Produção, purificação e caracterização de fitases microbianas e potencial de produção de mioinositóis

(1)

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

GILBERTO VICTOR CORADI

PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE FITASES

MICROBIANAS E POTENCIAL DE PRODUÇÃO DE

MIOINOSITÓIS

CAMPINAS

2017

(2)

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

GILBERTO VICTOR CORADI

PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE FITASES

MICROBIANAS E POTENCIAL DE PRODUÇÃO DE

MIOINOSITÓIS

Tese de doutorado apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da UNICAMP como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos

Orientadora: Profª. Drª. Gabriela Alves Macedo

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO GILBERTO VICTOR CORADI E ORIENTADA PELA PROFª. DRª. GABRIELA ALVES MACEDO

CAMPINAS 2017

(3)

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816

Coradi, Gilberto Victor,

C81p CorProdução, purificação e caracterização de fitases microbianas e potencial de produção de mioinositóis / Gilberto Victor Coradi. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.

CorOrientador: Gabriela Alves Macedo.

CorTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.

Cor1. Fermentação. 2. Fitases. 3. Mioinositol. 4. Paecilomyces variotii. 5. Rahnella aquatilis. I. Macedo, Gabriela Alves. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Production, purification and characterization of microbial phytases and potencial of myoinositols production

Palavras-chave em inglês: Fermentation Phytases myo-Inositol Paecilomyces variotii Rahnella aquatilis

Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Doutor em Ciência de Alimentos Banca examinadora:

Gabriela Alves Macedo Eliana Setsuko Kamimura

Maria de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli Reinaldo Gaspar Bastos

Ruann Janser Soares de Castro Data de defesa: 14-02-2017

Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos

(4)

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________ Profa. Dra. Gabriela Alves Macedo

Orientadora – DCA/FEA/UNICAMP

_______________________________________________ Profa. Dra. Eliana Setsuko Kamimura

Membro Titular – FZEA/USP

_______________________________________________ Profa. Dra. Maria de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli

Membro Titular – FFCLRP/USP

_______________________________________________ Prof. Dr. Reinaldo Gaspar Bastos

Membro Titular – UFSCar

_______________________________________________ Prof. Dr. Ruann Janser Soares de Castro

Membro Titular – DCA/FEA/UNICAMP

_______________________________________________ Dra. Jaciane Lutz Ienczak

Membro Suplente – CTBE/CNPEM

_______________________________________________ Profa. Dra. Rosana Goldbeck

Membro Suplente – DCA/FEA/UNICAMP

_______________________________________________ Profa. Dra. Valéria Marta Gomes do Nascimento

Membro Suplente – FCLA/UNESP

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

(5)

Dedico este trabalho à minha família, em especial meus pais, que tanto me apoiaram durante minha trajetória acadêmica. Dedico também à minha noiva, pelo carinho e companheirismo durante essa caminhada.

(6)

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pela conquista alcançada e por estar sempre ao meu lado, me dando forças e guiando minha vida.

Aos meus pais, Roseli e Gilberto, por me darem todo o suporte necessário durante minha vida acadêmica e possibilitarem a realização de mais este sonho. Com certeza, sem o amor, a força e o apoio que vocês me dão, isso não seria possível.

À minha irmã Maíra, pela parceria, apesar da distância.

Aos meus avós Anna, Dinéia, Geraldo e Hondes, pessoas simples e humildes, mas que me ensinaram muito, aos tios, tias, primos e primas que fazem parte da minha jornada.

À minha noiva Vanessa, pelo companheirismo dedicado em todo momento e por todo amor que temos um pelo outro. Você, com toda certeza, foi minha “musa inspiradora” e esteve sempre ao meu lado dando carinho, incentivo e apoio.

À dona Amélia, seu Américo e Dé, por me acolherem tão bem e se tornarem minha segunda família.

À professora Gabriela Macedo, pela disposição em ensinar, orientar e compartilhar seu conhecimento, tornando possível a realização deste trabalho.

Ao Dr. Ralf Greiner, pela orientação, ensino e oportunidade oferecida no Max Rubner-Institut.

Aos amigos e companheiros dos Laboratórios de Bioquímica e de Bioprocessos, Alessandra, André, Bia, Bruna, Camilo, Dani, Débora, Fabiano, Fabíola, Fernanda, Isa, Jéssika, Joelise, Karina, Léo, Lívia, Marcela, Naice, Paula, Paulinha, Ricardo, Ruann, Tauan, Val, Vivi e Zé, pelo aprendizado, bate-papos, descontração e muitos cafés.

Aos colegas do Max Rubner-Institut, Alexandra, Astrid, Petra e Reza pela contribuição dada a este trabalho.

Aos amigos Alê, Bidê, Bruno, Bola, Chuck, Gui, Krébis, Marquinhos, Miúxa, e todos os colegas feitos na FEA e na UNICAMP.

Aos amigos Carlos, Davi e Johann, pelo pedaço do Brasil na Alemanha. Ao Balda, Danilo, Matheus, Maria, Tatu e Veraldo pela parceria e convivência na Rep.

(7)

Aos professores e funcionários da FEA, sem os quais não seria possível este trabalho, pela dedicação em ensinar e formar profissionais.

À Capes e CNPq pelas bolsas e auxílio financeiro que possibilitaram a realização deste trabalho.

Aos membros da Banca Examinadora, Dra. Eliana Setsuko Kamimura, Dra. Jaciane Lutz Ienczak, Dra. Maria de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli, Dr. Reinaldo Gaspar Bastos, Dra. Rosana Goldbeck, Dr. Ruann Janser Soares de Castro e Dra. Valéria Marta Gomes do Nascimento pelo conhecimento e contribuição dados ao trabalho.

À todos que de alguma forma, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.

(8)

Bem-aventurado o homem que acha sabedoria, e o homem que adquire conhecimento; porque é melhor a sua mercadoria do que artigos de prata, e maior o seu lucro que o ouro mais fino.

(9)

RESUMO GERAL

Fitases são enzimas responsáveis pela hidrólise do ácido fítico, liberando inositóis e fosfato e são amplamente encontradas na natureza, mais notoriamente produzidas por vegetais e micro-organismos. Fitases microbianas são empregadas comercialmente e podem ser produzidas por diferentes tipos de fermentação. Neste trabalho descrevemos a produção de fitase por dois micro-organismos: pelo fungo filamentoso Paecilomyces variotii em fermentação estado sólido (FES) e pela bactéria Rahnella aquatilis por fermentação submersa (FS). Avaliou-se a produção de fitase por P. variotii em farelos de arroz (FA), soja (FaS) e trigo (FT) e em tortas de tungue (TT) e de algodão (TA). A maior produção tanto de fitase como fosfatases foi obtida quando utilizado FT, com produções máximas de 18,3 mU/gss e 1390 mU/gss respectivamente. A produção de fosfatases foi aumentada em cerca de 2,5 vezes após estudos utilizando planejamento exerimental, enquanto que a produção de fitase manteve-se igual. No caso da bactéria R. aquatilis, foi obtida maior produção de fitase (53,7 mU/mL) quando utilizado meio complexo Luria-Bertani (LB) do que em meio mineral M9 contendo diferentes fontes de carbono. As enzimas microbianas produzidas foram purificadas por cromatografias iônicas e de exclusão molecular. Para a enzima fúngica foi obtido um fator de purificação três vezes maior do que o extrato enzimático bruto. Esta enzima apresentou atividade máxima em 55°C e pH 3,0-5,0 além de estabilidade em pH 2,0 a 8,0 e termorresistência até 60°C. Para a fitase bacteriana foi obtido um fator de purificação de 450 vezes em relação ao inicial. Esta enzima foi mais ativa em 50°C e pH 4,0-5,0 e foi estável em pH 5,5-10,0. Ambas enzimas foram pouco afetadas por íons e agiram sobre uma variedade de substratos, com destaque para a adenosina monofosfato para a fitase fúngica e açúcares fosfatados para a fitase bacteriana. A análise dos produtos de degradação do fitato apontam para uma 3-fitase no caso da fitase de R. aquatilis, sendo o Ins(1,2,4,5,6)P5 o único mioinositol formado. A enzima parcialmente purificada de P. variotii revelou-e como uma D/L 4/6-fitase. Além disso, foi constatada a produção de uma gama de mioinositóis (IP5, IP4, IP3, IP1), sugerindo até mesmo a ação sobre o fósforo ligado à posição C-2 do fitato. Os preparados contendo as enzimas e os produtos formados pela hidrólise do fitato apresentaram

(10)

atividade antioxidante significativa quando avaliados pelos ensaios DPPH e ORAC se comparados ao controle contendo apenas fitato de sódio.

Palavras-chave: Fermentação, Fitase, Fitato, Mioinositol, Paecilomyces variotii,

(11)

ABSTRACT

Phytases are enzymes responsible for the hydrolysis of phytic acid, releasing phosphate and myoinositols. They are widely found in nature, most notably produced by plants or microorganisms. Microbial phytases are used commercially and can be produced by different types of fermentation. This paper describes the production of phytase by two microorganisms: the filamentous fungus Paecilomyces variotii in solid state fermentation and the bacteria Rahnella aquatilis by submerged fermentation. P.

variotii phytase production in rice and wheat bran and tung and cotton meal was

evaluated. The highest production of both phytase and phosphatases was obtained when wheat bran was used, with maximum yields of 18.3 mU/gds and 1390 mU/gds respectively. Phosphatase production was increased about 2.5-fold after studies using experimental design, while phytase production remained the same. In the case of bacteria R. aquatilis, higher phytase production (53.7 mU/mL) was obtained when Luria-Bertani (LB) complex médium was used than in M9 mineral medium containing different carbon sources. Microbial enzymes produced were purified by ion and molecular exclusion chromatography. For the fungal enzyme, a purification factor three times greater than the crude enzyme extract was obtained. This enzyme showed maximum activity at 55°C and pH 3.0-5.0 and stability at pH 2.0 to 8.0 and thermoresistance up to 60°C. For bacterial phytase, a purification factor of 450 times was obtained in relation. This enzyme was more active at 50°C and pH 4.0-5.0 and was stable at pH 5.5-10.0. Both enzymes were slightly affected by ions and acted on a variety of substrates, especially adenosine monophosphate and phosphate sugars respectively. Analysis of the phytate degradation products point to a 3-phytase produced by R. aquatilis, with Ins(1,2,4,5,6)P5 being the only myoinositol formed. Partially purified enzyme of P. variotii was revealed as a D/L 4/6-phytase. Production of a range of myoinositols (IP5, IP4, IP3, IP1) was observed, suggesting even the action on the phosphate bound to C-2 position. Preparations containing the enzymes and the phytate hydrolysis products presented significant antioxidant activity when evaluated by the DPPH and ORAC assays, compared to the control (sodium phytate).

Key-words: Fermentation, Phytase, Phytate, Myoinositol, Paecilomyces variotii,

(12)

LISTA DE ABREVIATURAS/FÓRMULAS

β-NADP-Na – β-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato de sódio µL - Microlitros

µmol - Micromol

AAPH – 2,2'-Azobis(2-amidinopropano) dihidroclorídeo AMP – Adenosina monofosfato

At. Especif. – Atividade específica At. Enz. – Atividade enzimática ATP – Adenosina trifosfato BDA – Batata dextrose ágar BPP – Hélice-β fosfatases Ca2+_{– Íon cálcio}

CaCl2– Cloreto de cálcio

CoSO4– Sulfato de cobalto

CP _{– Cisteína fosfatases} Cu2+_{– Íon cobre}

CuSO4– Sulfato de cobre

DCCR _{– Delineamento composto central rotacional} D/L – Dextrógiro / Levógiro

DO600nm– Densidade óptica à 600nanômetros.

DPPH – 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético EEB – Extrato enzimático bruto

Ext. Lev. – Extrato de levedura FA – Farelo de arroz

FaS – Farelo de soja Fe2+_{– Íon ferro}

FEA – Faculdade de Engenharia de Alimentos FeCl3– Cloreto de ferro

FES – Fermentação em estado sólido Fit. – Fitato

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FP _{– Fator de purificação}

FPLC – Fast protein liquid cromatography FS – Fermentação submersa

FT – Farelo de trigo g – Gramas

h – Horas

H2SO4– Ácido sulfúrico

HAP – Histidina ácido-fosfatases HCl – Ácido clorídrico

HPLC – High performance liquid chromatography Ins(x)P ou IPx – Mioinositol

K2HPO4– Fosfato de potássio dibásico

kg – Quilogramas L – Litros

LB – Luria-Bertani

LDL – Low density lipoprotein mg - Miligramas

MgSO4– Sulfato de magnésio

min – Minutos mL - Mililitros

MnSO4– Sulfato de manganês

MRI – Max Rubner-Institut

mU/mL _{– Miliunidades por mililitro}

mU/gss – Miliunidades por grama de substrato seco Na2HPO4– Fosfato de sódio dibásico

NaF – Fluoreto de sódio Na-fitato – Fitato de sódio NaOH – Hidróxido de sódio (NH4)2SO4– Sulfato de amônio

NiCl2– Cloreto de níquel

nmol - Nanomol

ORAC - Oxygen radical absorbance capacity PAP – Fosfatases ácidas púrpuras

(14)

PCR _{– Polymerase chain reaction}

pNP – p-Nitrofenil

pNPP – p-Nitrofenil fosfato

PO4+3 - Fosfato

Prot. – Proteínas

Rpm – Rotações por minuto SDS – Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida STI – Caldo nutriente Standard I

TA – Torta de algodão Temp. – Temperatura TT – Torta de tungue

U/gss – Unidade por grama substrato seco U/mg – Unidade por miligrama

U/mL – Unidades por mililitro

UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas xg _{– Força G}

Zn2+_{– Íon zinco}

(15)

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL ... 21

OBJETIVOS ... 23

CAPÍTULO I - FITASES: PRODUÇÃO POR MICRO-ORGANISMOS, CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS E O PAPEL DO FITATO E MIOINOSITÓIS NA SAÚDE ... 24

RESUMO... 25

INTRODUÇÃO ... 26

1. Ácido fítico (mioinositol-hexaquisfosfato) ... 26

1.1. Fitato como fator antinutricional ... 28

2. Enzimas degradadoras do fitato (fitases) ... 30

2.1. Fontes de fitase ... 32

2.2. Diferentes grupos de fitases ... 34

2.2.1. Histidina ácido-fosfatases (HAP) ... 34

2.2.2. Hélice-β fosfatases (BPP) ... 35

2.2.3. Fosfatases ácidas púrpuras (PAP) ... 36

2.2.4. Cisteína fosfatases (CP) ... 37

2.3. Produção de fitases por processos fermentativos ... 38

2.4. Purificação de fitases ... 43

2.5. Propriedades bioquímicas das fitases ... 44

3. Aplicações e interesse comercial das fitases ... 47

3.1. Alimentação animal ... 47

3.2. Alimentação e saúde humana ... 49

3.3. Outras aplicações... 51

4. Potencial papel do fitato e mioinositóis na saúde humana ... 51

4.1. Efeito antioxidante ... 51

4.2. Prevenção contra doenças ... 53

(16)

5. Micro-organismos Paecilomyces variotii e Rahnella aquatilis como produtores de enzimas ... 58 5.1. Paecilomyces variotii ... 58 5.2. Rahnella aquatilis ... 60 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 61 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 62

CAPÍTULO II - PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DA FITASE PRODUZIDA POR Paecilomyces variotii EM FARELO DE TRIGO ... 89

RESUMO... 90

INTRODUÇÃO ... 91

MATERIAIS E MÉTODOS ... 92

1. Cultivo e manutenção da cepa fúngica ... 92

2. Screening de suportes sólidos para cultivo microbiano... 92

3. Otimização da produção da enzima em frascos utilizando planejamento experimental ... 93

4. Composição centesimal do substrato... 93

5. Extração das proteínas e obtenção do extrato enzimático bruto (EEB) ... 93

6. Preparação do extrato enzimático bruto para estudos de purificação ... 93

6.1. Precipitação com sulfato de amônio e liofilização ... 93

6.2. Purificação do extrato enzimático ... 94

6.3. Cromatografia de troca catiônica ... 94

6.4. Cromatografia de troca aniônica ... 94

7. Caracterização da enzima purificada ... 95

7.1. Cinética da reação enzimática ... 95

7.2. Efeito da temperatura na atividade e estabilidade da enzima ... 95

7.3. Efeito do pH na atividade e estabilidade da enzima ... 96

7.4. Efeito de íons na atividade da fitase... 96

(17)

7.6. Estudo de especificidade da enzima frente à diferentes substratos ... 96

7.7. Reação para formação de mioinositóis via hidrólise enzimática do fitato .... 97

8. Métodos analíticos ... 97

8.1. Determinação de proteínas totais ... 97

8.2. Determinação da atividade enzimática em substrato p-nitrofenilfosfato dissódico (pNPP) ... 97

8.3. Determinação da atividade enzimática em substrato fitato de sódio ... 98

8.4. SDS-PAGE ... 98

8.5. Análise por HPLC dos isômeros de mioinositol ... 99

9. Avaliação da atividade antioxidante dos mioinositóis por sequestro de radicais livres in vitro ... 99

9.1. Ensaio de capacidade de absorbância do radical oxigênio (ORAC) ... 99

9.2. Ensaio de sequestro de radicais DPPH (2,2, difenil, 1 picrilhidrazila) ... 100

RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 100

1. Produção enzimática em FES ... 100

1.1. Produção enzimática em diferentes substratos ... 100

1.2. Otimização da produção enzimática ... 102

2. Purificação do extrato enzimático ... 108

2.1. Precipitação com sulfato de amônio e liofilização ... 108

3. SDS-PAGE ... 113

4. Caracterização bioquímica da enzima ... 114

4.4. Efeito de íons na atividade da enzima... 118

(18)

4.7. Análise dos mioinositóis produzidos a partir da hidrólise do fitato ... 121

5. Avaliação da atividade antioxidante dos mioinositóis produzidos ... 123

CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 125

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 126

CAPÍTULO III - PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS PROPRIEDADES BIOQUÍMICAS DA FITASE PRODUZIDA POR Rahnella aquatilis ... 133

RESUMO... 134

INTRODUÇÃO ... 135

MATERIAIS E MÉTODOS ... 135

1. Isolamento, identificação e manutenção da cepa ... 136

2. Fermentação para produção da enzima e otimização das condições de cultivo ... 136

3. Extração da enzima e obtenção do extrato enzimático bruto ... 137

4. Purificação do extrato enzimático bruto ... 137

4.2. Filtração em gel ... 138

5. Caracterização da enzima purificada ... 138

5.4. Efeito de íons na atividade da fitase... 139

5.5. Parâmetros cinéticos ... 139

5.7. Reação para formação de produtos via hidrólise enzimática do fitato ... 140

6. Métodos analíticos ... 140

(19)

6.2. Determinação da atividade enzimática em substrato fitato de sódio ... 141

6.3. Determinação da atividade enzimática em substrato p-nitrofenilfosfato dissódico (pNPP) ... 141

6.4. SDS-PAGE ... 142

6.5. Análise por HPLC dos isômeros de mioinositol ... 142

7. Avaliação da atividade antioxidante dos mioinositóis por sequestro de radicais livres in vitro ... 142

7.1. Ensaio de capacidade de absorbância do radical oxigênio (ORAC) ... 143

7.2. Ensaio de sequestro de radicais DPPH (2,2, difenil, 1 picrilhidrazila) ... 143

RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 144

1. Identificação da cepa ... 144

2. Produção da fitase por R. aquatilis ... 145

2.1. Otimização da produção de fitase utilizando planejamento experimental . 147 3. Purificação do extrato enzimático ... 150

3.1. Purificação por cromatografia de troca catiônica ... 150

3.2. Purificação por filtração em gel ... 151

3.3. Purificação por cromatografia de troca aniônica ... 152

4. SDS-PAGE ... 154

5. Caracterização bioquímica da enzima ... 155

5.4. Efeito de íons na atividade da enzima... 159

5.5. Parâmetros cinéticos ... 160

5.7. Análise dos isômeros de mioinositóis produzidos a partir da hidrólise do fitato ... 162

(20)

CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 166 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 167 DISCUSSÃO GERAL ... 174 CONCLUSÕES GERAIS ... 177 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 178 APÊNDICE I ... 209 ANEXO I... 211

(21)

INTRODUÇÃO GERAL

O fósforo é elemento essencial para a vida, sendo o terceiro mineral mais abundante nos seres vivos. É amplamente encontrado no ambiente e no solo, podendo estar na forma inorgânica ou orgânica. O ácido fítico (fitato) produzido por vegetais é o principal reservatório de fósforo orgânico na natureza, em especial os cereais e leguminosas, pois utilizam o fitato presente nos grãos como fonte de fósforo durante a germinação e estágio inicial do desenvolvimento (JOSHI; SATYANARAYANA, 2015). Apesar disso, este fósforo encontra-se indisponível, pois está complexado ao anel de inositol. A carga negativa dos grupos fosfatos confere ainda um fator antinutricional ao fitato pela capacidade em quelar íons divalentes como cálcio, ferro e zinco (KUMAR et al., 2016).

Mioinositol-hexafosfato fosfohidrolases ou simplesmente fitases são enzimas capazes de hidrolisar o ácido fítico, liberando inositóis e fosfato, além de outros minerais que possam estar complexados ao mesmo (WU et al., 2015). Essas enzimas são encontradas principalmente em vegetais e micro-organismos, sendo estas as escolhidas para uso comercial (GUPTA; GANGOLIYA; SINGH, 2015). Fitases podem ser classificadas de acordo com o grupo fosfato em que iniciam a desfosforilação do fitato, sendo a 3-fitase e a 6-fitase as mais comuns. Outra classificação baseia-se na estrutura bioquímica da enzima e as divide em quatro classes distintas (MUKHAMETZYANOVA; AKHMETOVA; SHARIPOVA, 2012).

Fitases microbianas são produzidas por fermentação submersa (FS) ou fermentação em estado sólido (FES)1_{, sendo que cada técnica possui suas}

vantagens e desvantagens. A FS se caracteriza por um ambiente líquido, com os nutrientes dissolvidos nele e é o mais utilizado para cultivo microbiano; por outro lado, a FES se caracteriza pelo crescimento microbiano em um suporte sólido, no qual a água encontra-se totalmente adsorvida, e é mais indicada para fungos filamentosos por se assemelhar às condições em quem esse organismo se desenvolve na natureza (SINGHANIA et al., 2010). Fungos e bactérias produzem enzimas com propriedades distintas. A fitase fúngica é extracelular, geralmente atua em pH ácido e possuem maior massa molecular, enquanto que a bacteriana é intracelular e geralmente atua em pH próximo ao neutro e possui massa molar

1_{O termo fermentação possui diversas definições e, no caso deste trabalho, foi empregado com o}

(22)

menor. De modo geral, fitases microbianas são termoestáveis (KUMAR et al., 2016; SINGH; SATYANARAYANA, 2015). Neste trabalho foram estudadas uma fitase fúngica e uma bacteriana e, posteriormente, comparadas suas propriedades bioquímicas.

Fitases são amplamente adicionadas em rações para aumentar a biodisponibilidade de fósforo para animais monogástricos como aves, suínos e peixes, com ganhos para a criação, evitando a adição de fósforo mineral e reduzindo a poluição pelo excesso de fosfato não-absorvível excretado nas fezes. Estudos recentes têm avaliado seu emprego na desfitinização (hidrólise do fitato, disponibilizando fósforo e íons minerais) de farinhas, derivados de cereais, panificação e produção de mioinositóis (SINGH; SATYANARAYANA, 2015). Os diferentes mioinositóis oriundos da degradação do ácido fítico apresentam papel importante como antioxidantes e na prevenção de doenças como diabetes mellitus, doenças coronarianas e cânceres (CORRADO, et al., 2011; SCHLEMMER et al., 2009).

Dado o interesse comercial nas fitases e o promissor potencial dos mioinositóis na saúde, faz-se necessária a busca por micro-organismos produtores dessa enzima com características que favoreçam seu uso industrial, bem como estudos que que avaliem a produção de mioinositóis por via enzimática e os efeitos benéficos destes.

Este trabalho divide-se em três capítulos e foi desenvolvido parte no Laboratório de Bioprocessos da Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA) da Universidade Estaddual de Campinas (UNICAMP) e parte no Max Rubner-Institut em Karlsruhe, Alemanha sob supervião do Dr. Ralf Greiner (doutorado Sanduíche). No Capítulo I é apresentada uma revisão bibliográfica abordando aspectos sobre a produção, classificação e propriedades das fitases e a importância e papel do fitato e mioinositóis na saúde dos animais de criação e humanos. Nos Capítulos II e III são estudadas a produção, purificação e caraterização das fitases produzida pelo fungo

Paecilomyces variotii e pela bactéria Rahnella aquatilis, bem como a capacidade de

hidrólise do fitato e produção de mioinositóis. Estes micro-organismos foram escolhidos após testes preliminares e embasamento em artigos da literatura que descrevem ou apontam a produção de fitases pelos mesmos. Foram testadas ainda as atividades antioxidantes dos mioinositóis produzidos por meio dos ensaios de DPPH e ORAC. No item Discussão Geral são apresentadas as discussões dos

(23)

principais resultados obtidos nos capítulos anteriores, comparando-se as propriedades das duas fitases produzidas. Finalmente no item Conclusões Gerais são destacados os resultados e observações mais significativas obtidas no trabalho e são feitas sugestões de perpectivas para trabalhos futuros.

OBJETIVOS

Este trabalho teve por objetivos gerais:

 Estudar a produção de fitases por Paecilomyces variotii em FES e

Rahnella aquatilis em FS;

 Purificar e caracterizar as enzimas produzidas;

 Avaliar o potencial antioxidante do fitato e mioinositóis produzidos pela hidrólise enzimática.

Para que os objetivos gerais fossem alcançados, foram desenvolvidos os seguintes objetivos específicos:

 Otimização da produção de fitase/fosfatase por P. variotii em FES utilizando subprodutos agroindustriais;

 Otimização da produção de fitase em FS por R. aquatilis em meios sintéticos

 Purificação das fitases produzidas empregando diferentes técnicas cromatográficas;

 Caracterização das enzimas quanto à atividade e estabilidade em diferentes temperaturas e pH e inibição por íons;

 Avaliação da atividade frente à diferentes substratos e da hidrólise do fitato com identificação dos mioinositóis formados;

 Avaliação da capacidade antioxidante do fitato e mioinosióis produzidos em ensaios DPPH e ORAC.

(24)

CAPÍTULO I

FITASES: PRODUÇÃO POR MICRO-ORGANISMOS,

CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS E O PAPEL DO

FITATO E MIOINOSITÓIS NA SAÚDE

Autores: CORADI, G. V.; GREINER, R.; MACEDO, G. A.

(25)

RESUMO

O ácido fítico é a principal reserva de fósforo em vegetais e é considerado um fator antinutricional para animais monogástricos e humanos por não ser digerido e por sua habilidade em quelar minerais, proteínas, entre outros. Fitases são enzimas que hidrolisam o ácido fítico ou fitato, liberando inositol e fosfato inorgânico. Essas enzimas são produzidas principalmente por vegetais e micro-organismos e são classificadas de acordo com o grupo fosfato que atacam inicialmente e sua estrutura bioquímica. Micro-organismos são estudados para a produção de fitase por fermentação submersa e em estado sólido, alcançando resultados satisfatórios em ambos os casos. Fitases são amplamente empregadas como suplemento em rações animais, porém a descoberta de propriedades funcionais para o fitato e mioinositóis abre um novo campo de aplicação para essas enzimas. O fitato e produtos da desfosforilação têm sido apontados como importantes fatores na prevenção de doenças como diabetes mellitus, doenças cardiovasculares, cálculos renais e diversos tipos de cânceres.

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INTRODUÇÃO

As fitases ou mioinositol-hexafosfato fosfohidrolases são enzimas que catalisam a hidrólise do ácido fítico liberando inositol e fosfato inorgânico. Eventualmente outros íons minerais como cálcio, ferro e zinco podem estar ligados ao fitato e serem disponibilizados após a hidrólise (PANDEY et al., 2001). Essas enzimas são importantes na digestão do fitato, considerado como fator antinutricional devido às suas propriedades quelantes e na ciclagem do fósforo orgânico encontrado principalmente nos solos.

As fitases são classificadas segundo a posição do fosfato que primeiro é atacado durante a hidrólise do fitato, sendo a 3 e a 6-fitases as mais comuns. Elas podem ainda ser classificadas em quatro grupos de acordo com sua estrutura bioquímica e sequência de aminoácidos no sítio ativo (MUKHAMETZYANOVA; AKHMETOVA; SHARIPOVA, 2012).

Em termos financeiros, as fitases representam mais de 60% do mercado total de enzimas empregadas em rações animais, estimado em U$ 350 milhões/ano. Cerca de 70% das rações para suínos e aves possuem adição de fitase em sua formulação (KUMAR et al., 2016). Novos usos para essa enzima na indústria alimentícia têm sido propostos, entre eles, adição em pães, derivados de cereais e probióticos, valorizando-as ainda mais.

Atualmente a população de países ocidentais desenvolvidos possui uma dieta baseada em alimentos industrializados e por consequência uma redução na ingestão de fitatos em relação à países em desenvolvimento. Esses hábitos alimentares, entre outros fatores, podem estar relacionados à uma maior incidência de doenças cardiovasculares, diabetes e câncer (GREINER; KONIETZNY, 2007). Diante desse aspecto, a combinação do uso de fitato e fitases pode fornecer propriedades funcionais e desejáveis nos alimentos.

Esta revisão objetiva tecer um panorama sobre a produção, caracterização e aplicação das fitases e introduzir as propriedades benéficas dos fitatos e mioinositóis baseados nos estudos in vitro e in vivo publicados principalmente a partir dos anos 2000.

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O fósforo é um nutriente essencial para a vida e o terceiro mineral mais abundante nos organismos vivos. É um elemento versátil, encontrado em toda as células e que participa de todas as vias metabólicas. Entre as funções do fósforo, incluem-se a participação na constituição dos fosfolipídeos da membrana celular e dos ácidos nucléicos, na estrutura óssea e como fonte de energia na forma de ATP. A vida como conhecemos é impossível sem a presença do fósforo (JOSHI; SATYANARAYANA, 2015). O fósforo é amplamente encontrado no ambiente e no solo, podendo estar na forma mineral (rochas) ou na forma orgânica (principalmente como ácido fítico).

O ácido fítico (mioinositol hexaquisfosfato, IP6) é um composto abundante

no ambiente e um constituinte comum em alimentos de origem vegetal, representando cerca de 1-5% do peso de sementes, cereais, castanhas e leguminosas. Nos vegetais, o ácido fítico é uma reserva natural de diversos minerais, especialmente fósforo, compreendendo entre 60-90% do conteúdo total deste mineral (JAIN; SAPNA; SINGH, 2016; MUKHAMETZYANOVA; AKHMETOVA; SHARIPOVA, 2012). O fitato (sal do ácido fítico) acumula rapidamente em sementes durante o período de maturação e é estocado na forma de cristais globóides dentro de corpos proteicos. Em grãos de cereais (arroz, trigo) é encontrado no farelo da camada de aleurona e no pericarpo (casca), enquanto que no milho é encontrado no endosperma (GUPTA; GANGOLIYA; SINGH, 2015). Segundo estimativas de 2002, anualmente são produzidos cerca de 33 milhões de toneladas de fitato, que são responsáveis pelo sequestro de mais de 12 milhões de toneladas de fósforo, levando em consideração apenas os vegetais cultivados na agricultura (LOTT et al., 2002).

Figura 1. Estrutura química do ácido fítico (fitato). A configuração D é atribuída quando a numeração

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A estrutura química do ácido fítico é formada pelo anel de inositol (poliálcool cíclico derivado da glicose) com seis ligações éster de grupos fosfatos (Figura 1). Essa ligação é muito estável e a degradação por fatores abióticos é quase impossível, entretanto enzimas como as fitases são capazes de realizar esta hidrólise (WU et al., 2015).

1.1. Fitato como fator antinutricional

A presença de fitatos exerce influência sobre aspectos nutricionais e o ambiente. Minerais e fósforo complexados ao fitato são em grande parte indisponíveis para animais monogástricos (suínos, aves, peixes), incluindo o homem, devido à falta de fitases endógenas capazes de liberar esses nutrientes por meio da hidrólise do fitato (BHAVSAR; KHIRE, 2014; RODEHUTSCORD, 2001). Fitases liberadas pela microbiota gastrointestinal de animais ruminantes são efetivas em disponibilizar os minerais, gerando vantagem tanto para os micro-organismos quanto para o animal (LEI et al., 2007).

O fitato é uma molécula que em ampla faixa de pH apresenta-se de forma polianiônica, isto, é com seis grupos fostatos com carga negativa, e devido à essa propriedade possui extrema afinidade em quelar componentes de carga positiva como nutrientes minerais divalentes (Ca2+_{, Mg}2+_{, Zn}2+_{, Fe}2+_{e Cu}2+_{), elementos traço,}

proteínas e carboidratos (Figura 2) (BHAVSAR; KHIRE, 2014; JOSHI; SATYANARAYANA, 2015; KUMAR et al., 2016). Os cátions se ligam ao PO4-_pela

interação entre as cargas, já os possíveis mecanismos de ligação com as proteínas podem dar-_{se por ligação direta com grupos terminais α-NH}2protonados e grupos

ε-NH2 de resíduos de lisina ou interação mediada por cátions multivalentes

(CHERYAN, 1980).

Apesar da presença de nutrientes no alimento, a biodisponibilidade do fósforo e dos cátions minerais é reduzida, pois o fitato age como um fixador destes. Esta interação não só implica em consequências nutricionais, mas também afeta a qualidade de ingredientes alimentícios como amido, milhocina ou isolados proteicos vegetais (GREINER; KONIETZNY, 2006). A formação dos complexos proteicos afeta também a digestão, inibindo enzimas digestivas como α-amilase, tripsina, fosfatases ácidas e tirosinase (HARLAND; MORRIS, 1995). Animais expostos à uma dieta rica em fitato apresentam sinais de subnutrição, perda de peso e distúrbios no sistema reprodutor.

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Figura 2. Fitato complexado com íons metais, proteínas e carboidratos (adaptado de JOSHI;

SATYANARAYANA, 2015).

Outro problema é que o excesso de fósforo ligado ao fitato e que não é absorvido na digestão é excretado para o ambiente, infiltra no solo, sendo transportado para lençóis d’água, ou é arrastado pela água da chuva para lagos, rios e mares, aumenta a concentração de fósforo na água e consequentemente causa a eutrofização, tornando-se um importante poluente originado a partir dos dejetos da criação animal intensiva (MALLIN, 2000).

Uma forma de contornar os efeitos antinutricionais do fitato, bem como a poluição oriunda da criação de animais, é pela adição de fósforo mineral na ração oferecida, porém esta etapa representa um alto custo. Além disso, a solubilidade e estabilidade dos complexos minerais com o fitato diminui conforme o número de grupos fosfatos do anel de inositol diminui, portanto, a remoção dos resíduos fosfatados reduz a deficiência de absorção intestinal de minerais essenciais à dieta (HAN, et al., 1994; SANDBERG et al., 1999). Logo, a adição de fitases em rações torna-se interessante por disponibilizar tanto o fósforo como outros minerais que estejam complexados ao inositol (BARUAH et al., 2007; VATS; BANERJEE, 2004).

A nutrição humana também sofre influência do fitato e sua ingestão diária varia de acordo com a dieta base. Os alimentos mais ricos em fitato são os cereais, grãos e castanhas. Um americano adulto consome em média 750mg fitato/dia, sendo os cereais a maior fonte de fitato na dieta. Suecos consomem dietas com baixo teor de fitato (180mg/dia); por outro lado indianos e nigerianos ingerem elevadas quantidades de fitato (2030mg e 2100mg por dia, respectivamente) por

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terem uma dieta baseada em cereais e feijões. A ingestão diária de fitato no Reino Unido é estimada em 600-800mg. Cerca de 70% deste fitato é derivado de produtos cereais, 20% de frutas e o restante de vegetais e castanhas. Em geral, vegetarianos consomem maior quantidade de fitato que os não-vegetarianos (REDDY, 2002; SCHLEMMER et al., 2009).

Não há um valor recomendado para a ingestão diária de fitato. Em países industrializados, mesmo a ingestão de elevados teores de fitato parece não afetar a absorção de minerais ao ponto de acarretar problemas nutricionais, enquanto que em países em desenvolvimento, o alto consumo de fitatos aliado à uma dieta pobre em nutrientes pode causar deficiência nutricional, principalmente de ferro e zinco (SCHLEMMER et al., 2009). Ratos alimentados com uma dieta balanceada de vitaminas e minerais e alta ingestão de fitato não apresentaram deficiências de minerais mesmo após 12 semanas de dieta (GRASES et al., 2001). Por outro lado, Domene et al. (2014) encontraram que a ingestão dos minerais cálcio, zinco e ferro em uma determinada população estudada (cidade de Campinas, Brasil) é insuficiente para suprir as recomendações diárias devido à complexação dos minerais pelo fitato. Essa taxa foi calculada com base na razão molar entre esses elementos. O desafio a ser enfrentado é aliar o consumo de alimentos ricos em fitato à uma dieta rica em nutrientes, para que possa se obter o máximo de benefícios à saúde propiciados tanto pelos minerais quanto pelo fitato.

2. Enzimas degradadoras do fitato (fitases)

As fitases ou mioinositol-hexafosfato fosfohidrolases são enzimas que catalisam a hidrólise do ácido fítico (mioinositol-1,2,3,4,5,6-hexaquisfosfato) liberando inositol livre e fosfato inorgânico (ácido fosfórico, H3PO4) (Figura 3). Essa

enzima foi descoberta por Suzuki, Yoshimura e Takaishi (1907), passando a ser estudada mais profundamente a partir de 1960. Eventualmente, outros íons minerais como cálcio, ferro e zinco podem estar ligados ao fitato e serem disponibilizados após a hidrólise. Muitas vezes não é possível a hidrólise completa do ácido fítico em inositol, gerando assim ésteres intermediários (mono-, bi-, tri-, tetraquis- e pentaquisfosfato) chamados de mioinositóis (IP5-IP1), dependendo do grau de

desfosforilação. O caminho da reação para a degradação completa do ácido fítico é: IP6 → IP5 → IP4 → IP3 → IP2 → IP1 → inositol (DASGUPTA et al., 1996).

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Teoricamente, a hidrólise do fitato até inositol é possível, porém na prática isto não ocorre. Até o momento não foi relatada nenhuma fitase capaz de remover todos os seis grupos fosfatos, em especial o fosfato na posição C-2 (GREINER; DA SILVA; COURI, 2009; MUKHAMETZYANOVA; AKHMETOVA; SHARIPOVA, 2012; SAJIDAN et al., 2004). Este fenômeno pode ser explicado pelo fato de que os fosfatos estão ligados ao inositol na posição equatorial, com exceção do 2-fosfato, que está ligado na posição axial (COSTELLO; GLONEK; MYERS, 1976; JOHNSON; TATE, 1969;) tornando-o resistente à hidrólise enzimática (GREINER; DA SILVA; COURI, 2009; WYSS, et al., 1999).

Figura 3. Hidrólise do fitato por 3 e 6 fitases (adaptado de DVORÁKOVÁ, 1998).

A União Internacional de Química Pura e Aplicada e a União Internacional de Bioquímica (IUPAC-IUB) classificam as fitases em dois grupos distintos, de acordo com o primeiro grupo fosfato atacado pela enzima: 3-fitase (EC 3.1.3.8), que inicia removendo um grupo ortofosfato na posição C-3 e a 6-fitase (EC 3.1.3.26), que inicia a remoção pela posição C-6 da molécula de mioinositol hexafosfato (Figura 3), sendo que a 3-fitase é principalmente de origem microbiana e 6-fitase é derivada de plantas. (KONIETZNY; GREINER, 2002; PANDEY et al., 2001; SELLE; RAVINDRAN, 2007). Recentemente, fitases menos usuais como 4- e 5-fitases (pólen de lírio, Lilium sp.) têm sido descritas (SINGH; SATYANARAYANA, 2015).

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2.1. Fontes de fitase

As fitases estão amplamente distribuídas na natureza e foram reportadas em plantas, micro-organismos e alguns tecidos animais (JOSHI; SATYANARAYANA, 2015; KONIETZNY; GREINER, 2002), sendo que as microbianas são as mais estudadas e importantes do ponto de vista econômico. Apenas as fitases fúngicas e as bacterianas produzidas pelos gêneros Enterobacter, Pseudomonas, Bacillus e

Streptomyces são extracelulares; a fitase produzida por E. coli é periplasmática,

enquanto que todas as demais são intracelulares (GHORBANI-NASRABADI et al., 2012; JAIN; SAPNA; SINGH, 2016; KONIETZNY; GREINER, 2002; YOON et al., 1996).

A primeira fitase animal descrita foi encontrada no fígado e sangue (eritrócitos) de bezerros, contudo, pesquisas mais recentes encontraram fitase somente no sangue de vertebrados como pássaros, répteis, peixes e batráquios, em mamíferos foi encontrada em células do intestino delgado (DVORÁKOVÁ, 1998; KONIETZNY; GREINER, 2002). Apesar disso, a fitase intestinal não desempenha papel significativo na digestão do fitato em animais (DVORÁKOVÁ, 1998; WILLIAMS; TAYLOR, 1985). O fitato pode ser hidrolisado e digerido por animais ruminantes, mas essa capacidade se deve às fitases produzidas pelas bactérias anaeróbias do rúmen (JOSHI; SATYANARAYANA, 2015; LEI et al., 2007).

Fitases são encontradas em muitos vegetais, com destaque para gramíneas, pólens, batata, legumes, sementes, cereais (trigo, aveia, cevada, arroz, milho, feijão, soja) e são responsáveis principalmente por disponibilizar o fósforo e outros minerais estocados na forma de fitato durante a germinação (HARLAND; MORRIS, 1995; LOTT et al., 2002). Processos baseados na germinação, fermentação e embebimento em grãos podem ser empregados visando o uso das fitases intrínsecas presentes em alimentos vegetais (FREDLUND et al., 2003). Nos últimos anos, vegetais como o tabaco, entre outros, têm sido utilizados para expressar fitases produzidas por outras espécies por meio de transgenia (HAEFNER et al., 2005; JOSHI; SATYANARAYANA, 2015).

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Figura 4. Mobilização do fósforo por micro-organismos. A fitase secretada na rizosfera hidrolisa o

fitato, disponibilizando fosfato, íons metálicos, aminoácidos e vitaminas complexados para o ambiente (adaptado de MUKHAMETZYANOVA; AKHMETOVA; SHARIPOVA, 2012).

Numerosos micro-organismos são produtores de fitase, incluindo fungos filamentosos, leveduras, bactérias e protozoários, sendo a maioria pertencente às histidinas ácido-fosfatases ou fitases alcalinas. Recentemente, foi descoberta a produção de fitases por líquens, associações simbióticas entre um fungo e uma alga ou um fungo e uma cianobactéria (HIGGINS; CRITTENDEN, 2015). Muitas fitases microbianas são comercializadas para suplementar rações animais, sendo as de A.

niger as mais usadas (LEI et al., 2007). Micro-organismos produzem fitases como

forma de hidrolisar e aproveitar o fósforo oriundo dos fitatos presentes no solo, bem como da decomposição de plantas. Assim, fitases microbianas são enzimas-chave no ciclo do Porg presente no ambiente e são as únicas a ter esse papel na sua

mineralização (Figura 4) (MUKHAMETZYANOVA; AKHMETOVA; SHARIPOVA, 2012). Bactérias anaeróbias do rúmen também tem papel importante na

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biodisponibilização do fósforo para animais ruminantes, em uma relação de simbiose. Outra forma de obtenção de fitases microbianas é por processos fermentativos, tanto em meio sólido quanto líquido (KUMAR et al., 2016).

2.2. Diferentes grupos de fitases

As fitases são fosfatases capazes de reconhecer o fitato como substrato, diferenciando-as de fosfatases não-específicas. Baseado em características estruturais e na variedade de suas propriedades catalíticas, essas enzimas eram classificadas inicialmente em três (MULLANEY; ULLAH, 2003; VATS; BANERJEE, 2004) e mais atualmente em quatro grupos distintos (BRINCH-PEDERSEN et al., 2014; JAIN; SAPNA; SINGH, 2016; SINGH; SATYANARAYANA, 2015). Nos próximos itens serão discutidas cada uma dessas classes.

2.2.1. Histidina ácido-fosfatases (HAP)

A maioria das fitases conhecidas são pertencentes à histidina ácido-fosfatases, com duas classes representadas pelas PhyA (comercializada como Natuphos®) (Figura 5) e PhyB de Aspergillus niger NRRL 3135. Todos os membros dessa classe possuem um motivo no sítio ativo, N-terminal RHGXRXP e C-terminal HD (BRINCH-PEDERSEN et al., 2014), além de um mecanismo de dois passos que hidrolisam fosfomonoésteres (RIGDEN, 2008).

O sítio específico para o substrato da PhyA apresenta dois aminoácidos ácidos (Glu 228, Asp 262) e quatro aminoácidos básicos (Lys 91, Lys 94, Lys 300 e Lys 301), com atividade em pH 5,0, enquanto que na PhyB existem somente dois aminoácidos ácidos (Asp 75 e Glu 272), com atividade em pH 2,5 (MULLANEY; ULLAH, 2003). Outras diferenças entre as duas classes são que PhyA tem especificidade restrita à diferentes substratos e alta especificidade pelo ácido fítico, enquanto que PhyB tem ampla especificidade por substratos, mas baixa especificidade para o fitato. Finalmente, a forma ativa de PhyA é um monômero, ao passo que em PhyB é um tetrâmero que a torna mais termoestável (SINGH; SATYANARAYANA, 2015; WYSS et al.; 1999).

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Figura 5. Modelo da PhyA de A. niger, uma HAP. Fonte: National Center for Biotechnology

information (NCBI).

2.2.2. Hélice-_{β fosfatases (BPP)}

Esta classe de fitases foi isolada primeiramente de Bacillus subtilis (PhyC, Figura 6) (KEROVUO et al., 1998). Sua estrutura tridimensional consiste principalmente de folhas β e assemelha-se à uma hélice de seis lâminas. Esta enzima é dependente de Ca2+_{e apresenta seis sítios de ligação deste em sua}

molécula (KEROVUO; ROUVINEN; HATZACK, 2000). A ligação dos íons cálcio nesses sítios resulta no aumento da termoestabilidade. A ligação de três íons cálcio adicionais na superfície da proteína favorece a atividade catalítica da enzima um ambiente eletrostático para ligação do fitato (KIM et al., 2010). Existem dois sítios de ligação de fosfato nas BPP, o “sítio de clivagem” onde ocorre a hidrólise do fitato e um “sítio de afinidade”, que melhora a afinidade da ligação com substratos com grupos fosfatos vizinhos como o fitato (SHIN et al., 2001; SINGH; SATYANARAYANA, 2015). Estudos demonstram que a BPP fitases hidrolisam o fitato de cálcio em pH 7,0-8,0 (OH et al., 2001).

As BPPs hidrolisam a cada dois fosfatos, explicando porque a enzima remove grupos alternadamente e gera mioinositóis trifosfatos como produto final. A

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degradação do fitato à IP3 ocorre rapidamente, mas a hidrólise adicional não é

favorecida, uma vez que o grupo fosfato vizinho está faltando (LEI et al., 2007).

Figura 6. Modelo da PhyC de B. subtilis, uma BPP. As esferas cinzas representam os íons Ca2+

ligados à enzima. Fonte: National Center for Biotechnology information (NCBI).

2.2.3. Fosfatases ácidas púrpuras (PAP)

É uma ampla classe de fosfatases e são reportadas principalmente em plantas, mas também encontradas em mamíferos e alguns micro-organismos. Como nas HAPs e em CPs, nem todas essas enzimas utilizam efetivamente o fitato como substrato (LEI et al., 2007). O modelo é a GmPhy encontrada em cotilédones de soja e é a única PAP com significante atividade de fitase. Apresentam um conjunto único de sete aminoácidos (Asp, Asp, Tyr, Asn, His, His, His) necessários para quelar metais (SCHENK et al., 2000). São metalo-hidrolases e possuem um centro metálico binuclear contendo dois átomos de ferro em animais e um de ferro e outro de zinco ou manganês em plantas (Figura 7) (OLCZAK; MORAWIECKA; WATOREK, 2003). Seu tamanho pode variar entre 35 a 55 kDa (BRINCH-PEDERSEN et al., 2014). A transferência de carga de uma tirosina para o Fe (III) fornece à PAP sua cor purpura característica (JOSHI; SATYANARAYANA, 2015).

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Figura 7. Modelo de PAP do feijão vermelho (Phaseolus vulgaris, a estrutura da GmPhy não está

disponível). Ao centro os íons ferro e manganês. Fonte: National Center for Biotechnology information (NCBI).

2.2.4. Cisteína fosfatases (CP)

Esta fitase é produzida pela bactéria anaeróbia Selenomonas

ruminantium, encontrada no rúmen de animais ruminantes. A atividade catalítica é

inibida por íons ferro e outros cátions metálicos (Cu2+_{, Zn}2+_{e Hg}2+_{), mas o efeito}

estimulador do íon chumbo permanece inexplicado (LEI et al., 2007; YANKE et al., 1998) e atua em pH 4,5-5,0 (JOSHI; SATYANARAYANA, 2015). Sua estrutura e mecanismo catalítico são similares à superfamília de cisteína fosfatases contendo o centro ativo motivo conservado HCXXGXXR(T/S), além de apresentar um receptáculo maior e mais profundo capaz de acomodar o fitato como substrato (Figura 8) (CHU et al., 2004; SINGH; SATYANARAYANA, 2015). O modelo também sugere que as cargas negativas do substrato facilitam a ligação. A hidrólise dos grupos fosfato procede sequencialmente até inositol-2-monofosfato como produto final (CHU et al., 2004).

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Figura 8. Modelo da fitase de S. ruminantium, uma CP. Fonte: National Center for Biotechnology

information (NCBI).

2.3. Produção de fitases por processos fermentativos

Como discutido anteriormente, fitases são produzidas por variados micro-organismos, especialmente fungos filamentosos. Entre eles, os mais estudados para produção de fitase são os do gênero Aspergillus, em especial A. niger, entre outros. Inclusive, a primeira fitase comercial introduzida no mercado de rações em 1991, foi produzida por A. niger, sendo comercializada pela empresa BASF sob o nome de Natuphos (SELLE; RAVINDRAN, 2007). Fitases produzidas por bactérias também têm sido bastante estudadas, porém o fato de serem, em sua grande maioria, intracelulares ainda gera alguma dificuldade para produção em grande escala (SINGH; SATYANARAYANA, 2015). Outra possibilidade são as fitases heterólogas, sendo as leveduras os hospedeiros preferênciais por apresentarem características desejáveis como a termoresistência e estabilidade em condições gastrointestinais, além de serem facilmente manipuladas, sendo consideradas células grandes, robustas e nutricionalmente não-exigentes e altas taxas de expressão (SILVA, 1989; YANG; JOHNSON; MURTHY, 2012).

A fermentação para produção de enzimas pode ocorrer de duas formas distintas: fermentação submersa (FS), onde a maior parte do meio é composto por

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água (até 95%) (SINGHANIA et al., 2010), e fermentação em estado sólido (FES), onde o micro-organismo cresce sobre a superfície de uma matriz sólida, na qual a água encontra-se totalmente adsorvida (CHEN, 2013; HANSEN et al., 2015). Recentemente, a FES tem ganhado uma maior importância na produção de enzimas, em especial para a produção de fitase, conforme pode ser observado na Tabela 1.

A FES apresenta algumas vantagens como facilidade de extração, obtenção do produto final mais concentrado, alto rendimento, menor gasto energético, possibilidade de uso de substratos mais baratos, menor produção de resíduos, baixa contaminação e ambiente mais próximo ao natural onde crescem os fungos filamentosos, favorecendo a manutenção de suas características intrínsecas. Contudo, alguns parâmetros ainda são de difícil controle como controle da temperatura, dificuldade nas medições de pH, O2 e CO2, escassez de biorreatores

automatizados, e complexidade em quantificar a biomassa microbiana, além da heterogeneidade do meio (CASTRO; SATO, 2015; BIANCHI; MORAES; CAPALBO, 2001, CHEN, 2013).

Por outro lado, a FS têm sido o método mais utilizado para produção de enzimas, entre elas a fitase, para leveduras e bactérias, embora seja possível encontrar alguns estudos de produção de fitase por bactérias em FES (JAIN; SAPNA; SINGH, 2016). Na indústria, o emprego da FS é amplamente difundido pela facilidade no controle de todo o processo, apesar de ainda existirem problemas a serem superados (CHEN, 2013; SINGHANIA et al., 2010). Entre as vantagens da FS detaca-se a praticidade no controle de parâmetros como temperatura, pH, aeração, agitação, formulação do meio, fácil recuperação da biomassa, adição contínua de nutrientes e produção em larga escala (HANSEN et al., 2015; SINGHANIA et al., 2010). Contudo, características inerentes à FS como produtos pouco concentrados, baixo rendimento, alta Aw favorecendo a contaminação, complexo processo de

extração e elevada geração de resíduo aquoso ainda são desafios a serem vencidos

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Tabela 1. Produção de fitase por micro-organismos em diferentes meios de cultivo.

Micro-organismo Meio de cultivo Referência

Fungos filamentosos

Aspergillus sp. Amido de milho (FS). Shieh; Ware, 1968.

Aspergillus ficuum Farelo de trigo, tortas de soja e milho (FES). Han; Gallagher; Wilfred, 1987.

A. ficuum Farinha de canola (FES). Ebune; Al-Asheh; Duvnjak, 1995.

Aspergillus niger Meio sintético (FES), farelo de trigo, torta de soja (FES) Papagianni; Nokes; Filer, 1999.

Aspergillus oryzae Meio basal (FS), Koji (FES). Fujita et al., 2000 e 2003.

Mucor sp., Rhizopus sp. Tortas de canola, coco e gergelim, farelo de trigo, bagaço de milho,

resíduo de cerveja (FES).

Bogar et al., 2003.

Rhizopus oligosporus Amido de milho (FS). Casey; Walsh, 2004.

Rhizomucor pusillus Farelo de trigo (FES). Chadha et al., 2004.

Mucor racemosus Farelo de trigo, tortas de coco, amendoim, palmiste, oliva, gergelim (FES). Roopesh et al., 2006.

Sporotrichum termophile Tortas de gergelim, mostarda e farelo de trigo (FES). Singh; Satyanarayana, 2006.

A. niger Polpa cítrica (FES). Spier et al., 2009.

A. ficuum Resíduos de sorgo e milho usados para produzir vinagre (FES). Wang et al., 2010.

S. termophile Farelo de trigo, casca de arroz (FES). Javed et al., 2010.

Paecilomyces variotii Torta de mamona (FES). Madeira Jr; Macedo; Macedo,

2011.

Rhizopus oryzae Tortas de linhaça, mostarda, girassol, colza, farelo de trigo, casca de arroz

(FES).

Rani e Ghosh, 2011.

Penicillium funiculosum Feijões branco, vermelho e fradinho, soja, farelos de arroz e trigo, fava,

cevada (FES).

Awad; El-Nashar; Danial, 2011.

Paecilomyces variotii Bagaço de laranja (FES). Madeira Jr; Macedo; Macedo, 2012.

A. niger Amido e glicose (FS). Anita et al., 2012.

Penicillium purporogenum

Farelo trigo, espiga e farelo de milho, casca e talo de arroz, torta de gergelim (FES).

Awad et al., 2014.

Humicola nigrescens Farelos de trigo e arroz, bagaço de cana, torta de mostarda, cascas de

frutas cítricas (FES).

Bala et al., 2014.

Rhizopus microsporus Meio Vogel (FS). Sato et al., 2014.

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Ganoderma australe Meio mineral + fitato. Spier et al., 2015.

R. oligosporus Meio mineral (FS). Suresh; Rhada, 2016.

Leveduras

Kodamaea ohmeri Aveia (FS). Li; Liu; Chi, 2008.

Candida melibiosa Meio mineral + fosfato (FS). Stanchev; Georgiev; Garcova,

2010. Saccharomyces

cerevisiae

Meio basal + sacarose + fitato (FS). Ries; Macedo, 2011.

Pichia anomala Melaço de cana (FS). Vohra; Kaur; Satyanarayana, 2011.

Bactérias

Escherichia coli Luria-Bertani. Greiner; Konietzny; Jany, 1993.

Klebisiella terrígena Meio mineral + peptona + fitato. Greiner et al., 1997.

Lactobacillus sanfranciscensis

Sabouraud Dextrose. Angelis et al., 2003.

Pantoea agglomerans Luria-Bertani. Greiner, 2004.

Bacillus cereus, Staphylococcus lentus

Luria-Bertani, meios minerais (FS). Hussin et al., 2007.

Bacillus laevolacticus Sacarose, farinha de ervilha (FS). Gulati; Chadha; Saini, 2007.

Pseudomonas sp. Meio orgânico complexo (FS). Hosseinkhani; Emtiazi; Nahvi,

2009.

Pseudomonas sp. Tortas de amendoim, gergelim e resíduo de mandioca (FES). Esakkiraj et al., 2010.

Nocardia sp. Farelo de trigo (FS). Bajaj; Wani, 2011.

Mitsuokella jalaludinii Meio mineral (FS). Lan et al., 2011.

Klebsiella sp. Meio mineral + fitato (FS). Mittal et al., 2011.

Klebsiella pneumoniae Meio mineral + fitato (FS). Escobin-Mopera et al., 2012.

Bacillus subtilis Farelo de trigo (FS e FES). Kammoun et al., 2012

Streptomyces sp. Meios minerais (FS). Ghorbani et al., 2012.

(42)

Enterobacter sazakii Luria-Bertani (FS) + farelo de arroz. Hussin; Farouk; Greiner, 2012.

Pantoea vagans Luria-Bertani (FS). Suleimanova et al., 2013.

Bacillus nealsonii Meio mineral (FS). Yu; Chen, 2013.

Burkholderia sp. Meio mineral + fitato (FS). Graminho et al., 2015.

Streptomyces luteogriseus

LB + farelo de trigo (FS). Aly et al., 2015.

Expressão heteróloga* E. coli (Enterobacter

cloacae)

Meio TBY. Herter et al., 2006.

Pichia pastoris (E. coli) Resíduo da produção glutamato monossódico (FS). Bai et al., 2009.

P. pastoris e E. coli (pólen Lilium sp.)

Extrato de levedura, peptona e dextrose (YPD) e Luria-Bertani, respectivamente (FS).

Yang; Johnson; Murthy, 2012. E. coli e B. subtillis

(Enterococcus faecalis)

Meio basal (FS). Farhat-Khemakhem et al., 2012.

P. pastoris (B. subtilis) Meio SM (FS). Sayari et al., 2014.

*Espécie entre parênteses se refere ao doador do gene que expressa a fitase, enquanto que a outra espécie é o micro-organismo receptor do gene e

(43)

Para uma produção mais eficiente de fitases, geralmente o ácido fítico é adicionado ao meio de fermentação em pequenas quantidades como indutor, entretanto, uma série de estudos tem demonstrado que o uso de substratos como farelo de trigo e arroz e tortas de soja e mamona, entre outros, suplementados com quantidade adequada de água e sais minerais têm sido suficientes para produção de altas quantidades da enzima, devido ao conteúdo de fitato presente nestes resíduos (HAN; GALLAGHER; WILFRED, 1987; MADEIRA JR; MACEDO; MACEDO, 2011). Assim, é necessário avaliar todo o processo fermentativo, suas vantagens e desvantagens, bem como o micro-organismo envolvido, a fim de definir as melhores condições para obter máximo rendimento durante a produção da fitase.

2.4. Purificação de fitases

A fim de estudar as propriedades bioquímicas das enzimas, entre elas as fitases, faz-se necessário sua purificação, que consiste em uma série de processos físicos e químicos para remoção de contaminantes. A purificação das fitases inclui técnicas bioquímicas convencionais com etapas para concentração como fracionamento por precipitação com sais de amônia e ultrafiltração seguida por cromatografias em gel, troca iônica, de afinidade e cromatográfica líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) (DVORÁKOVÁ, 1998). Essas cromatografias baseiam-se nas propriedades bioquímicas das moléculas enzimáticas como tamanho, cargas, hidrofobicidade e interações com a fase estacionária.

Após a etapa inicial de concentração, a cromatografia de troca iônica é a mais comum nas etapas intermediárias, geralmente empregando dietilaminoetil (DEAE) como trocador aniônico e carboximetil (CM) como trocador catiônico, ou ainda grupos trocadores fortes como trietilaminoetil, em colunas Mono-Q e Mono-S ou Q-Sepharose. A filtração em gel (exclusão molecular) normalmente é empregada como última etapa, enquanto que o uso de cromatografia de interação hidrofóbica não tem sido muito relatado para purificação de fitases (GREINER; DA SILVA; COURI, 2009; LI et al., 2008; QUAN et al., 2002; ZHU; WANG; NG, 2011). Na maioria das vezes, após cinco ou seis etapas, o fator de purificação varia de cerca de 10 a trezentas vezes, podendo chegar a mais de 16 mil vezes em alguns casos e com rendimentos variando entre 1,3% a 51% (BHAVSAR; KHIRE, 2014).

A eletroforese em gel de poliacrilamida normalmente é utilizada para acompanhar as etapas de purificação, e simultaneamente estimar a massa

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molecular da enzima estudada, desde que sejam feitas corridas simultâneas com proteínas de massas moleculares conhecidas (CASEY; WALSH, 2004; FAROUK; GREINER; HUSSIN, 2012; GRAMINHO, et al., 2015).

2.5. Propriedades bioquímicas das fitases

As fitases possuem propriedades bioquímicas muito diferentes entre si (Tabela 2). A maioria das fitases isoladas são enzimas monoméricas, especialmente as produzidas por fungos e bactérias (exceção é a fitase produzida por

Schwanniomyces castellii, que possui 4 subunidades (SEGUEILHA et al., 1992),

entretanto fitases animais e vegetais geralmente possuem múltiplas subunidades. A fitase isolada do intestino de rato apresenta duas subunidades de 70 kDa e 90 kDa (YANG et al., 1991), ao passo que a fitase presente no milho durante a germinação é composta por duas subunidades de 38 kDa (LABOURE; GAGNON; LESCURE, 1993). A fitase produzida por Paramecium sp apresenta seis diferentes subunidades (FREUND et al., 1992).

As massas moleculares das fitases quase sempre estão entre 30 e 100 kDa, sendo que as fitases fúngicas costumam ser maiores que as bacterianas (JAIN; SAPNA; SINGH, 2016; KONIETZNY; GREINER, 2002; SINGH; SATYANARAYANA, 2015; VATS; BANERJEE, 2004). Fitases fúngicas podem ser glicosiladas como a de

A. niger NRRL 3135, em que o índice de glicosilação da fitase nativa é de 27%

(ULLAH, 1988). Algumas fitases com tamanho maior são de A. niger van Teighem (353 kDa), Sporotrichum thermophile (456 kDa) e Schwanniomyces castellii (490 kDa) (SINGH; SATYANARAYANA, 2015). Foram reportadas duas fitases para a bactéria Klebsiella aerogenes, apresentando extremos de tamanho: a enzima nativa excepcionalmente grande (700kDa) e a outra muito pequena (entre 10 kDa e 13 kDa), sendo possivelmente uma fração da primeira, mas com atividade independente (TAMBE et al., 1994).

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Tabela 2: Principais propriedades bioquímicas de algumas fitases.

Produtor de fitase Massa molecular (kDa) Temperatura ótima (°C) pH ótimo Referência Fungos filamentosos

Aspergillus ficuum 65,5 67 1,3 Zhang et al., 2010.

A. flavus 30 45 7,0 Gaind; Singh, 2015.

A. fumigatus 85-100 58-60 5,0-6,0 Pasamontes et al., 1997.

A. niger 64,9 58 2,2; 5,0-5,5 Ullah; Gibson, 1987.

A. oryzae 60 50 5,5 Shimizu, 1993.

A. terréus 60,5-82,1 70 4,0-5,5 Wyss et al., 1999.

Fusarium verticillioides --- 50 5,0 Marlida et al., 2010.

Myceliophthora thermophila 62,9 --- 5,5 Wyss et al., 1999.

P. simplicissimum 65 55 4,0 Tseng; Fang; Tseng, 2000.

Rhizomucor pusillus --- 70 5.4 Chadha et al., 2004.

Rhizopus oryzae 34 45 1,5; 5,5 Rani; Ghosh, 2011.

Rhizopus oligosporus 124 65 5,0 Casey; Walsh, 2004.

Thermomyces lanuginosus 60 65 6,0 Berka et al., 1998.

Leveduras

Pichia anômala 64 60 4,0 Vohra; Kaur;

Satyanarayana, 2011.

Saccharomyces cerevisiae --- 37 5,6 Ries; Macedo, 2011.

Schwanniomyces castellii 180 + 75 + 75 + 75 77 4,4 Segueilha et al., 1992.

Bactérias

Aerobacter aerogenes --- 25 4,0-5,0 Jain; Sapna; Singh, 2016.

B. amyloliquefaciens 39 70 7,0-8,0 Kim et al., 1998.

B. licheniformis 47 65 6,0-7,0 Jain; Sapna; Singh, 2016.

B. subtilis 37 55 6,3-6,5 Kerovuo et al., 1998.

B. subtilis (natto) 38 60 6,5 Shimizu, 1992.

E. coli 42 55 4,5 Jain; Sapna; Singh, 2016.

Enterobacter sakazakii 43 45-55 4,5 Farouk; Greine;, Hussin,

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Continuação Tabela 2: Principais propriedades bioquímicas de algumas fitases.

Produtor de fitase Massa molecular (kDa) Temperatura ótima (°C) pH ótimo Referência

Klebsiella aerogenes --- 60 4,5-5,2 Jain; Sapna; Singh, 2016.

K. terrígena 40 58 5,0 Greiner et al., 1997.

Pseudomonas sp. --- 40 5,5 Jain; Sapna; Singh, 2016.

Selenomonas ruminantium 46 50-55 4,0-4,5 Jain; Sapna; Singh, 2016.

Vegetais

Aveia 68 38 5,0 Greiner; Alminger, 1999.

Centeio 68 45 6,0 Greiner; Konietzny, 2006.

Cevada P1 66 45 5,0 Greiner; Konietzny, 2006.

Cevada P2 66 55 6,0 Greiner; Konietzny, 2006.

Arroz 67 45 6,0 Greiner; Konietzny, 2006.

Milho (semente) 38 + 38 55 4,8 Laboure; Gagnon; Lescure,

1993.

Pólen de lírio --- 55 8,0 Greiner; Konietzny, 2006.

Soja 59 + 60 55 4,5-4,8 Gibson; Ullah, 1988.

Trigo Phy1 68 45 6,0 Nakano et al., 1999.

Trigo Phy2 66 50 5,0 Nakano et al., 1999.

Animais

Intestino bezerro --- --- 8,6 Bitar; Reinhold, 1972.

Intestino frango --- --- 8,3 Bitar; Reinhold, 1972.

Intestino humano --- --- 7,4 Bitar; Reinhold, 1972.