Análise das Comunidades de Arqueias de Solos Cultivados com Dendezeiros com

sem Sintomas de AF

Até os dias de hoje ainda não há um fator etiológico conhecido do Amarelecimento Fatal; mesmo após a realização de diversos estudos, nas mais diversas áreas, a doença segue sem uma causa definida. Como um dos sintomas do AF é o apodrecimento das raízes (DE SOUZA, VEIGA; RAMOS, 2000; DE FRANQUEVILLE, 2003), seria possível a presença do patógeno, se o AF tiver origem biótica, na rizosfera.

Existem poucas informações sobre a diversidade de Archaea em solos; especialmente em solos Amazônicos, tampouco sobre os papéis dessas arqueias, seja nos solos ou na doença. Neste sentido, a caracterização das comunidades de arqueias dos solos de dendezeiros afetados com a doença e sua comparação com a microbiota “saudável” pode fornecer pistas de um possível agente etiológico biótico.

Esse trabalho inédito contribui com uma caracterização filogenética não apenas das comunidades de arqueias dos solos de mata nativa Amazônica e de solos cultivados com dendezeiros saudáveis, mas também de solos de dendezeiros em dois estágios distintos do AF.

Para a obtenção das sequências do gene 16S rRNA utilizadas nas análises, além da extração do DNA total dos solos, primers específicos para Archaea foram utilizados. Não se deve descartar os vieses relacionados a essas técnicas, como a escolha dos primers, os quais dificilmente conseguem cobrir toda a diversidade de seus alvos nos solos; além de outros fatores inerentes à técnica, como perda de representatividade dos raros, amplificação preferencial, entre outros (ACINAS et al., 2005). Numa tentativa de minimizar esses vieses, foram feitas várias extrações de DNA, assim como várias reações de PCR por amostra.

Observando-se os dados, a partir do sequenciamento do DNA total dos solos associados a dendezeiros com e sem sintomas de AF, foram obtidos cerca de 179 mil reads; número mais que suficiente para cobrir a diversidade de arqueias nos três grupos estudados, como pode ser observado pelas curvas de rarefação e cobertura de Good; sendo que o grupo 8 apresentou menor cobertura. Os índices de riqueza, Chao1 e ACE, e diversidade, Simpson Invertido e Shannon, apontam uma maior diversidade, em riqueza e abundância, para o grupo 8. Os índices de riqueza também mostram um número de OTUs superior ao que foi encontrado nos três grupos; entretanto, com uma cobertura superior a 99%, a diversidade foi devidamente coberta pela amostragem utilizada. Pode-se observar um relação direta entre o

aumento da diversidade e a progressão do AF; entretanto não é possível afirmar se essas diferenças são causa ou consequência do AF.

Diferentemente do que foi observado para as comunidades de arqueias nos grupos, quando as comunidades bacterianas foram analisadas (BERGMANN, 2013), o grupo 5 apresentou maior número de OTUs observadas em relação aos demais grupos, assim como maior abundância e presença de espécies raras. Entretanto, as estimativas de cobertura e curvas de rarefação mostraram que o esforço amostral não foi suficiente para cobrir toda a diversidade bacteriana das amostras.

Um fator que deve ser levado em consideração em relação ao aumento da diversidade com a progressão da doença é a possibilidade de ser um efeito da liberação de exsudatos pelas raízes dos dendezeiros doentes; já que o sistema radicular é fortemente afetado pela doença e o estágio 8 é um estágio avançado do AF. Além disso, o estágio 0, que é considerado um estágio onde a planta é “saudável”, na realidade representa plantas sem sintomas aparentes de AF. Como um dos sintomas é o comprometimento do sistema radicular (DE FRANQUEVILLE, 2003), não observável para efeito dessa classificação de severidade do AF (DE SOUZA, VEIGA; RAMOS, 2000), pode ser que os três grupos estudados sejam plantas doentes, o que torna mais difícil a observação de diferenças significativas entre as comunidades microbianas dos três grupos.

Foi feita uma ACP dos fatores químicos dos grupos estudados, numa tentativa de excluir esses fatores como possíveis causadores das diferenças entre as comunidades de arqueias dos grupos estudados. Entretanto, foram encontrados fatores químicos discrepantes entre os grupos: fósforo, alumínio, H + Al, matéria orgânica, carbono total e nitrato, todos em maior teor no grupo 5; e cálcio, mais abundante no grupo 8. Apesar de não ser encontrada nenhuma relação explícita entre os parâmetros químicos estudados e a progressão do AF, a ACP dos dados químicos mostra que os três grupos são distintos em relação às suas características químicas. Como o AF já foi observado em diversos tipos diferentes de solos sem, até o presente momento, ter sido encontrada nenhuma relação positiva entre os fatores físico-químicos desses solos e o AF, se torna mais forte a possibilidade de que a doença tenha uma causa biótica.

De maneira análoga à amostra de solo de mata nativa, só foram observados dois filos nos três grupos: Euryarchaeota e Thaumarchaeota. Entretanto, diferentemente do encontrado nos solos de mata nativa, houve a prevalência do filo Euryarchaeota nos três grupos, em relação ao filo Thaumarchaeota. Entretanto, a partir da ACP dos filogenéticos é possível afirmar que os três grupos são distintos ente si em relação as suas OTUs.

Nas comunidades bacterianas foi observada predominância dos filos Acidobacteria e Proteobacteria (BERGMANN, 2013), sendo o primeiro encontrado em diversos tipos de solos ácidos, inclusive amazônicos (NAVARRETE et al., 2013).

Pode-se observar um aumento da participação do filo Euryarchaeota com o agravamento do AF. As OTUs classificadas em nível de classe neste filo encontradas nos três grupos foram: Halobacteria, Methanobacteria, Methanomicrobia e Thermoplasmata (com uma ordem metanogênica), sendo as três últimas classes possuidoras de ordens metanogênicas.

A classe Halobacteria apresentou aumento de sua representatividade com o agravamento do AF nos grupos: de 6% no grupo 0 para 8% no grupo 5, chegando a 10% no grupo 8. Entretanto, ao se comparar os perfis taxonômicos entre os grupos, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas das proporções dessa classe entre os grupos. Além disso, as OTUs classificadas nesta classe não alcançaram classificação em nível de gênero. Representantes dessa classe já foram encontrados em ambientes diversos, como em solo de mata Atlântica (LIMA, 2011) ou em águas profundas (40m) de uma usina hidroelétrica na região Amazônica (GRACAS et al., 2011). Esta classe é formada predominantemente por arqueias extremófilas, que vivem em ambientes com altas concentrações de NaCl; entretanto, já foram encontrados representantes em ambientes com concentrações salinas mais moderadas (ELSHAHED et al., 2004; SAVAGE et al., 2007).

Apenas as OTUs classificadas na classe Methanomicrobia, do filo Euryarchaeota, apresentaram aumento de abundância do grupo 0 para o grupo 8. Esta classe apresentou OTUs classificadas em duas ordens: Methanosarcinales e Methanocellales. A primeira apresentou OTUs classificadas em duas famílias, uma delas unclassified, com pouca representação. Já a ordem Methanocellales apresentou OTUs classificadas em apenas uma família, Methanocellaceae, e OTUs classificadas em nível de gênero como unclassified Methanocellales, Methanocella e Rice Cluster I.

Nos três grupos foi possível observar seis grupos de OTUs classificadas em nível de gênero do filo Euryarchaeota: Rice Cluster I, Methanocella e Methanosarcina na classe Methanomicrobia; Methanobacterium e Methanobrevibacter na classe Methanobacteria e

Methanomassillicoccus na classe Thermoplasmata.

Rice Cluster I é um gênero de arqueias metanogênicas encontrado nos mais diversos

ambientes anóxicos, como solos alagados, colunas de água e sedimentos de lagos (JURGENS et al., 2000). Methanocella e Methanosarcina são gêneros de arqueias metanogênicas filogeneticamente próximas ao gênero Rice Cluster I, sendo todos encontrados em solos alagados acídicos da mata Atlântica (ETTO et al., 2012). Por outro lado, representantes dos

gêneros Methanocella e Methanosarcina foram encontrados em diversos solos aerados amostrados globalmente, retomando a metanogênese quando estes solos são alagados (ANGEL, CLAUS; CONRAD, 2012).

Na comparação dos perfis taxonômicos em nível de gênero foram encontradas diversas diferenças significativas das proporções de OTUs classificadas neste nível entre os grupos; entretanto apenas Rice Cluster I apresentou aumento de abundância com a progressão do AF; enquanto que Methanocella perdeu abundância com o aumento do grau da doença.

Rice Cluster I apresentou um maior número de OTUs assim classificadas nos três grupos em

relação à Methanocella, entretanto, ainda existe um grupo não classificado em nível de gênero que pode se tratar de um gênero diferente, ou ainda, serem sequências pertencentes à Rice

Cluster I ou Metanocella que não apresentaram uma qualidade de sequenciamento suficiente,

após o controle de qualidade, para serem classificadas neste nível.

Já no filo Thaumarchaeota as OTUs classificadas em nível de classe encontradas nos três grupos foram: South African Gold Mine Gp 1, Soil Crenarchaeotic Group, Terrestrial Group, Miscellaneous Crenarchaeotic Group e Marine Group I, além de uma pequena porcentagem de unclassified Thaumarchaeota. Este filo possui vários representantes oxidadores de amônia (AOAs).

Na análise das comunidades bacterianas, o segundo filo mais abundante encontrado foi Proteobacteria, com a classe Alfaproteobacteria mais abundante formada por bactérias fixadoras de nitrogênio, além de alguns metilotróficos (ZHANG; XU, 2008).

Neste nível taxonômico, apenas South African Gold Mine Gp 1 apresentou aumento de abundância com o agravamento da doença. Terrestrial Group teve diminuição na sua abundância entre os grupos 0 e 5; entretanto, houve aumento para o grupo 8; todavia, ainda em um percentual menor do que o apresentado no grupo 0. Na Figura 23 é possível observar a variação do número de OTUs nos três agrupamentos que mostraram variações significativas em suas abundâncias relacionadas com o AF: South African Gold Mine Gp 1, Terrestrial Group e Methanomicrobia. Pode-se observar uma relação mais direta do aumento de abundância com os sintomas do AF em South African Gold Mine Gp.

As OTUs classificadas nesta classe apresentaram-se em dois grupos: Unknown Order e unclassified South African Gold Mine Gp 1. O primeiro teve suas OTUs classificadas em nível de gênero apenas como Ca. Nitrosotalea, sem representantes no grupo 0 e com pouca representação nos demais grupos. Já unclassified South African Gold Mine Gp 1 possui maior número de OTUs nos três grupos e estes aumentam com o sintomas do AF.

Nos três grupos foi possível observar apenas três agrupamentos de OTUs classificadas em nível de gênero no filo Thaumarchaeota: Cenarchaeum, em Marine Group I (apenas no grupo 0, sem representação nos demais); Ca. Nitrosotalea, em South African Gold Mine Gp 1 (presente apenas nos grupos 5 e 8) e Ca. Nitrososphaera, em Soil Crenarchaeotic Group (presente em todos os grupos). Por outro lado, foram encontrados cinco agrupamentos de OTUs não classificadas em nível de classe nos três grupos: unclassified Terrestrial Group, unclassified Soil Crenarchaeotic, unclassified South African Gold Mine Gp 1 e unclassified Miscellaneous Crenarchaeotic Group, além das OTUs não classificadas em nível de filo, unclassified Thaumarchaeota.

Na análise das comunidades bacterianas nos grupos foram encontrados alguns gêneros patogênicos (Erwinia, Pseudomonas e Bacillus) já isolados de folhas de dendezeiros doentes com AF; todavia, foram realizados testes de transmissão que falharam em conseguir relacionar estes gêneros com o AF (BERGMANN, 2013)

Quando comparamos os perfis taxonômicos das OTUs classificadas em nível de gênero das comunidades de arqueias, encontramos diversas diferenças significativas das proporções de OTUs classificadas entre os grupos; entretanto apenas Ca. Nitrosotalea apresentou aumento de abundância com a progressão do AF; enquanto que Ca. Nitrososphaera apresenta menor porporção de OTUs com o aumento do grau da doença.

É importante ressaltar que as amostras são normalizadas durante a análise de bioinformática, buscando diminuir o viés de amostras de tamanhos diferentes nas análises; onde as amostras com maior número de sequências são redimensionadas para o mesmo número de sequências da menor amostra, para que a chance de existirem OTUs espúrias seja igual para todas as amostras. Para se determinar se a normalização afeta a análise dos dados, foram feitos perfis taxonômicos pelo programa STAMP, antes e após a normalização. Observou-se que as proporções entre os grupos foram mantidas, como se pode observar nos gráficos do STAMP utilizando os dados não normalizados (Anexos F e G). Sendo assim, todas as análises deste trabalho foram feitas após a normalização.

Segundo Jung e Kang, para uma análise sem vieses da diversidade microbiana, a normalização dos dados é imprecindível, especialmente no caso do cálculo de índices de riqueza e diversidade (JUNG; KANG, 2014).

Vale assinalar, mesmo com percentuais pequenos de participação nos perfis taxonômicos normalizados, não se pode descartar a possibilidade de um papel importante das OTUs classificadas em nível de gênero que mostraram mudanças em suas abundâncias relacionadas ao aumento da progressão do AF. Para tal, estudos mais aprofundados são

necessários, como análise de PCR quantitativo, para a determinação da real abundância dessas arqueias, além do uso de primers mais específicos.

Após a análise de todos os dados apresentados, o filo Euryarchaeota foi predominante nos solos cultivados com dendezeiros saudáveis e com AF; ao contrário dos solos de mata nativa. Foi encontrada uma relação direta com o percentual de OTUs classificadas como Rice

Cluster I e Ca. Nitrosotalea e o AF; entretanto, não é possível afirmar se tratar de causa ou

consequência da doença.

Em relação à uma possível patogenicidade de arqueias, até os dias atuais ainda não houve confirmação da existência de arqueias patogênicas; entretanto, à luz do conhecimento atual, as arqueias preenchem vários pré-requisitos para um possível papel no desenvolvimento de doenças.

Para um melhor entendimento dos papéis das arqueias nos solos amazônicos cultivados com dendezeiros saudáveis e acometidos pelo AF, seus papéis nos ciclos biogeoquímicos devem ser elucidados por meio de estudos complementares, como, por exemplo, analisando genes funcionais.

Esse estudo é um passo importante no estudo das causas do AF, já que traz à luz a composição das comunidades de arqueias em solos nativos e cultivados com dendezeiros, explicitando as variações nas composições dessas comunidades e elucidando novos caminhos a serem estudados, como os papéis dessas arqueias nesses solos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ACINAS, S. G. et al. PCR-induced sequence artifacts and bias: Insights from comparison of two 16S rRNA clone libraries constructed from the same sample. Applied and

Environmental Microbiology. 71: 8966-8969. 2005.

ADDINSOFT. XLSTAT: Addinsoft 2010.

AL RWAHNIH, M. et al. Deep sequencing analysis of RNAs from a grapevine showing Syrah decline symptoms reveals a multiple virus infection that includes a novel virus.

Virology. 387: 395-401. 2009.

ALLEN, E. E.; BANFIELD, J. F. Community genomics in microbial ecology and evolution.

Nat Rev Microbiol. 3: 489-98. 2005.

ALMEIDA, C. M. et al. Caracterização morfológica e anatômica de dez espécies de leguminosae ocorrentes em uma floresta tropical úmida localizada no município de Moju, Estado do Pará. In: SILVA, J. N. M. C., J.O.P. DE; YARED, J.A.G. A silvicultura na

Amazônia Oriental: Contribuições do projeto Embrapa-DFID.(Ed.). Belém, Pará:

Embrapa Amazônia Oriental (CPATU), 2001. p.19-54.

ALTIERI, M. A. The ecological role of biodiversity in agroecosystems. Agriculture

Ecosystems & Environment. 74: 19-31. 1999.

AMANN, R. I.; LUDWIG, W.; SCHLEIFER, K. H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol Rev. 59: 143-69. 1995. ANDERSON, I. et al. Genomic Characterization of Methanomicrobiales Reveals Three Classes of Methanogens. Plos One. 4. 2009.

ANDERSON, I. C.; CAIRNEY, J. W. G. Diversity and ecology of soil fungal communities: increased understanding through the application of molecular techniques. Environmental

Microbiology. 6: 769-779. 2004.

ANGEL, R.; CLAUS, P.; CONRAD, R. Methanogenic archaea are globally ubiquitous in aerated soils and become active under wet anoxic conditions. Isme Journal. 6: 847-862. 2012.

ARAUJO, J. F. et al. Characterization of Soil Bacterial Assemblies in Brazilian Savanna-Like Vegetation Reveals Acidobacteria Dominance. Microbial Ecology. 64: 760-770. 2012. Assessment of the world food security situation. Assessment of the world food security

situation. Rome (Italy), 2007. p.

AUCHTUNG, T. A.; TAKACS-VESBACH, C. D.; CAVANAUGH, C. A. 16S rRNA phylogenetic investigation of the candidate division 'Korarchaeota". Applied and

AUGUET, J.-C.; BARBERAN, A.; CASAMAYOR, E. O. Global ecological patterns in uncultured Archaea. Isme Journal. 4: 182-190. 2010.

Avaliação de biodiesel no Brasil. Avaliação de biodiesel no Brasil. Brasília, DF, 2004. 48 p. AYALA, L. S. Relatório de visita à Denpasa. Pesquisa sobre amarelecimento fatal do

dendezeiro. . DENPASA, p.319. 2001

BAFFI, M. A. et al. Fungi isolated from olive ecosystems and screening of their potential biotechnological use. New Biotechnology. 29: 451-456. 2012.

BAIS, H. P. et al. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annual Review of Plant Biology. 57: 233-266. 2006.

BAKER, G. C.; SMITH, J. J.; COWAN, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. Journal of Microbiological Methods. 55: 541-555. 2003.

Balanço Energético Nacional 2012 - Ano base 2011. Balanço Energético Nacional 2012 -

Ano base 2011. Rio de Janeiro, 2012. 282 p.

Balanço Energético Nacional 2014 - Ano Base 2013. MMA. Balanço Energético Nacional

2014 - Ano Base 2013. 2014. 54 p.

BANG, C. et al. The Intestinal Archaea Methanosphaera stadtmanae and Methanobrevibacter smithii Activate Human Dendritic Cells. Plos One. 9. 2014.

BARNS, S. M. et al. Perspectives on archaeal diversity, thermophily and monophyly from environmental rRNA sequences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America. 93: 9188-9193. 1996.

BARNS, S. M. et al. Remarkable archaeal diversity detected in a Yellowstone National Park hot spring environment

. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91: 1609-1613. 1994.

BATES, S. T. et al. Examining the global distribution of dominant archaeal populations in soil. ISME J. 5: 908-17. 2011.

BELAY, N. et al. Methanogenic bacteria in human vaginal samples. Journal of Clinical

Microbiology. 28: 1666-1668. 1990.

BENDER, S. F.; DA SILVA VALADARES, R. B.; TAUDIERE, A. Mycorrhizas: dynamic and complex networks of power and influence. New Phytologist. 204: 15-18. 2014.

BERG, I. A. et al. Autotrophic carbon fixation in archaea. Nature Reviews Microbiology. 8: 447-460. 2010.

BERGMANN, J. C. Utlização de Estratégias Metagenômicas para Aplicações

Biotecnológicas no Setor de Biocombustíveis. 2013. 222 (Doutorado). Universidade

BERGMANN, J. C. et al. Biodiesel production in Brazil and alternative biomass feedstocks.

Renewable & Sustainable Energy Reviews. 21: 411-420. 2013.

BINTRIM, S. B. et al. Molecular phylogeny of archaea from soil. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America. 94: 277-282. 1997.

Biodiesel. Biodiesel. 2009. 64 p.

BIODIESELBR. 2013. Disponível em: < http://www.biodieselbr.com/estatisticas/producao- biodiesel-brasil.htm >. Acesso em: 30 de julho de 2013.

BISSETT, A. et al. Long-term land use effects on soil microbial community structure and function. Applied Soil Ecology. 51: 66-78. 2011.

BOARI, A. D. J. Estudos realizados sobre o amarecelimento fatal do dendezeiro (Elais

Guineensis Jacq). Série Documentos. EDIÇÃO. Belém: Embrapa Amazônia Oriental: 66 p.

2008.

BORNEMAN, J.; TRIPLETT, E. W. Molecular microbial diversity in soils from eastern Amazonia: Evidence for unusual microorganisms and microbial population shifts associated with deforestation. Applied and Environmental Microbiology. 63: 2647-2653. 1997. BRASIL. PNPB. Disponível em: < http://portal.mda.gov.br/portal/saf/programas/biodiesel

>.

BRASIL. Ministério do Meio Ambiente - Biocombustíveis. 2015. Disponível em: <

http://www.mma.gov.br/clima/energia/energias-renovaveis/biocombustiveis >. Acesso em:

07/02/2015.

BRINGUIER, A. et al. Real-Time PCR Quantification of Methanobrevibacter oralis in Periodontitis. Journal of Clinical Microbiology. 51: 993-994. 2013.

BRIOSO, P. S. T. et al. Amarelecimento fatal do dendezeiro: sequenciamento parcial do

fitoplasma associado. Congresso Paulista de Fitopatologia 24. Botucatu, SP. 32: 50 p. 2006.

BRIOSO, P. S. T. et al. Etiologia do amarelecimento-fatal-do-dendezeiro. In: POLTRONIERI, L. S.;TRINDADE, D. R., et al. Pragas e doenças de cultivos

amazônicos.(Ed.) 2ª. Belém, PA: Embrapa Amazônia Oriental, 2008. cap. 16, p.379. ISBN

978-85-7383-437-6.

BROCHIER, C. et al. Nanoarchaea: representatives of a novel archaeal phylum or a fast- evolving euryarchaeal lineage related to Thermococcales? Genome Biology. 6. 2005. BROCHIER-ARMANET, C. et al. Mesophilic crenarchaeota: proposal for a third archaeal phylum, the Thaumarchaeota. Nat Rev Micro. 6: 245-252. 2008.

BUEE, M. et al. The rhizosphere zoo: An overview of plant-associated communities of microorganisms, including phages, bacteria, archaea, and fungi, and of some of their structuring factors. Plant and Soil. 321: 189-212. 2009.

BULT, C. J. et al. Complete genome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcus jannaschii. Science. 273: 1058-1073. 1996.

CARVALHO, A. R. V. D.; BALDANI, V. L. D.; REIS, V. M. O Dendê (Elaeis guineensis

Jacq.). Documentos. Seropédica: Embrapa Agrobiologia: 25 p. 2001.

CASAMAYOR, E. O. et al. Changes in archaeal, bacterial and eukaryal assemblages along a salinity gradient by comparison of genetic fingerprinting methods in a multipond solar saltern.

Environmental Microbiology. 4: 338-348. 2002.

CATÃO, E. et al. Diversity of Archaea in Brazilian savanna soils. Archives of Microbiology. 195: 507-512. 2013.

CAVICCHIOLI, R. et al. Pathogenic archaea: do they exist? Bioessays. 25: 1119-1128. 2003. CELESTINO FILHO, P.; LOUISE, C.; LUCCHINI, F. Estudos de transmissão do

amarelecimento fatal do dendezeiro (Elaeis guineensis Jacq), com insetos suspeitos.

Congresso Brasileiro fatal do Dendezeiro 14. Piracicaba: 194 p. 1993.

CELESTINO, J. D. R. et al. Bioprospecting of Amazon soil fungi with the potential for pigment production. Process Biochemistry. 49: 569-575. 2014.

CENCIANI, K. et al. Bacteria diversity and microbial biomass in forest, pasture and fallow soils in the southwestern Amazon basin. Revista Brasileira De Ciência Do Solo. 33: 907- 916. 2009.

CGEE. Química Verde no Brasil 2010- 2030. 1ª. Brasília - DF: Centro de Gestão e Estudos Estratégicos (CGEE), 2010. 438 ISBN 978-85-60755-31-8.

CHAN, P. P. et al. The UCSC Archaeal Genome Browser: 2012 update. Nucleic Acids

Research. 40: D646-D652. 2012.

CHAO, A.; SHEN, T. J. Nonparametric estimation of Shannon's index of diversity when there are unseen species in sample. Environmental and Ecological Statistics. 10: 429-443. 2003. CHAO, A., SHEN, T-J. Program SPADE (Species Predition and DIversity Estimation) 2010.

CHRISTENSEN, M. A view of fungal ecology. Mycologia. 81: 19. 1989.

CLAESSEN, M. E. C.; BARRETO, D. W. D. O.; DUARTE, J. L. D. P. M. N. Manual de

métodos de análse de solo. 2. Rio de Janeiro: EMBRAPA-CNPS, 1997. 212 ISBN 85-