificadas como os gêneros metanogênicos Rice
Cluster I e Metanosarcina e as AOAs Ca. Nitrosotalea e Ca. Nitrososphaera respondem pelas
maiores diferenças entre as amostras (Figura 16b).
5.2.3. Curvas de Rarefação
Foram elaboradas curvas de rarefação das amostras com um cutoff de 97% (Figura 17). As curvas foram normalizadas para 34.177 sequências.
Figura 16 - ACP das nove amostras pertencentes aos três grupos estudados com (a) os dados químicos e (b) classificação filogenética em nível de gênero, por Past.
a)
O Grupo 8 está mais distante de alcançar um platô, seguido do Grupo 5, enquanto que o Grupo 0 teve maior cobertura de sua diversidade.
Figura 17 – Curvas de rarefação das OTUs e sequências classificadas em nível de gênero de arqueias (cutoff 97%) encontradas nos grupos 0 (azul), 5 (vermelho) e 8 (verde), por MOTHUR.
5.2.4. Índices de Riqueza e Diversidade
Os índices de riqueza (Chao1 e ACE) e diversidade (Simpson invertido e Shannon) para os grupos 0, 5 e 8, assim como a cobertura de Good e o número de OTUs observadas foram calculados a partir das sequências normalizadas (Tabela 8). Os mesmos cálculos foram feitos antes da normalização (Tabela 14 – Anexo E).
Tabela 8 – Número de OTUs observadas, índices de riqueza (Chao 1 e ACE) e diversidade (Simpson invertido e Shannon) e cobertura de Good para os grupos 0, 5 e 8.
Amostra OTUs
observadas
Cobertura de Good
(%)
Chao1 ACE InvSimpson Shannon
Grupo 0 206 99,77 327 502 14,83 3,26
Grupo 5 226 99,72 416 608 14,94 3,23
Grupo 8 319 99,53 699 1.348 30,18 3,82
Em concordância com as curvas de rarefação, o Grupo 0 apresenta a maior cobertura, seguido do Grupo 5, segundo a cobertura de Good. O grupo 8 obteve maior número de OTUs observadas, seguido do grupo 5. Os índices de riqueza Chao1 e ACE preveem um número de OTUs bem superior ao que foi encontrado, em especial para o Grupo 8, entretanto, a cobertura de Good mostra que o esforço amostral foi suficiente para englobar a diversidade
0 50 100 150 200 250 300 350 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 O TU s Sequências
dos três grupos. Os índices de diversidade de Shannon e Simpson invertido também apontam para uma maior diversidade do grupo 8 (Tabela 8).
5.2.5. Análises Filogenéticas
Foram organizadas em tabela todas as OTUs classificadas nos grupos a 97% de similaridade, evidenciando as diferenças entre as riquezas de arqueias dos grupos, assim como as abundâncias de cada nível filogenético (Tabela 9). Todas as OTUs encontradas foram classificadas dentro do domínio Archaea.
Tabela 9 – OTUs encontradas após a classificação das sequências em 97% de similaridade nos grupos 0, 5 e 8.
Taxlevel RankID* Taxon Grupo
0 Grupo 5 Grupo 8 Domínio 0.1 Archaea 206 226 319 Filo 0.1.1 Euryarchaeota 112 112 181 Classe 0.1.1.1 Halobacteria 13 18 33 Ordem 0.1.1.1.1 Halobacteriales 13 18 33
Família 0.1.1.1.1.1 Deep Sea Hydrothermal Vent Gp 6 (DHVEG-6) 4 7 12 Família 0.1.1.1.1.2 Miscellaneous Euryarchaeotic Group (MEG) 0 0 1
Família 0.1.1.1.1.3 Unclassified Halobacteriales 9 11 20
Classe 0.1.1.2 Methanobacteria 2 4 5
Ordem 0.1.1.2.1 Methanobacteriales 2 4 5
Família 0.1.1.2.1.1 Methanobacteriaceae 2 4 5
Gênero 0.1.1.2.1.1.1 Methanobacterium 2 2 4
Gênero 0.1.1.2.1.1.2 Methanobrevibacter 0 1 1
Gênero 0.1.1.2.1.1.3 Unclassified Methanobacteriaceae 0 1 0
Classe 0.1.1.3 Methanomicrobia 33 41 46
Ordem 0.1.1.3.1 Methanocellales 30 30 41
Família 0.1.1.3.1.1 Methanocellaceae 30 30 41
Gênero 0.1.1.3.1.1.1 Methanocella 8 7 8
Gênero 0.1.1.3.1.1.2 Rice Cluster I 19 19 28
Gênero 0.1.1.3.1.1.3 Unclassified Methanocellaceae 3 4 3
Ordem 0.1.1.3.2 Methanosarcinales 3 11 5
Família 0.1.1.3.2.1 Methanosarcinaceae 3 9 4
Gênero 0.1.1.3.2.1.1 Methanosarcina 3 9 4
Família 0.1.1.3.2.2 Unclassified Methanosarcinales 0 2 1
Classe 0.1.1.4 Thermoplasmata 50 36 66
Ordem 0.1.1.4.1 Thermoplasmatales 50 36 66
Família 0.1.1.4.1.1 Terrestrial Miscellaneous Gp (TMEG) 11 13 17
Família 0.1.1.4.1.2 Thermoplasmatales Incertae Sedis 3 2 2
Gênero 0.1.1.4.1.2.1 Methanomassiliicoccus 3 2 2
Família 0.1.1.4.1.3 Unclassified Thermoplasmatales 36 21 47
*O RankID é uma classificação numérica conferida pelo programa MOTHUR e está taxonomicamente representada na coluna Taxlevel.
Continuação da Tabela 9 - OTUs encontradas após a classificação das sequências em 97% de similaridade nos grupos 0, 5 e 8.
Taxlevel RankID Taxon Grupo
0
Grupo 5
Grupo 8
Classe 0.1.1.5 Unclassified Euryarchaeota 14 13 31
Filo 0.1.2 Thaumarchaeota 89 104 127
Classe 0.1.2.1 Marine Group I 2 1 2
Ordem 0.1.2.1.1 Cenarchaeales 1 0 0
Família 0.1.2.1.1.1 Cenarchaeaceae 1 0 0
Gênero 0.1.2.1.1.1.1 Cenarchaeum 1 0 0
Ordem 0.1.2.1.2 Unclassified Marine Group I 1 1 2
Classe 0.1.2.2 Miscellaneous Crenarchaeotic Group 6 7 7
Classe 0.1.2.3 Soil Crenarchaeotic Group (SCG) 21 23 28
Ordem 0.1.2.3.1 Unknown Order 5 9 10
Família 0.1.2.3.1.1 Unknown Family 5 9 10
Gênero 0.1.2.3.1.1.1 Ca. Nitrososphaera 5 9 10
Ordem 0.1.2.3.2 Unclassified Soil Crenarchaeotic Group 16 14 18 Classe 0.1.2.4 South African Gold Mine Gp 1(SAGMCG-1) 16 25 37
Ordem 0.1.2.4.1 Unknown Order 1 5 6
Família 0.1.2.4.1.1 Unknown Family 1 5 6
Gênero 0.1.2.4.1.1.1 Ca. Nitrosotalea 1 5 6
Ordem 0.1.2.4.2 Unclassified South African Gold Mine Gp 1 16 20 31
Classe 0.1.2.5 Terrestrial Group 36 32 35
Classe 0.1.2.6 Unclassified Thaumarchaeota 8 16 18
Filo 0.1.3 Unclassified Archaea 5 10 11
*O RankID é uma classificação numérica conferida pelo programa MOTHUR e está taxonomicamente representada na coluna Taxlevel.
É possível observar um pequeno aumento da riqueza com a progressão do AF; entretanto, sem diferenças significativas na composição das comunidades de arqueias entre os grupos analisados.
Os grupos 0 e 5 compartilham entre si menos OTUs em comparação com o grupo 8; além disso, o número de OTUs únicas dos dois grupos é muito menor do que as OTUs únicas do grupo 8 (Figura 18).
Pode-se observar maior riqueza no grupo 8, com maior número de OTUs encontradas (319), em relação aos grupos 0 (206) e grupo 5 (226) (Tabela 10). A riqueza total encontrada foi de 483 OTUs, sendo 105 compartilhadas entre os três grupos. Os índices de Chao compartilhado calculados pelo MOTHUR são maiores que os encontrados nas amostras (126 OTUs para a riqueza compartilhada entre os grupos 0 e 5; 168 entre os grupos 0 e 8 e 177 entre os grupos 5 e 8).
Tabela 10 – Riqueza encontrada nos grupos 0, 5 e 8, de acordo com o diagrama de Venn.
Amostra OTUs observadas
Grupo 0 206 Grupo 5 226 Grupo 8 319 0 – 5 110 0 – 8 134 5 – 8 129 0 – 5 – 8 105 Riqueza total 483
Após análise dos percentuais de participação das OTUs classificadas em até o nível de classe de arqueias nos grupos 0, 5 e 8 (Figuras 19a, 19b e 19c), foram encontrados apenas dois filos, Euryarchaeota e Thaumarchaeota, além de um pequeno percentual de OTUs não classificadas em nível de filo (2%). O filo Euryarchaeota possui maior representação (54%), em comparação com o filo Thaumarchaeota (43%). O agrupamento de OTUs classificadas em nível de classe mais abundante foi Thermoplasmata com 24% de todas as OTUs do Grupo 0 e 45% de todas as OTUs do filo Euryarchaeota. O segundo foi Methanomicrobia, com 16% de todas as OTUs do Grupo 0 e 29% de todas as OTUs do filo Euryarchaeota. Já no filo Thaumarchaeota foi Terrestrial Group, com 17% de todas as OTUs do Grupo 0 e 40% de todas as OTUs do filo (Figura 19a).
Figura 19 - Percentuais de OTUs classificadas em até o nível de classe: (a) no grupo 0; (b) no filo Euryarchaeota; e (c) no filo Thaumarchaeota, por Krona.
O somatório dos percentuais das OTUs classificadas em até o nível de classe no gráfico 19a representa 100% das OTUs encontradas no grupo 0, enquanto que os somatórios dos percentuais das sequências classificadas em até o nível de classe nos gráficos 19b e 19c representam 100% das OTUs no filo Euryarchaeota e Thaumarchaeota, respectivamente.
Após análise dos percentuais de participação das OTUs classificadas em até o nível de classe de arqueias no grupo 5, do filo Euryarchaeota e do filo Thaumarchaeota (Figuras 20a, 20b e 20c), pode-se observar que neste grupo todas as OTUs também foram classificadas em apenas dois filos, Euryarchaeota e Thaumarchaeota, além de um pequeno percentual de OTUs não classificadas em nível de filo (4%). O filo Euryarchaeota também possui maior representação (50%), em comparação com o filo Thaumarchaeota (46%). O agrupamento de OTUs classificadas em até o nível de classe mais abundante foi Methanomicrobia com 18% de todas as OTUs do grupo 5 e 37% de todas as OTUs do filo Euryarchaeota. O segundo foi Thermoplasmata, com 16% de todas as OTUs do grupo 5 e 32% de todas as OTUs do filo
Euryarchaeota. Já no filo Thaumarchaeota foi Terrestrial Group, com 14% de todas as OTUs do grupo 5 e 31% de todas as OTUs do filo (Figura 20c).
Figura 20 – Percentuais de OTUs classificadas em até o nível de classe: (a) no grupo 5; (b) no filo Euryarchaeota; e (c) no filo Thaumarchaeota, por Krona.
O somatório dos percentuais das OTUs classificadas em até o nível de classe no gráfico 20a representa 100% das OTUs encontradas no grupo 5, enquanto que o somatório dos percentuais das sequências classificadas em até o nível de classe nos gráficos 20b e 20c representa 100% das OTUs no filo Euryarchaeota e Thaumarchaeota, respectivamente.
Após a análise dos percentuais de participação das OTUs classificadas em até o nível de classe de arqueias no grupo 8, pode-se observar que, de maneira análoga aos grupos 0 e 5, neste grupo também foram encontrados apenas dois filos, Euryarchaeota e Thaumarchaeota, além de um pequeno percentual de OTUs não classificadas em nível de filo (3%) (Figura 20a). O filo Euryarchaeota também possui maior representação (57%), em comparação com o filo Thaumarchaeota (40%). O agrupamento de OTUs classificadas em até o nível de classe mais abundante foi Thermoplasmata com 21% de todas as OTUs do Grupo 8 e 36% de todas as OTUs do filo Euryarchaeota (Figura 20b). O segundo agrupamento mais abundante foi a
Methanomicrobia, com 14% de todas as OTUs do grupo 8 e 25% de todas as OTUs do filo Euryarchaeota (figura 20b). Já no filo Thaumarchaeota foi South African Gold Mine Gp 1, com 12% de todas as OTUs do grupo 8 e 29% de todas as OTUs do filo (Figura 20c).
Figura 21 – Percentuais de OTUs classificadas em até o nível de classe: (a) no grupo 8; (b) no filo Euryarchaeota; e (c) no filo Thaumarchaeota, por Krona.
O somatório dos percentuais das OTUs classificadas em até o nível de classe no gráfico 21a representa 100% das OTUs encontradas no grupo 8, enquanto que o somatório dos percentuais das sequências classificadas em até o nível de classe nos gráficos 21b e 21c representam 100% das OTUs do filo Euryarchaeota e Thaumarchaeota, respectivamente.
Na análise das diferenças entre os percentuais das OTUs classificadas em até o nível de classe dos grupos 0, 5 e 8, foram observadas diferenças significativas entre os grupos, especialmente em South African Gold Mine Gp 1, que apresentou um aumento de sua abundância diretamente proporcional ao aumento dos sintomas do AF, indo de 20% do grupo 0 para 26% no grupo 5 e chegando a 28% no grupo 8. A mesma relação pode ser observada
em Methanomicrobia, com um aumento da abundância do grupo 0 para o grupo 8 (12,9% no grupo 0; 15,9% no grupo 5 e 15% no grupo 8) (Figuras 22a, 22b e 22c).
Figura 22 – Perfil taxonômico comparativo das OTUs classificadas em até o nível de classe dos grupos 0 (em azul), grupo 5 (em vermelho) e grupo 8 (em verde) computadas pelo MOTHUR. (a) Comparação entre os grupos 0 e 5. (b) Comparação entre os grupos 0 e 8. (c) Comparação entre os grupos 5 e 8.
Estão representados apenas os grupos de OTUs classificadas em até o nível de classe com diferenças biológicas significativas (q < 0,05, e diferenças entre as proporções > 0,5%). Foi usado o teste exato de Fisher, por STAMP.
Thermoplasmata teve uma relação inversa; uma queda na abundância do grupo 0 (8,9%) para o grupo 5 (4,6%) (Figura 22a). Entretanto, houve um aumento do grupo 5 para o 8 (8,6%) (Figura 22c). Todavia, não houve diferença significativa entre os grupos 0 e 8 (0,3%) (Figura 22b). Também houve diminuição em Terrestrial Group, mas apenas do grupo 0 (9,7%) para o grupo 5 (5,8%) (Figura 22a); contudo, houve aumento de abundância para o grupo 8 (6,9%) (Figura 22b), mas ainda assim, esse agrupamento é mais abundante no grupo 0. Miscellaneous Crenarchaeotic Group apresentou variações discretas entre os grupos, sem diferenças significativas entre os grupos 0 e 8 (Figura 22b).
O número de OTUs classificadas como South African Gold Mine Gp 1, do filo Thaumarchaeota e Terrestrial Group e Methanomicrobia, do filo Euryarchaeota, onde foram
(a)
(b)
encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, além de existir uma relação entre os sintomas do AF e as abundâncias das OTUs classificadas nestas classes está representado na Figura 23.
Figura 23 – Abundância de OTUs nos três agrupamentos de sequências classificadas no nível de classe de arqueias com diferenças significativas entre os grupos 0 (azul), 5 (vermelho) e 8 (verde).
Os grupos 0, 5 e 8 se referem ao somatório das OTUs das réplicas biológicas de cada estágio do AF que foram agrupadas.
De maneira geral, os três grupos apresentam um grande número de OTUs não classificadas em nível de gênero; são 6 gêneros não classificados no filo Thaumarchaeota e 9 no filo Euryarchaeota. Entre os classificados, o Grupo 0 apresenta maior representação em
Rice Cluster I (9%) e Methanocella (4%), ambos do filo Euryarchaeota. No filo
Thaumarchaeota apenas Ca. Nitrososphaera aparece, com 2% (Figura 24a).
O Grupo 5 também apresenta maior número de OTUs classificadas no filo Euryarchaeota: Rice Cluster I (8%), Methanosarcina (4%) e Metanocella (3%). Entretanto, existe maior representação no filo Thaumarchaeota em comparação com o Grupo 0: Ca. Nitrososphaera (4%) e Ca. Nitrosotalea (2%) (Figura 24b).
0 10 20 30 40 50 60 SAGMCG Gp 1 Terrestrial Group Methanomicrobia 14 36 37 21 31 53 33 36 53 O TU s Classes Grupo 0 Grupo 5 Grupo 8
Figura 24 - Percentuais de OTUs classificadas em até o nível de gênero nos grupos (a) 0; (b) 5 e (c) 8. O somatório dos percentuais dos gêneros no gráfico representa 100% das OTUs classificadas em até o nível de gênero encontradas nos grupos 0, 5 e 8, por Krona.
Continuação da Figura 24 - Percentuais de OTUs classificadas em até o nível de gênero nos grupos (a) 0; (b) 5 e (c) 8. O somatório dos percentuais dos gêneros no gráfico representa 100% das OTUs classificadas em até o nível de gênero encontrados nos grupos 0, 5 e 8, por Krona.
O grupo 8 possui aumento na representação no filo Euryarchaeota: Rice Cluster I (9%), Methanocella (3%), Methanosarcina e Methanobacterium (1%). No filo Thaumarchaeota seguem quase os mesmos percentuais de participação de Ca. Nitrososphaera (3%) e Ca. Nitrosotalea (2%) em relação ao grupo 5 (Figura 24c).
Após a análise das diferenças entre os percentuais das OTUs classificadas em cada gênero dos grupos 0, 5 e 8, com um intervalo de confiança de 95%, foram observadas diferenças significativas entre os grupos, especialmente Rice Cluster I, que apresentou um aumento em sua abundância diretamente proporcional ao aumento dos sintomas do AF. Rice
Cluster I apresentou 5,5% as OTUs do grupo 0, 7,4% do grupo 5 e 8,5% do grupo 8 (Figura
25). A mesma relação pode ser observada com Methanosarcina, com um aumento da abundância do grupo 0 (2,9%) para 4,7% no grupo 5; entretanto, houve queda na proporção
no grupo 8 (2,6%), assim como para Ca. Nitrosotalea, que no grupo 0 apresentou 2%; 5,5% no grupo 5 e 3,5% no grupo 8 (Figura 25). Ca. Nitrososphaera e Methanocella apresentaram uma relação inversa; uma queda na abundância com o aumento dos sintomas do AF. Ca. Nitrososphaera apresentou 10,2% das OTUs classificadas no nível de gênero no grupo 0, 9,5% no grupo 5 e 2,8% no grupo 8. Já Methanocella apresentou 4% no grupo 0, 3,3% no grupo 5 e 0,8% no grupo 8 (Figura 25).
Figura 25 – Perfil taxonômico comparativo das OTUs classificadas em até o nível de gênero dos grupos 0 (em azul), grupo 5 (em vermelho) e grupo 8 (em verde) computadas pelo MOTHUR. (a) Comparação entre os grupos 0 e 5. (b) Comparação entre os grupos 0 e 8. (c) Comparação entre os grupos 5 e 8.
Estão representados apenas os grupos de OTUs classificadas em até o nível de gênero com diferenças biológicas significativas (q < 0,05, e diferenças entre as proporções > 0,5%). Foi usado o teste exato de Fisher, por STAMP.
(a)
(b)
O número de OTUs classificadas em até o nível de gênero na classe Methanomicrobia, ordem Methanosarcinales, onde foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, além de existir uma relação entre os sintomas do AF e as abundâncias das OTUs classificadas nesta classe estão representadas na Figura 26.
Figura 26 - Abundância de OTUs classificadas na classe Methanomicrobia, ordem Methanocellales, nos grupos 0 (azul), 5 (vermelho) e 8 (verde). Os grupos 0, 5 e 8 se referem ao somatório das OTUs das réplicas biológicas de cada estágio do AF que foram agrupadas, após a normalização.
Rice Cluster I possui maior representação absoluta de OTUs é o, seguido de Methanocella.
O número de OTUs classificadas na classe South African Gold Mine Gp 1, onde foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, além de existir uma relação entre os sintomas do AF e as abundâncias das OTUs classificadas nesta classe está representado na Figura 27.
A maior representação dessa classe encontra-se em unclassified South African Gold Mine Gp 1, com poucos representantes de Ca. Nitrosotalea.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Methanocella Rice Cluster I Unclassified Methanocellaceae Methanocellales Methanomicrobia G êne ros Família O rde m Cl as se 8 19 3 30 30 33 7 19 4 30 30 41 8 28 5 41 41 46
Figura 27 - Abundância de OTUs classificadas na classe South African Gold Mine Gp 1 nos grupos 0 (azul), 5 (vermelho) e 8 (verde). Os grupos 0, 5 e 8 se referem ao somatório das OTUs das réplicas biológicas de cada estágio do AF que foram agrupadas.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
Unclassified Candidatus Nitrosotalea Unknown Family Unknown Order South African Gold Mine Gp 1
O rde m G êne ro Família O rde m Cl as se 16 16 20 5 5 5 25 31 6 6 6 37