Análises Filogenéticas

Foram organizadas em tabela todas as OTUs encontrados nas amostras, por grupo, evidenciando as diferenças entre as riquezas de arqueias nas amostras, assim como as abundâncias de cada nível filogenético (Tabela 6). Todas as OTUs encontradas fazem parte do domínio Archaea. Foi possível uma classificação até o nível de gênero de diversas OTUs. Foi encontrada uma maior riqueza na mata nativa, com 827 OTUs em nível de domínio, em comparação com a área cultivada com dendezeiros, com 253 OTUs. A mata nativa apresenta

maior riqueza no filo Euryarchaeota (303 OTUs) em comparação com a área cultivada com dendezeiros (135 OTUs). Também pode-se observar que apenas a mata nativa contém representantes classificados na Ordem Methanomicrobiales, um grupo de arqueias metanogênicas.

Tabela 6 – OTUs encontradas na análise filogenética das amostras de solo de mata nativa e área cultivada com dendezeiros.

Taxlevel RankID* Taxon Área

cultivada Mata nativa

Domínio 0.1 Archaea 253 827

Filo 0.1.1 Euryarchaeota 135 303

Classe 0.1.1.1 Halobacteria 17 18

Ordem 0.1.1.1.1 Halobacteriales 17 18

Família 0.1.1.1.1.1 Deep Sea Hydrothermal Vent Gp 6 (DHVEG-6) 2 2 Gênero 0.1.1.1.1.1.1 Unclassified Deep Sea Hydrothermal Vent Gp 6 2 2 Família 0.1.1.1.1.2 Miscellaneous Euryarchaeotic Group (MEG) 2 5

Gênero 0.1.1.1.1.2.1 Candidatus lainarchaeum 2 0

Gênero 0.1.1.1.1.2.2 Unclassified Miscellaneous Euryarchaeotic Group 0 5

Família 0.1.1.1.1.3 Unclassified Halobacteriales 13 11

Classe 0.1.1.2 Methanobacteria 3 4

Ordem 0.1.1.2.1 Methanobacteriales 3 4

Família 0.1.1.2.1.1 Methanobacteriaceae 3 4

Gênero 0.1.1.2.1.1.1 Methanobacterium 3 2

Gênero 0.1.1.2.1.1.2 Methanobrevibacter 0 1

Gênero 0.1.1.2.1.1.3 Unclassified Methanobacteriaceae 0 1

Classe 0.1.1.3 Methanomicrobia 40 126

Ordem 0.1.1.3.1 Methanocellales 36 81

Família 0.1.1.3.1.1 Methanocellaceae 36 81

Gênero 0.1.1.3.1.1.1 Methanocella 8 33

Gênero 0.1.1.3.1.1.2 Rice Cluster I 25 43

Gênero 0.1.1.3.1.1.3 Unclassified Methanocellaceae 3 5

Ordem 0.1.1.3.2 Methanomicrobiales 0 4

Família 0.1.1.3.2.1 Methanomicrobiaceae 0 2

Gênero 0.1.1.3.2.1.1 Methanoculleus 0 2

Família 0.1.1.3.2.2 Methanoregulaceae 0 1

Gênero 0.1.1.3.2.2.1 Methanoregula 0 1

Família 0.1.1.3.2.3 Unclassified Methanomicrobiales 0 1

Ordem 0.1.1.3.3 Methanosarcinales 4 41 Família 0.1.1.3.3.1 Methanosarcinaceae 4 41 Gênero 0.1.1.3.3.1.1 Methanimicrococcus 0 1 Gênero 0.1.1.3.3.1.2 Methanosarcina 4 48 Classe 0.1.1.4 Thermoplasmata 52 106 Ordem 0.1.1.4.1 Thermoplasmatales 52 106

Família 0.1.1.4.1.2 Terrestrial Miscellaneous Gp (TMEG) 16 36

Família 0.1.1.4.1.3 Thermoplasmatales Incertae Sedis 2 18

*

O RankID é uma classificação numérica conferida pelo programa MOTHUR e está taxonomicamente representada na coluna Taxlevel.

Continuação Tabela 6 – OTUs encontradas na análise filogenética das amostras de solo de mata nativa e área cultivada com dendezeiros.

Taxlevel RankID* Taxon Área

cultivada Mata nativa

Gênero 0.1.1.4.1.3.1 Candidatus Methanomethylophilus 0 12

Família 0.1.1.4.1.2 Terrestrial Miscellaneous Gp (TMEG) 16 36

Família 0.1.1.4.1.3 Thermoplasmatales Incertae Sedis 2 18

Gênero 0.1.1.4.1.3.1 Candidatus Methanomethylophilus 0 12

Gênero 0.1.1.4.1.3.2 Methanomassiliicoccus 2 6

Família 0.1.1.4.1.4 Unclassified Thermoplasmatales 34 52

Classe 0.1.1.5 Unclassified Euryarchaeota 23 49

Filo 0.1.2 Thaumarchaeota 103 484

Classe 0.1.2.1 Marine Group I 2 2

Ordem 0.1.2.1.1 Unclassified Marine Group I 2 2

Classe 0.1.2.2 Miscellaneous Crenarchaeotic Group 4 16

Ordem 0.1.2.2.1 Unclassified Miscellaneous Crenarchaotic Group 4 16

Classe 0.1.2.3 OPPD003 0 1

Ordem 0.1.2.3.1 Unclassified OPPD003 0 1

Classe 0.1.2.4 Soil Crenarchaeotic Group (SCG) 24 218

Ordem 0.1.2.4.1 Unknown Order 6 48

Família 0.1.2.4.1.1 Unknown Family 6 48

Gênero 0.1.2.4.1.1.1 Ca. Nitrososphaera 6 48

Ordem 0.1.2.4.2 Unclassified Soil Crenarchaeotic Group 18 170 Classe 0.1.2.5 South African Gold Mine Gp 1(SAGMCG-1) 25 104

Ordem 0.1.2.5.1 Unknown Order 12 49

Família 0.1.2.5.1.1 Unknown Family 12 49

Gênero 0.1.2.5.1.1.1 Ca. Nitrosotalea 12 49

Ordem 0.1.2.5.2 Unclassified South African Gold Mine Gp 1 13 55

Classe 0.1.2.6 Terrestrial Group 36 94

Ordem 0.1.2.6.1 Unclassified Terrestrial Group 36 94

Classe 0.1.2.7 Unclassified Thaumarchaeota 12 49

Filo 0.1.3 Unclassified Archaea 15 40

*

O RankID é uma classificação numérica conferida pelo programa MOTHUR e está taxonomicamente representada na coluna Taxlevel.

Foi elaborado um diagrama de Venn das duas amostras, onde se pode comparar as riquezas compartilhadas e as similaridades entre as OTUs das amostras (Figura 9).

Figura 9 - Número de OTUs compartilhadas e únicas nas amostras de mata nativa e área cultivadas com dendezeiros.

A mata nativa apresenta um total de 821 OTUs (86,97% do total de OTUs encontradas nas duas amostras), enquanto que a área cultivada com dendezeiros possui 253 OTUs (26,8% do total de OTUs encontradas nas duas amostras). As amostras compartilham 130 OTUs (13,8% das OTUs totais). A riqueza total é de 944 OTUs. Além disso, a riqueza compartilhada estimada pelo índice de Chao compartilhado (199 OTUs, 21%) é maior do que a encontrada nas amostras. Mais da metade das OTUs da área cultivada com dendezeiros são compartilhadas com a mata nativa; esta com uma riqueza bem maior que a primeira. Além disso, das 130 OTUs em comum entre as amostras, 100 são Thaumarchaeota não classificadas em nível de classe (Figura 9).

Os percentuais de participação das OTUs classificadas a 97% de similaridade em até o nível de classe na amostra de solo de mata nativa estão representados na Figura 10a; 10b no filo Euryarchaeota; e 10c no filo Thaumarchaeota.

Figura 10 –Percentuais de participação das OTUs classificadas a 97% de similaridade em até o nível de classe: (a) na amostra de solo de mata nativa; (b) no filo Euryarchaeota e, (c) no filo Thaumarchaeota, por Krona.

As OTUs da mata nativa foram classificadas em apenas dois filos, Euryarchaeota e Thaumarchaeota, além de um pequeno percentual de OTUs não classificadas em nível de filo (5%) (Figura 10a). O filo Thaumarchaeota possui maior representação (59%), em comparação com o filo Euryarchaeota (37%) (Figura 10c). A classe mais abundante observada foi Soil Crenarchaeotic Group com 26% de todas as OTUs da amostra de mata nativa e 45% de todas as OTUs do filo Thaumarchaeota. A segunda classe mais abundante foi Methanomicrobia, com 15% de todas as OTUs de mata nativa e 42% de todas as OTUs do filo Euryarchaeota (Figura 10b). Os percentuais de participação das OTUs classificadas a 97% de similaridade em até o nível de classe de arqueias na amostra de solo da área cultivada com dendezeiros estão representados na Figura 11a; 11b do filo Euryarchaeota; e 11c do filo Thaumarchaeota.

Figura 11 – Percentuais de participação das OTUs classificadas a 97% de similaridade em até o nível de classe: (a) na amostra de solo da área cultivada com dendezeiros; (b) no filo Euryarchaeota e, (c) no filo

Thaumarchaeota, por Krona.

Assim como a mata nativa, a área cultivada com dendezeiros possui OTUs classificadas em apenas dois filos, Euryarchaeota e Thaumarchaeota, além de um pequeno

percentual de OTUs não classificadas em nível de filo (6%). Entretanto, diferentemente da mata nativa, a área cultivada com dendezeiros possui maior representação do filo Euryarchaeota (53%), em comparação com o filo Thaumarchaeota (41%) (Figura 11a). A classe mais abundante observada foi Thermoplasmata com 21% de todas as OTUs da amostra da área cultivada com dendezeiros e 39% de todas as OTUs do filo Euryarchaeota (Figura 11b). A segunda classe mais abundante foi Methanomicrobia, com 16% de todas as OTUs da área cultivada com dendezeiros e 30% de todas as OTUs do filo Euryarchaeota.

A Figura 12 apresenta uma árvore filogenética com 20 OTUs de cada amostra, todas pertencentes ao filo Thaumarchaeota, não classificadas em nível de classe, juntamente com representantes do filo Euryarchaeota e outras sequências de referência. Em negrito estão representadas OTUs encontradas nas duas amostras: entre parêntesis o número de OTUs na amostra de mata nativa e área cultivada com dendezeiros, respectivamente.

Foi possível observar que uma OTU da mata nativa agrupou-se com o grupo I.1b (NF6), assim como 3 OTUs agruparam-se com o grupo I.1c (NF17, CA50 e CA52). As demais OTUs agruparam-se com um diversas arqueias classificadas como Miscellaneous Crenarchaeotic Group. Entretanto, estas OTUs são diferentes entre si, agrupando-se em diversos clusters distintos, mas todos relacionados com Miscellaneous Crenarchaeotic Group, do filo Thaumarchaeota.

As diferenças entre os percentuais das OTUs classificadas em nível de classe das amostras de mata nativa e área cultivada com dendezeiros com um intervalo de confiança de 95% estão representadas em um perfil taxonômico comparativo (Figura 13). Foi usado o teste exato de Fisher. Estão representados apenas os agrupamentos de sequências classificadas em até o nível de classe que apresentaram diferenças significativas entre as amostras com diferenças entre as proporções maiores que 0,5%.

Foram observadas diferenças significativas entre as amostras, especialmente entre Soil Crenarchaeotic Group e South African Gold Mine Gp 1. Soil Crenarchaeotic Group possui maior proporção de sequências na amostra de mata nativa (57%), em relação à área cultivada com dendezeiros (41,6%). O contrário ocorre com South African Gold Mine Gp 1, com 11,7% para a mata nativa em relação à 23,7% para a área cultivada com dendezeiros. Miscellaneous Crenarchaeotic Group e Thermoplasmata apresentam representação ligeiramente maior na área cultivada com dendezeiros (1,5% e 8,9% contra 0,4% e 8,1% da mata nativa, respectivamente).

Figura 12 – Árvore filogenética construída a partir de sequências de 16S rRNA classificadas como unclassified Thaumarchaeota das amostras de mata nativa (NF) e área cultivada com dendezeiros (CA), por MEGA6. As OTUs em negrito foram encontradas nas duas amostras: entre parêntesis está representado o número de sequências classificadas como esta OTU para a amostra de mata nativa e área cultivada com dendezeiros, respectivamente.

CA = área cultivada com dendezeiros; NF = mata nativa; B = Acidobactéria; C = Crenarchaeota; E =Euryarchaeota; MCG = Miscellaneous Crenarchaeotic Group; TI.1a = Thaumarchaeota grupo I.1a; TI.1b = Thaumarchaeota grupo I.1b; TI.1c = Thaumarchaeota grupo I.1c. Foi usado com um bootstrap de 1.000 repetições. Os valores de bootstrap acima de 50% estão representados nos nós da árvore e as OTUs foram selecionadas a 97% de similaridade.

Figura 13 – Perfil taxonômico comparativo das OTUs classificadas em até o nível de classe das amostras de mata nativa (em laranja) e área cultivada (em azul) computadas pelo MOTHUR.

Apenas os grupos de OTUs classificadas em até o nível de classe com diferenças biológicas significativas (q < 0,05, e diferenças entre as proporções > 1%) estão representadas. O teste exato de Fisher foi usado, por STAMP.

A análise das OTUs classificadas até o nível de gênero mostra que grande número das OTUs não foram classificadas neste nível nas duas amostras (Figuras 14a e 14b).

Figura 14 – Percentuais de OTUs classificadas em até o nível de gênero nas amostras: (a) de mata nativa e (b) área cultivada com dendezeiros. O somatório dos percentuais das OTUs classificadas em até o nível de gênero representa 100% das OTUs das amostras, por Krona.

Continuação da Figura 14 - Percentuais de OTUs classificadas em até o nível de gênero nas amostras (a) de mata nativa e (b) área cultivada com dendezeiros, por Krona.

O somatório dos percentuais das OTUs classificadas em até o nível de gênero representa 100% das OTUs das amostras.

Entre as OTUs classificadas em nível de gênero, dois gêneros candidatos apresentam a maior representação na amostra de mata nativa: Ca. Nitrosotalea e Ca. Nitrososphaera, ambos representantes do filo Thaumarchaeota, com 6% de participação cada um no total de OTUs da mata nativa. Entre as OTUs classificadas em nível de gênero no filo Euryarchaeota destacam- se três agrupamentos na classe Methanomicrobia: Rice Cluster I (5%), Methanocella (4%) e

Methanosarcina (5%) (Figura 14a).

A amostra de área cultivada com dendezeiros também possui a grande maioria das OTUs não classificadas em nível de gênero. Entre os classificados, Rice Cluster I, com 10% do total das OTUs da amostra, é o mais abundante agrupamento de OTUs em nível de gênero encontrado nessa amostra. Além disso, outros classificados apresentaram representatividade menor: Ca. Nitrosotalea (5%), Methanocella (3%), Ca. Nitrososphaera (2%) e

As diferenças entre os percentuais das OTUs classificadas em até o nível de gênero das amostras de mata nativa e área cultivada com dendezeiros com um intervalo de confiança de 95% estão representadas por meio de um perfil taxonômico comparativo (Figura 15). Estão representados apenas os agrupamentos de sequências que apresentaram diferenças significativas entre as amostras, com diferenças entre as proporções maiores que 0,5%.

Figura 15 – Perfil taxonômico comparativo das OTUs classificadas em até o nível de gênero das amostras de mata nativa (em laranja) e área cultivada (em azul) computadas pelo MOTHUR.

Estão representados apenas os grupos de OTUs classificadas em até o nível de gênero com diferenças biológicas significativas (q < 0,05, e diferenças entre as proporções > 0,5%). Foi usado o teste exato de Fisher, por STAMP.

Existem diferenças significativas entre as amostras, especialmente entre Ca. Nitrososphaera (18,2% na mata nativa e 10,3% na área cultivada com dendezeiros) e Ca. Nitrosotalea (4,3% e 10,1%), além de Methanosarcina (1,6% e 2,7%) e Rice Cluster I (6,1% e 5,1%). Entre os não classificados, as maiores diferenças se encontram entre os representantes do unclassified Soil Crenarchaeotic Group (38,8% na mata nativa contra 31,2% na área cultivada com dendezeiros) e unclassified South African Gold Mine Gp 1, com 7,3% na mata nativa contra 13,5% na área cultivada com dendezeiros (Figura 15).

5.2. Análise das Comunidades de Arqueias de Solos de Dendezeiros com e sem Sintomas

de AF