Foram utilizados ¾ de placa do sequenciador 454 Life Sciences para todas as amostras, as quais foram divididas em três regiões da placa; (a) ¼ de placa com cinco amostras de dendezeiros, (b) ¼ de placa com quatro amostras de dendezeiros e, (c) ¼ de placa com a amostra de mata nativa.
A amostra de área cultivada com dendezeiros foi obtida a partir das três réplicas biológicas da área cultivada sem sintomas de AF (grupo 0), as quais foram agrupadas para gerar a amostra área cultivada.
O processo de controle de qualidade e as demais análises foram realizados com o pacote de softwares MOTHUR, versão 1.33.3 (SCHLOSS et al., 2009), de acordo com o
script 454 Standart Operational Procedure (SCHLOSS, GEVERS; WESTCOTT, 2011),
disponível online (http://www.mothur.org/wiki/454_SOP).
O comando sffinfo foi utilizado para a extração dos arquivos .fasta, .qual e .info a partir do arquivo .sff. A redução de erros de sequenciamento foi feita utilizando-se flowgrams. Inicialmente as sequências foram separadas de acordo com seus barcodes e primers com o comando trim.flows. O denoise foi realizado com o comando shhh.flows, usando o algoritmo PyroNoise (QUINCE et al., 2009). Os barcodes e primers foram removidos com o comando
O processamento das sequências melhoradas teve início com o comando unique.seqs para simplificação do conjunto de dados, trabalhando-se, assim, com as sequências únicas. As sequências assim obtidas foram alinhadas pelo comando align.seqs, usando o banco de dados de arqueias 16S SILVA 119, disponível online (http://www.arb-silva.de) como referência (QUAST et al., 2013), com 97% de similaridade. As sequências que não alinharam corretamente foram removidas pelo comando screen.seqs. A remoção das colunas no alinhamento sem dados foi feita usando-se o comando filter.seqs. Um novo agrupamento de sequências iguais foi feito pelo comando unique.seqs. O passo final na redução dos erros de sequenciamento foi feito com o comando pre.cluster, o qual une sequências que possuam 2 pb de diferença de uma sequência mais abundante. As quimeras foram removidas por meio do comando chimera.uchime, que usa as próprias sequências como referência, usando o algoritmo UCHIME (EDGAR et al., 2011). O comando remove.seqs foi utilizado para a remoção das quimeras encontradas e possíveis contaminantes foram removidos com o comando classify.seqs, seguindo do comando remove.lineage. A análise de erro foi feita com o comando filter.seqs.
Para as análises comparativas entre mata nativa e área cultivada o comando get.groups foi utilizado, seguido dos comandos merge.groups e merge.files, unindo, assim as réplicas biológicas da área cultivada com dendezeiros. Para as análises comparativas das comunidades de arqueias com e sem sintomas de AF os grupos 0, 5 e 8 foram criados de maneira análoga. O comando merge.files criou arquivos .fasta, .names, .groups e .taxonomy para todas as amostras, os quais foram utilizados para as análises posteriores.
Após normalização destes arquivos para o número de sequências da menor amostra usando o comando sub.sample, foram gerados arquivos de saída para análises no programa STAMP versão 2.0.2 (PARKS et al., 2014).
Para as análises das OTUs foi gerada uma matriz de distância com o comando
dist.seqs, usando o método “one-gap”. O comando cluster foi usado para agrupar as
sequências em OTUs baseadas na matriz de distância e arquivo names, a 97% de similaridade (distância genética de 0,03) usando o método “nearest neighbor”. O comando make.shared criou uma tabela indicando o número de vezes que cada OTU aparece em cada amostra. O passo final foi a normalização do número de sequências para que todas as amostras apresentem o mesmo número de sequências que a menor amostra; o comando sub.sample foi utilizado. As OTUs foram classificadas (classify.otu) e os filotipos foram obtidos (phylotype). Para as análises de α-diversidade, curvas de rarefação foram geradas (rarefaction.single), os índices de riqueza Chao1 (CHAO; SHEN, 2003) e ACE (CHAO, 2010), Cobertura de Good
(GOOD, 1953) e índices de diversidade de Shannon (SHANNON; WEAVER, 1949) e Simpson invertido (SIMPSON, 1964) foram calculados (summary.single). Para o estudo da β- diversidade, foi gerado um diagrama de Venn (FAUTH et al., 1996) usando OTUs agrupadas a 97% de similaridade e o índice de Chao compartilhado. O programa Past, versão 3.04, foi usado para a elaboração de PCAs dos dados químicos e filogenéticos dos três grupos: 0, 5 e 8 (HAMMER, HARPER; RYAN, 2001).
Uma árvore filogenética foi criada usando todas as OTUs unclassified
Thaumarchaeota ao nível de classe para cada amostra. Após isso, 20 OTUs de cada amostra
foram escolhidas aleatoriamente pelo programa MOTHUR para a elaboração de uma nova árvore, a qual se mostrou representativa de todas as OTUs, além de representantes do filo Euryarchaeota encontrados nas amostras. O software MEGA6 (TAMURA et al., 2013), usando o método Neighbour-Joining e correção Jukes-Cantor, foi usado com um bootstrap de 1.000 repetições. Os valores de bootstrap acima de 50% estão representados nos nós da árvore. Além disso, as OTUs foram selecionadas a 97% de similaridade, para evitar redundâncias na árvore filogenética. As sequências foram alinhadas com representantes dos principais grupos do domínio Archaea: Methanosarcina baltica (AB973356), Methanoregula
formicica (NR112877), Methanocella paludicola (NR074192), Halococcus hamelinensis
(LN651155) e Pyrococcus furiosus (U20163) do filo Euryachaeota; Pyrobaculum aerophilum (NR102764) do filo Crenarchaeota; Ca. Nitrososphaera sp. (FR773157) e Ca. Nitrososphaera gargensis (GU797786) do grupo I.1b do filo Thaumarchaeota; Nitrosopumilus maritimus (JQ346765) e Cenarchaeum symbiosum (U51469) do grupo I.1a do filo Thaumarchaeota;
Uncultured acidic red soil AOA archaeon (FJ174727), Uncultured trembling aspen archaeon
(EF021427) e Boreal forest archaeon (X96688) do grupo I.1c do filo Thaumarchaeota e vários Uncultured da classe Miscellaneous Crenarchaeotic Group (FR745121, AM910782, JX984848, KC510333, FJ485299, KC831395, FJ920714, FJ485307, HM051127, HM051130 e HM051125). Uma Acidobacteria bacterium KBS 96 (FJ870384) foi usada como outlier.
O software Krona gerou os gráficos usados para determinação dos percentuais de filos, classes e gêneros nas amostras (ONDOV, BERGMAN; PHILLIPPY, 2011).
As análises comparativas entre as sequências classificadas em nível de classes e gêneros relevantes entre as amostras foram realizadas com o programa Statistical Analysis of
Methagenomic Profiles Software - STAMP (PARKS et al., 2014). Para as análises
comparativas entre as amostras foi usado o teste exato de Fisher (q-value < 0,05). O intervalo de confiança foi calculado usando o método Asymptotic (NEWCOMBE, 1998). A correção do valor de q foi calculada usando a abordagem de Storey FDR (STOREY, TAYLOR;
SIEGMUND, 2004). Foi usado um filtro onde apenas as diferenças entre as proporções acima de 0,5% são apresentadas nas figuras. Este teste foi usado para estimar as diferenças significativas entre as classes e gêneros encontrados nas amostras de mata nativa e área cultivada e entre as classes e gêneros encontrados nas amostras de solo de dendezeiros com e sem sintomas de AF.