Em meados da década de 70, Woese e colaboradores propuseram uma nova divisão do mundo vivo em três grandes reinos – Archaebacteria, Urkaryonte e Eubacteria, tendo como base as diferenças moleculares entre esses grupos (WOESE; FOX, 1977). Mas foi no início da década de 90 que Woese e colaboradores sugeriram modificações de nomenclatura, especialmente a troca de Archaebacteria para Archaea, para evitar confusão entre arqueias e bactérias, tendo em vista diversos estudos que mostraram que as arqueias formam um novo domínio, tendo, por vezes, mais similaridades em nível molecular com os eucariontes do que com as bactérias (KELMAN, 2000). Sendo assim os domínios passaram a chamar-se
Archaea, Eukarya e Bacteria (WOESE, KANDLER; WHEELIS, 1990) (Figura 4). Nesta
árvore pode-se observar que as arqueias possuem um ancestral comum mais próximo com o Domínio Eukarya do que com o Bacteria.
Figura 4 – Árvore filogenética universal. (Fonte:(WOESE, 2000)).
Deve-se ressaltar o grande avanço no estudo dos organismos ainda não cultivados por meio de técnicas moleculares. Diversos trabalhos demonstram o crescente número de novos microrganismos antes não passíveis de estudo, devido às limitações de cultivo (ARAUJO et al., 2012; TRIPATHI et al., 2012; PACCHIONI et al., 2014). Em face desses avanços, hoje sabe-se que as arqueias estão presentes em virtualmente todos os ambientes, sejam terrestres ou aquáticos; desde o solo até ambientes extremos, com altas temperaturas, pH baixo ou alto,
alta salinidade ou pressão (ROTHSCHILD; MANCINELLI, 2001). Seus papéis biológicos ainda são pouco conhecidos, assim como sua diversidade não está bem estabelecida, já que até pouco tempo alguns poucos exemplares haviam sido cultivados em laboratório, sendo extremófilos em sua maioria, o que nos deu poucas pistas a respeito de seus papéis em ambientes como o solo (SCHLEPER, JURGENS; JONUSCHEIT, 2005). Entretanto, estudos independentes de cultura começam a revelar informações relevantes sobre estes microrganismos (BINTRIM et al., 1997; SIMON, DODSWORTH; GOODMAN, 2000).
Em 1996 foi sequenciado o primeiro genoma completo de arqueia:
Methanocaldococcus jannaschii (BULT et al., 1996). Hoje, em bancos de dados como o UCSC Archaeal Genome Browser (CHAN et al., 2012) são disponibilizados 120 genomas
completos (acesso em 12/2014). O Global Genome Biodiversity Network (GGBN), um banco de DNA, conta hoje com 319 espécies de arqueias e 503 amostras de DNA (disponível online
em http://www.dnabank-network.org;acesso em 12/2014).
As arqueias são procariontes, mas, no nível molecular, não mostram mais similaridade com outros procariontes do que com os eucariontes (WOESE, KANDLER; WHEELIS, 1990). As arqueias possuem, no caso de sua maquinaria de replicação, um tipo de RNA polimerase semelhante às enzimas eucarióticas (HUET et al., 1983); além de histonas, presentes em alguns grupos, que compartilham um ancestral comum eucariótico (REEVE et al., 2004). Apresentam uma composição de parede celular variável, diferenciada das membranas celulares eucarióticas, como, por exemplo, no caso da arqueia Sulfolobus
acidocaldarius, que apresenta uma parede celular com composição nunca antes encontrada
(GUAN et al., 2011). Entretanto, os genes das proteínas ribossomais das arqueias estão organizados em operons, de maneira semelhante às bactérias (YANG et al., 1999).
A classificação taxonômica das arqueias vem sofrendo constantes adições, especialmente com o aumento dos estudos filogenéticos. Inicialmente, o domínio Archaea foi descrito por Woese e colaboradores, na década de 70 (WOESE; FOX, 1977). Posteriormente, o mesmo grupo sugeriu a separação do domínio em dois filos, Crenarchaeota e Euryarchaeota (WOESE, KANDLER; WHEELIS, 1990). Entretanto, como era de se esperar, novos grupos estão sendo propostos, como os filos Thaumarchaeota (BROCHIER-ARMANET et al., 2008) e Korarchaeota (BARNS et al., 1996).
O termo Euryarchaeota vem do Grego “euryos” e quer dizer “amplo”, diverso; no sentido que este filo engloba uma grande diversidade fenotípica de arqueias cultiváveis, entre elas halófilas, metanogênicas, termoacidófilas e hipertermófilas (FORTERRE, BROCHIER; PHILIPPE, 2002; BERG et al., 2010).
O filo Crenarchaeota, sendo um dos primeiros a serem propostos, possuía representantes em vários ambientes, como o solo e mares (OCHSENREITER et al., 2003), além dos termófilos extremos, que suportam temperaturas superiores a 80oC. Seu nome veio do Grego “crenos”, origem. Entretanto, com o avanço dos estudos filogenéticos, seus representantes estão sendo alocados em novos filos, como no caso de representantes mesofílicos como o Cenarchaeum symbiosum (HALLAM et al., 2006), inicialmente reconhecido como representante do filo Crenarchaeota e, posteriormente, do filo Thaumarchaeota (BROCHIER-ARMANET et al., 2008).
Os representantes do Filo Thaumarchaeota são um grupo de arqueias predominantemente mesofílicas de difícil cultivo, compreendendo todas as arqueias oxidadoras de amônia (AOA), além de indivíduos de metabolismo ainda desconhecido (PESTER, SCHLEPER; WAGNER, 2011). “Thaumas”, do grego “maravilha”, foi o nome escolhido para esse novo filo por Brochier-Armanet e colaboradores em 2008, quando, usando não apenas análises de 16S rRNA, mas também marcadores genéticos, mostraram, por meio de árvores filogenéticas, que Cenarchaeum symbiosum, uma arqueia mesofílica que havia sido recentemente descoberta (HALLAM et al., 2006), era, na verdade, o primeiro membro deste grupo a ter seu genoma publicado (BROCHIER-ARMANET et al., 2008). Este filo está divido em três grupos: I.1a, formado por arqueias mesofílicas encontradas em diversos habitats (DELONG, 1998); I.1b: formado por AOAs do solo, águas termais, água doce e seus sedimentos (ZHALNINA et al., 2014); e I.1c: arqueias mesofílicas do solo, amplamente encontradas em florestas (JURGENS, LINDSTROM; SAANO, 1997b; OCHSENREITER et al., 2003; HU et al., 2013). O grupo I.1a possui um representante cultivado, Nitrosopumilus maritimus (WALKER et al., 2010).
Barns e colaboradores (1996), estudando microrganismos em águas termais do Parque Nacional de Yellowstone, encontraram um novo grupo de arqueias termófilas que divergiram do Filo Crenarchaeota no início do processo evolutivo. Korarchaeota vem do Grego “koros”: homem ou mulher jovem, em menção a essa divergência evolutiva. Até 2006, 19 novas sequências de supostos membros desse filo haviam sido publicadas, todos os genes em questão foram obtidos por PCR de águas termais, fontes sulfurosas ou respiradouros submarinos, quando Auchtung e colaboradores desenvolveram primers específicos para esse filo, mostrando, pelo alto grau de conservação de seus genes, influência do isolamento geográfico sobre os indivíduos desse filo (BARNS et al., 1994; AUCHTUNG, TAKACS- VESBACH; CAVANAUGH, 2006).
O filo Nanoarchaeota foi descoberto em 2002, quando uma arqueia de genoma diminuto (~490 kb) foi cultivada juntamente com seu simbionte do gênero Igniccocus e denominada Nanoarchaeum equitans (HUBER et al., 2002). Esta arqueia é termofílica (90oC), vivendo na presença de enxofre, em uma atmosfera de H2 e CO2 (HOHN, HEDLUND; HUBER, 2002). Entretanto, sua classificação filogenética ainda é incerta, com novos estudos mostrando que artefatos podem surgir de classificações filogenéticas dentro de um domínio ainda “em construção” (BROCHIER et al., 2005).
Hoje já se sabe que as arqueias possuem papéis importantes nos ciclos geobioquímicos (BERG et al., 2010; MEYER-DOMBARD, AMEND; OSBURN, 2013), revisado por (OFFRE, SPANG; SCHLEPER, 2013). Venter e colaboradores, estudando o metagenoma do mar do Sargaço, observaram que altas concentrações de nitritos podem ser resultado da oxidação da amônia por parte de arqueias (VENTER et al., 2004). O que veio a ser comprovado em 2005, com o isolamento de uma arqueia marinha pertencente ao filo Crenarchaeota, com atividade nitrificante (KONNEKE et al., 2005). Com cerca de 20% de todos os procariotos nos mares pertencendo ao domínio Archaea, fica clara sua importância (KARNER, DELONG; KARL, 2001).
Treusch e colaboradores, no mesmo ano, encontraram não apenas arqueias marinhas, mas também componentes terrestres mesofílicos do filo Crenarchaeota capazes de oxidar amônia; não apenas em condições aeróbias, mas também, potencialmente, em condições anaeróbias (TREUSCH et al., 2005). A participação das arqueias entre os procariontes do solo é de 1 a 5% em suas camadas superficiais (BATES et al., 2011). Posteriormente, essas arqueias foram enquadradas em um novo filo, Thaumarchaeota, onde estão classificados todos os oxidadores de amônia nos grupos I.1a e I.1b (STAHL; DE LA TORRE, 2012).
Estudos com base em estudos filogenéticos e comparativos usando o gene amoA, que codifica a subunidade alfa da enzima amônia monooxigenase, envolvida na oxidação da amônia, mostram novas possíveis classificações para essas AOAs (PESTER et al., 2012); revisado por (STAHL; DE LA TORRE, 2012).
Fica claro que muito ainda há por ser descoberto em relação a este domínio; o uso de técnicas como a genômica unicelular associadas à metagenômica na análise de habitats ainda pouco conhecidos pode nos ajudar a elucidar os relacionamentos filogenéticos e evolutivos microbianos (RINKE et al., 2013)
Em procariontes, os genes que codificam o 16S rRNA e seu similar nos eucariontes (18S rRNA), são utilizados em análises evolutivas baseadas nas suas sequências, sendo Carl Woese o pioneiro em seu uso. Esses genes são ótimos candidatos para esse tipo de análise,
tendo em vista sua distribuição universal, funcionalidade constante, além de serem conservados e apresentarem comprimento adequado para prover uma visão profunda dos relacionamentos evolutivos dos organismos em estudo. Além disso, existem extensos bancos de dados de 16S rRNA, como o Ribosomal Database Project (RDP), disponível online em
http://rdp.cme.msu.edu ou, ainda, o SILVA Database com base de dados de 16S/18S rRNA,
disponível online em http://arb-silva.de (COLE, 2007; QUAST et al., 2013). Entretanto, apesar desses genes serem úteis neste tipo de análise, o nível de variação entre estes genes é normalmente insuficiente para uma classificação em níveis mais específicos, como espécie.
Hoje é fato que os microrganismos presentes nos mais diversos habitats ainda são, em grande parte, desconhecidos. O uso de técnicas como o sequenciamento de alto desempenho ou, ainda, a metagenômica, nos revela novos genomas, muitas vezes de microrganismos ainda não cultivados, agregando novos grupos aos já conhecidos.
Na rizosfera, as plantas apresentam um série de interações com raízes de outras plantas e com a microbiota do solo. Estas comunidades microbianas são sustentadas pelas grandes quantidades de carbono orgânico produzidas pelas raízes (BUEE et al., 2009). Elas são influenciadas por exsudatos liberados pelas raízes, em um fenômeno chamado “rizodeposição”, onde, além da liberação de exsudatos, ocorre a produção de mucilagens e deposição de células das raízes. Inclusive, as próprias características físico-químicas destes solos podem ser modificadas por esses exsudatos (BAIS et al., 2006). Essa influência das plantas sobre a microbiota do solo pode ser tanta que estudos falam em “solos supressores de doenças” (disease-suppressive soils), onde a incidência de diversas doenças é menor, se comparada a solos adjacentes, mesmo com a presença do patógeno nesses solos (WELLER et al., 2002). Um estudo sobre os mecanismos moleculares de defesa das rizobactérias contra patógenos das raízes cita alguns mecanismos: desde a produção de antibióticos pela microbiota residente contra patógenos até a estimulação e suporte seletivo de populações antagonistas destes patógenos pelas plantas (COOK et al., 1995).
Existem diversos atores na rizosfera, como vírus, fungos, bactérias e arqueias (SUGIYAMA et al., 2014).
Em um estudo usando DGGE, a liberação de exsudatos das raízes foi relacionada com a composição das comunidades microbianas da rizosfera (YANG; CROWLEY, 2000).
Os fungos micorrízicos crescem nessa rizosfera em uma relação simbiótica bem estudada com as plantas, especialmente leguminosas. Possuem papel ativo na modificação da
microbiota do solo e são modificados por ação dos exsudatos vegetais (BENDER, DA SILVA VALADARES; TAUDIERE, 2014).
Raízes de milho produzem exsudatos capazes de atrair uma rizobactéria colonizadora benéfica, Pseudomonas putida, que compete com bactérias patogênicas (NEAL et al., 2012).
Em um trabalho sobre as arqueias aderidas às raízes de tomateiros usando DGGE, observou-se que cerca de 40% da variação entre as comunidades associadas às raízes pode ter sido ocasionada por mudanças na composição dos exsudados em virtude do status nutricional de ferro das plantas (SIMON, DODSWORTH; GOODMAN, 2000).
Por outro lado, também existem patógenos nos solos, como fungos, bactérias, nematóides e vírus. O pirosequenciamento tem sido utilizado com sucesso no estudo da presença de possíveis patógenos em plantas, como, por exemplo, no caso da identificação de vírus ou, ainda, no estudo de bactérias simbiontes de insetos vetores de doenças de plantas (AL RWAHNIH et al., 2009; HIRSCH et al., 2012; ROY et al., 2013).
Até o momento, não existe confirmação da existência de arqueias patogênicas; entretanto, em face do pouco conhecimento deste domínio, é possível que possam existir arqueias patogênicas ainda não identificadas em plantas.
Cavicchioli e colaboradores (2003), em um trabalho de revisão, analisaram diversos fatores que levariam a uma patogenicidade em arqueias:
a) exemplos de associação de arqueias com doenças; b) abundância das arqueias na natureza;
c) existência de interações entre arqueias e eucariontes; d) evidências de respostas imunes a arqueias;
e) arqueias habitando hospedeiros em número significativo, e
f) arqueias com estruturas moleculares semelhantes àquelas encontradas em patógenos.
Estes itens foram reavaliados à luz do conhecimento atual e com os dados deste trabalho.
As arqueias são ubíquas em virtualmente todos os habitats, como solos, mar, sedimentos, fontes termais, intestino de ruminantes e humanos, além de contribuírem substancialmente nos ciclos biogeoquímicos (JANSSEN; KIRS, 2008; MIRETE, DE FIGUERAS; GONZALEZ-PASTOR, 2011; CATÃO et al., 2013; OLIVEIRA, 2013; DEKAS et al., 2014; DONG et al., 2014; WANG et al., 2014). As arqueias são abundantes, chegando a perfazer 10% dos filotipos encontrados em diversos ambientes, sendo o restante composto
principalmente por bactérias, além de serem predominantes em ambientes extremos como fontes termais (ROBERTSON et al., 2005).
Apesar de ainda não terem sido encontrados indícios de arqueias patogênicas em plantas, vários trabalhos associam arqueias com doenças em humanos.
Arqueias já foram encontradas no intestino, vagina e gengivas humanas. No estudo das fezes de indivíduos, Methanobrevibacter smithii foi o microrganismo metanogênico mais abundante encontrado (MILLER; WOLIN, 1983). Na vagina, as amostras positivas para arqueias do gênero Methanobrevibacter foram obtidas de pacientes com vaginose bacteriana, um desequilíbrio da microbiota responsável por corrimento vaginal (BELAY et al., 1990). Diversos estudos associaram arqueias metanogênicas com periodontite, uma infecção anaeróbica causada por complexos microbianos: as chamadas placas dentais (LEPP et al., 2004; VIANNA et al., 2008). Methanobrevibacter oralis, uma arqueia pertencente ao filo Euryarchaeota, foi identificada em placas dentais e sua abundância foi relacionada com o grau de severidade da periodontite em humanos (BRINGUIER et al., 2013). Membros deste gênero (M. smithii e M. oralis) também foram identificados em gengivas humanas e de macacos (Macaca mulatta) (KEMP et al., 1983; KULIK et al., 2001). Pérez-Chaparro e colaboradores, em um estudo de revisão atual, analisaram dados de 41 estudos sobre periodontite, mostrando que o domínio Archaea, assim como diversas espécies bacterianas, estão envolvidos com essa doença (PEREZ-CHAPARRO et al., 2014). Em um estudo comparativo das microbiotas de raspados de língua de indivíduos sadios e com periodontite, abundâncias moderadas de arqueias foram encontradas em indivíduos sadios, enquanto que um aumento na abundância foi encontrado em indivíduos doentes (GOEHLER et al., 2014).
Essa relação entre o aumento da abundância de arqueias na microbiota bucal e incidência de doenças periodontais foi observada em inúmeros trabalhos. Existem indícios de que arqueias metanogênicas que habitam o intestino grosso de indivíduos com doenças severas de cólon poderiam contribuir para as doenças a partir de produção de metano, produzindo um ambiente adequado para o crescimento de microrganismos patogênicos, em um papel indireto no surgimento dessas doenças (DE MACARIO; MACARIO, 2009).
Todavia, recentemente, foi observada a indução de resposta inflamatória pela arqueia metanogênica M. stadtmanae em intestino humano, um importante fator indicativo de patogenicidade (BANG et al., 2014).
Outro possível indício de patogenicidade por parte das arqueias são as relações simbióticas. Um desequilíbrio na linha tênue entre simbiose e parasitismo pode levar a uma atividade patogênica por parte de um dos envolvidos sobre o outro. Alguns exemplos de
relações simbióticas conhecidas envolvendo arqueias: a interação entre Ignicoccus hospitalis, hospedeira da Nanoarchaeum equitans, uma nanoarqueia até o presente momento nunca cultivada sozinha (FORTERRE, GRIBALDO; BROCHIER-ARMANET, 2009). Também já foram registrados casos de simbiose entre arqueias e bactérias, como no caso da interação entre arqueias oxidadoras de metano e bactérias redutoras de sulfato (NAUHAUS et al., 2007).
Arqueias também são endossimbiontes de eucariontes, como no caso de ciliados marinhos vivendo em regiões anóxicas (EDGCOMB et al., 2011). Além disso, arqueias metanogênicas são encontradas no intestino de ruminantes (revisado por (JANSSEN; KIRS, 2008)).
O último fator a ser analisado em relação a uma possível patogenicidade de arqueias é a presença de assinaturas moleculares comuns a patógenos, como a produção de toxinas. As arqueias halófilas são conhecidas pela produção de toxinas, as halocinas, proteínas de tamanhos diversos capazes de inibir o crescimento de outras arqueias halófilas (O'CONNOR; SHAND, 2002). No entanto, ainda não foi encontrada toxicidade contra membros dos demais domínios (HASELTINE et al., 2001).
Até onde sabemos, este trabalho é inédito, estudando o impacto do cultivo, especialmente do dendê, nas comunidades de arqueias, usando uma abordagem independente de cultivo com sequenciamento de alto desempenho, capaz de identificar microrganismos cultivados e não cultivados, além de gerar um grande número de sequências, com uma boa cobertura da diversidade de arqueias desses solos. Além disso, foi observado o impacto do Amarelecimento Fatal sobre as comunidades de arqueias associadas a solos de dendezeiros acometidos por essa doença.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivos Gerais
Estudo dos impactos da implementação de uma monocultura (dendê) sobre a microbiota de arqueias de solo de mata nativa amazônica desmatada pra esse fim; além do estudo do impacto do Amarelecimento Fatal sobre as comunidades de arqueias de solos associados à dendezeiros cultivados em solos amazônicos.
3.2. Objetivos Específicos
• Caracterização e comparação das comunidades de arqueias do solo de mata nativa e cultivados com dendezeiros por meio da tecnologia do pirosequenciamento do gene que codifica o 16S rRNA.
• Caracterização e comparação das comunidades de arqueias de solos cultivados com dendezeiros com e sem sintomas de Amarelecimento Fatal por meio da tecnologia do pirosequenciamento do gene que codifica o 16S rRNA.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Coleta de Solo
A cidade de Moju, no Pará, está localizada a 117 km de Belém, é coberta por árvores de 25 a 35 m de altura em uma floresta tropical densa (RIBEIRO, SILVA; CARVALHO, 2003). O clima é equatorial, quente e úmido (Am), de acordo com a classificação de Köppen- Geiger, com temperaturas anuais variando de 25 a 27oC e precipitações entre 2.000 mm e 3.000 mm por ano, distribuídas irregularmente (COSTA et al., 1998). O solo é predominantemente latossolo amarelo (oxisol) (ALMEIDA et al., 2001).
As amostras de solos de dendezeiros foram coletadas em outubro de 2010 na época chuvosa na Agroindústria Marborges, em Moju, Pará, e a amostra de solo de mata nativa em uma região de floresta amazônica adjacente às áreas cultivadas (BERGMANN, 2013). A coleta foi realizada na Empresa Marborges em época de chuvas; no local ocorrem alagamentos, sendo muitas vezes necessárias drenagens dos solos nas áreas de plantio (Tabela 2).
Tabela 2 – Pontos de coleta na Agroindústria Marborges georreferenciados.
Ponto coleta DSA 0 DCA 5 DCA 8
1a amostra S02 000’28.9’’ W48037’57.4’’ S02000’29.7’’ W48037’57.6’’ S02000’29.0’’ W48037’57.2’’ 2a amostra S02 0 00’29.2’’ W48037’56.6” S02000’29.5’’ W48037’56.3’’ S02000’29.6’’ W48037’55.9’’ 3a amostra S02 000’31.3’’ W48037’54.3’’ S02000’30.7’’ W48037’55.9’’ S02000’31.6’’ W48037’53.6’’ Mata nativa 1a amostra S02o00’27.2” W048o35’53.0” DSA: dendezeiros sem AF; DCA: dendezeiros com AF.
Em cada ponto de coleta foi removida a camada vegetal superior e foram feitos 4 orifícios com 10 cm de profundidade. O solo assim obtido foi homogeneizado e peneirado, gerando amostras compostas. Dentro da escala de 10 estágios de severidade da doença, começando com o estágio 0 – sem sintomas, até o estágio 10, com morte da planta, foram escolhidos três grupos de palmeiras próximas em três estágios diferentes do AF: sem sintomas (estágio 0) e nos estágios 5 e 8 da doença; estando cada área a 30 metros de distância da área seguinte (Figura 5). Para a mata nativa foram coletados quatro pontos, os quais foram homogeneizados para formar uma amostra composta. Foi gerada uma codificação para
nomear as amostras que leva em consideração três fatores: o estágio da doença (DCA – dendezeiros com AF: 5 ou 8 e DSA – dendezeiros sem AF: 0), o grupo de palmeiras escolhido (1, 2 ou 3) e o lado da planta em que foi feita a coleta (1 ou 2) (Figura 5). As amostras foram armazenadas em sacos plásticos em gelo seco até serem armazenadas em freezer -80oC até o momento das análises.
Figura 5 - Desenho esquemático da amostragem dos solos. Cada grupo contém três dendezeiros em três estágios da doença. Os pontos 1 e 2 representam o lado da planta onde ocorreu a coleta.