Análise dos isômeros de mioinositóis produzidos a partir da hidrólise do

Na amostra controle (t=0h) além de Ins(1,2,3,4,5,6)P6 foi encontrado pequena quantidade de D/L-Ins(1,2,4,5,6)P5, presente no fitato usado. Depois de 2h de reação enzimática, um decréscimo na concentração de InsP6 e aumento significativo na concentração de D/L-Ins(1,2,4,5,6)P5 foi observada. Após 8h de hidrólise enzimática, o InsP6 foi completamente degradado e a concentração de D/L- Ins(1,2,4,5,6)P5 aumentou ainda mais. Também foi observado um aumento da concentração de fosfato inorgânico (Pi) ao longo do tempo. Mesmo após as 8h de

tratamento enzimático, não foi identificado nenhum outro mioinositol fosfato além de D/L-Ins(1,2,4,5,6)P5, ou seja, a fitase utilizada é capaz de liberar apenas o grupo fosfato ligado à posição D/L C-3 da molécula de fitato (Figura 10). Portanto, a fitase de R. aquatilis pertence ao grupo das 3-fitases, enzimas que iniciam a desfosforilação do fitato a partir do carbono D/L C-3 e que representam a maioria das fitases microbianas (SINGH; SATYANARAYANA, 2015).

Herter et al. (2006) obtiveram resultados semelhantes para a enzima produzida por E. cloaceae, também capaz de desfosforilar apenas a posição C-3 do fitato. Outra propriedade comum a ambas as enzimas é a capacidade de aceitar

açúcares fosfatados como substratos. É muito provável que estes sejam os substratos naturais destas enzimas, podendo ser consideradas como uma glicose-1- fosfatase com alta atividade de fitase.

Algumas fitases são capazes de hidrolisar o fosfato ligado a diferentes posições da molécula de fitato. A fitase produzida por Klebsiella sp. foi capaz de hidrolisar o fitato até Ins(2)P1, gerando diferentes intermediários de mioinositol por duas vias diferentes (SAJIDAN et al., 2004), bem como as fitases produzidas por uma bactéria aquática da Malásia (GREINER et al., 2007a), por E. coli (GREINER; KONIETZNY; JANY, 1993) e pelo fungo Aspergillus sp. (WYSS et al, 1999); no entanto, as vias hidrolíticas são diferentes. Além disso, outras fitases podem desfosforilar o fitato apenas parcialmente.

A análise dos produtos formados pela fitase de Rhizopus oligosporus detectou presença de InsP3 e InsP5 (isômeros não citados) (CASEY; WALSH, 2004). O produto final da hidrólise da fitase produzida por Paramecium sp. foi Ins(2,3)P2 (KAAYJ; HAASTERT, 1995), e, no caso da fitase de K. terrigena, após rápida degradação do InsP6, InsP5 e InsP4, passou a acumular InsP3, provavelmente porque o aumento de fósforo inibiu a ação da enzima frente ao substrato (GREINER et al., 1997). O mesmo ocorreu para as hélice-_{β fosfatases de}

Shewanella oneidensis, B. subtilis e B. amyloliquefaciens, em que o produto final da

degradação do fitato foi o Ins(2,4,6)P3 (GREINER et al., 2007b). Em nenhum desses casos foi observada a hidrólise total do fitato em inositol já que não houve liberação de fosfato na posição C-2. Este fenômeno pode ser explicado porque os grupos PO4

estão ligados ao inositol na configuração equatorial, exceto o grupo 2-fosfato, que está ligado na configuração axial, impedindo a ação das fitases sobre esta região (WYSS et al., 1999).

Figura 10. Análise por HPLC dos produtos da hidrólise do Na-fitato pela enzima purificada de R.

aquatilis. A. Padrões: 1) Pi/IP1; 2) I(146)P3; 3) I(456)P3; 4) I(1235)P4/I(1246)P4; 5)

I(1234)P4/I(1346)P4; 6) I(1345)P4; 7) I(1256)P4; 8) I(2456)P4; 9) I(12346)P5; 10) I(12345)P6; 11) I(12456)P5; 12) I(13456)P5; 13) I(123456)P6. B. Controle, 0h hidrólise. C. 2h hidrólise. D. 4h hidrólise. Corrida de 30min.

6. Avaliação da atividade antioxidante dos mioinositóis produzidos A

B

C

Os ensaios de DPPH e ORAC são utilizados como indicadores de atividade antioxidante in vitro, mas possuem diferentes mecanismos reacionais. O DPPH é um radical livre estável com um elétron não pareado, de onde vem sua ação oxidante. Quando um composto antioxidante doa um próton, o radical é eliminado (GAO; CAO; LI, 2010). O ensaio ORAC estima a atividade antioxidante perante o radical peroxil induzido pela decomposição do AAPH (SHARMA; BHAT, 2009). Este radical livre ataca a sonda fluorescente, diminuindo sua intensidade. Compostos antioxidantes protegem a sonda de perder sua fluorescência (MACEDO et al., 2011).

O Ins(1,2,4,5,6)P5 produzido a partir da degradação do fitato pela fitase de R. aquatilis (após 8h de reação, quando a concentração do mioinositol era máxima) demonstrou um potencial antioxidante em relação ao fitato puro em ambas metodologias. Quando comparado o tempo 0h de reação (controle) e o tempo 8h de reação (conversão completa de IP6 em IP5) observa-se que não houve diferença estatística entre eles no método ORAC, indicando que a atividade antioxidante detectada pode ser devido a outros compostos presentes no preparado enzimátio. No entanto, no método DPPH o equivalente Trolox quase que dobrou em relação ao controle (Tabela 8). O principal mecanismo antioxidante dos mioinositóis age inibindo a formação do radical hidroxil (OH’) catalisada pelo ferro em reações envolvendo peróxido (H2O2), pela complexação dos íons Fe3+, de forma que todo os

seis sítios de coordenação estejam ocupados. Isto ocorre entre os grupos fosfatos das posições 1, 2 e 3 pela configuração equatorial-axial-equatorial (SCHLEMMER et al., 2009).

Tabela 8. Potencial antioxidante do fitato hidrolisado com a enzima produzida por R.

aquatilis. Amostra ORAC DPPH Equivalente Trolox (µmol/mg) Variação concentração amostra (mg/mL) R² Equivalente Trolox (µmol/mg) Fitato + fitase R. aquatilis (0h) 543,3 ± 67,7a 0,5 – 2,5 0,99 6,6 ± 0,8a Fitato + fitase R. aquatilis (8h) 570,0 ± 60,0a 0,5 – 2,5 0,99 11,7 ± 2,5b Fitato 0,0 ± 0,0 0,5 _{– 2,5} - 0,0 ± 0,0

Em ambos tempos de reação têm-se a presença de mioinositóis com o grupo 1,2,3-trifosfato e apesar de não haver a participação de íons ferro nos ensaios, ainda assim foi constatada atividade antioxidante, possivelmente por um mecanismo similar de sequestro de radicais livres. Estudos envolvendo a avaliação do potencial antioxidante de mioinositóis por DPPH e ORAC são raros, mas já foi constatada atividade de fitato extraídos de feijões canadenses em ORAC (OOMAH; BLANCHARD; BALASUBRAMANIAN, 2008). Ahn et al. (2003) descreveram a atividade antioxidante do fitato em DPPH após irradiação com raios gama. É possível também que mesmo após a purificação da fitase, outros compostos oriundos da fermentação possam estar presentes no extrato enzimático. Além disso algum mecanismo não esclarecido pode estar envolvido no aumento do potencial antioxidante do Ins(1,2,4,5,6)P5 em relação ao InsP6 quando avaliados pelo ensaio de DPPH.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Não foram encontrados trabalhos que reportam a produção de fitase por

R. aquatilis por processos fermentativos e subsequente purificação da enzima,

sendo assim, este trabalho foi o primeiro a descrever este processo. A maior atividade de fitase foi obtida quando o micro-organismo foi cultivado em meio LB, sendo cerca de 4,5 vezes maior que em meio M9. A otimização por planejamento experimental definiu as concentrações da formulação original como as melhores para a produção da enzima, podendo ou não ser adicionada de fitato.

A fitase purificada apresentou atividade máxima à 50°C e pH 4,0 a 5,0 e estabilidade até 40°C e em ampla faixa de pH (3,0-10,0) e, com exceção de Cu2+ _e

Zn2+_{, foi pouco afetada por íons. A enzima agiu sobre uma variedade de substratos}

fosforilados, notoriamente açúcares, e pode ser considerada uma glicose-1-fosfatase com alta atividade de fitase, capaz de desfosforilar a posição C-3 do fitato.

O preparado contendo a fitase mais fitato exibiu potencial antioxidante em DPPH e ORAC, possivelmente devido a outros compostos presentes no meio reacional. No entanto, a atividade antioxidante em ensaio DPPH foi aumentada após a hidrólise do IP6 em IP5, evidenciando o papel antioxidante dos mioinositóis.

A fitase produzida por R. aquatilis é uma enzima potencialmente viável para produção em escala industrial e possui características interessantes para

aplicação no mercado de melhoramento de rações e alimentos e na produção de mioinositóis. Contudo, para que a enzima possa ser empregada na área alimentar, investigações para ampliação da escala de fermentação e testes toxicológicos e alergênicos são recomendados como próximos passos em trabalhos futuros.

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DISCUSSÃO GERAL

O capítulo I, como revisão bibliográfica, traça um panorama geral sobre o ácido fítico, suas propriedades antinutricionais e como estudos têm mostrado o efeito benéfico deste e dos mioinositóis derivados na prevenção de doenças, particularmente as relacionadas à alimentação. Esse capítulo ainda traz ao leitor informações sobre as fitases, suas características, propriedades, produção por micro-organismos e seu relevante papel na indústria de rações e outras áreas, além das novas perspectivas de aplicação em alimentos e indústria farmacêutica para produção de mioinositóis com propriedades funcionais.

Os capítulos II e III relatam a produção de fitase por dois micro- organimos: o fungo filamentoso Paecilomyces variotii (enzima extracelular) e a bactéria Rahnella aquatilis (enzima intracelular). Na sequência foi realizada a purificação e caracterização das fitases e sua aplicação na produção de mioinositóis para avaliação do potencial antioxidante. A seguir é discutido os principais resultados, fazendo uma comparação entre as duas enzimas.

Inicialmente cinco substratos de origem agroindustrial foram utilizados para produção de fitase e fosfatases por P. variotii em FES, obtendo-se maiores produções quando cultivado em farelo de arroz e farelo de trigo. Esses mesmos substratos contém um elevado teor de fitato (entre 2,5 a 8,5% para FA 2 a 7% para FT), um indutor natural para a produção de fitase por micro-organismos. Em seguida, foi realizado um planejamento experimental para otimização da produção da enzima em farelo de trigo. Dentre as variáveis estudadas, a temperatura e a adição de Na-fitato ao substrato foram significativas, afetando negativamente a produção de fitase, enquanto que temperatura e adição de fosfato provocaram um decréscimo na produção de fosfatase. Determinadas as melhores condições para a produção das enzimas obteve-se um aumento de 2,5 vezes na produção de fosfatase em relação aos experimentos iniciais e foi mantida a produção de fitase nos mesmos níveis. Fitases são um grupo específico de fosfatases que atuam hidrolisando o fitato e liberando fosfato e mioinositóis.

A produção e fitase pela bactéria isolada a partir de cenouras e posteriormente identificada como R. aquatilis foi estuda por FS. Foram utilizados os meios LB e M9 e suas variantes. Obteve-se uma produção 4,5 vezes maior em meio LB em relação ao demais. Esse meio tem sido constantemente utilizado para

produção de fitase por bactérias, e as fontes orgânicas de nitrogênio oriundas do extrato de levedura e peptona pode ser uma vantagem quando comparada à fonte inorgânica dos meios M9. Após a realização de um planejamento experimental para otimizar a produção da enzima em meio LB chegou-se à conclusão que as concentrações originais do meio eram as mais apropriadas, podendo ou não ser adicionada pequena quantidade de fitato (0,15%).

O extrato enzimático produzido por P. variotii foi parcialmente purificado após dois passos utilizando cromatografia iônica, com um aumento de 4,15 no fator de purificação em relação ao extrato liofilizado ressuspendido e um rendimento de 5,2%. É possível que compostos presentes no farelo de trigo bem como os pigmentos produzidos pelo fungo e que foram extraídos junto com as proteínas possam ter interferido e dificultado a purificação da enzima. Já o extrato enzimático bacteriano pode ser purificado até a presença de uma única banda na SDS-PAGE após cromatografias iônica e de exclusão molecular alcançando um fator de purificação de 450 vezes e alta recuperação da atividade enzimática (55%).

Ambas enzimas apresentaram atividades máximas em condições semelhantes: 50-55°C e pH 4,0-5,0, mas a fitase fúngica foi termicamente mais estável, característica normalmente relatada e desejada para essas enzimas. É possível que a presença de outras proteínas no extrato também tenha exercido um papel de proteção contra a desnaturação térmica. Ambas enzimas foram estáveis em uma grande faixa de pH, com a enzima de P. variotii sendo mais estável em pH ácido a neutro (2,0-8,0) e a de R. aquatilis estável desde pH ácido até alcalino (3,0- 10,0), característica mais relaciona às fitases bacterianas.

De modo geral, ambas as enzimas foram pouco afetadas pela presença de íons, a exceção foi a inibição da enzima bacteriana em presença de Zn2+ _{e Cu}2+

(concentração de 1mM), reduzindo sua atividade para 17% e 25%, respectivamente. As enzimas exibiram atividade em uma grande variedade de substrato, destacando- se a AMP quando aplicada a fitase fúngica e açúcares fosfatos para a bacteriana. Quando analisada a via de degradação do fitato por HPLC, verificou-se que a fitase de R. aquatilis hidrolisou apenas o grupo fosfato na posição C-3 (3-fitase), sendo o Ins(1,2,4,5,6)P5 o único mioinositol formado. Em contrapartida, o extrato com a fitase parcialmente purificada de P. variotii foi capaz de desfosforilar o ácido fítico por uma via principal, iniciada pela posição D/L C-4 (4/6-fitase) além de outras três vias secundárias. Durante a reação foram identificadas a presença de variados

mioinositóis penta, tetra e tris-fosfato (IP5, IP4 e IP3), inclusive o Ins(1,5,6)P3, indicando a liberação do fosfato ligado axialmente ao carbono na posição C-2, algo incomum devido a configuração da ligação. Ao final de 12h de hidrólise somente foi detectado o pico referente ao Pi/IP1, não sendo possível definir o produto final da hidrólise. Uma vez que a enzima não estava completamente pura, outras fosfatases podem ter agido de forma complementar, possibilitando a hidrólise do fosfato em C- 2.

Por fim, a avaliação do potencial antioxidante em DPPH e ORAC pelos preparados contendo a fitase, o fitato e os mioinositóis produzidos via hidrólise enzimática demonstraram que ambas preparações foram efetivas; porém, no caso do hidrolisado fúngico, a atividade antioxidante parece estar mais ligada aos compostos presentes no preparado enzimático do que aos mioinositóis produzidos. Já no caso do hidrolisado bacteriano, os resultados obtidos no ensaio de DPPH apontam para uma atividade antioxidante mais significativa após conversão do fitato (IP6) em mioinositol-pentaquisfosfato (IP5), evidenciando uma maior ação antioxidante dos mioinositóis em relação ao fitato.

CONCLUSÕES GERAIS

Este trabalho relata a produção, purificação e caracterização de uma nova fitase, produzida pela bactéria R. aquatilis, isolada a partir de cenoura. O meio LB foi o mais efetivo para a produção da enzima em FS e as características bioquímicas da enzima purificada apontam que esta pode ser uma nova e viável opção para aplicação não só em rações, mas também para usos mais nobres como indústria alimentícia e para produção de mioinositóis com propriedades funcionais. O Ins(1,2,4,5,6)P5 produzido com essa enzima apresentou interessante potencial antioxidante quando avaliado por ensaio DPPH.

O uso de subprodutos agroindustriais como farelos e tortas como