CAPÍTULO II PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA
5. Avaliação da atividade antioxidante dos mioinositóis produzidos
Os ensaios de DPPH e ORAC são utilizados como indicadores de atividade antioxidante in vitro, mas possuem diferentes mecanismos reacionais. O
A
B
C F
E D
DPPH é um radical livre estável com um elétron não pareado, de onde vem sua ação oxidante. Quando um composto antioxidante doa um próton, o radical é eliminado (GAO; CAO; LI, 2010). O ensaio ORAC estima a atividade antioxidante perante o radical peroxil induzido pela decomposição do AAPH (SHARMA; BHAT, 2009). Este radical livre ataca a sonda fluorescente, diminuindo sua intensidade. Compostos antioxidantes protegem a sonda de perder sua fluorescência (MACEDO et al., 2011).
A avaliação do potencial antioxidante do fitato hidrolisado pela fitase de P.
variotii (após 8h de reação, quando havia maior diversidade de mioinositóis)
apresentou significativa relevância quando comparado à solução de fitato, porém não diferiu estatisticamente quando comparado ao controle (0h de reação, Tabela 13), sugerindo que outros compostos além dos mioinositóis possam estar envolvidos. O fitato e os mioinositóis podem apresentar potencial antioxidante (GREINER; KONIETZNY, 2007), contudo o mecanismo de ação, parece ser diferente daqueles relacionados ao DPPH e ORAC. Os mioinositóis agem inibindo a formação do radical hidroxil (OH’) catalisada pelo ferro em reações envolvendo peróxido (H2O2), pelo sequestro dos íons Fe3+ (PHILLIPPY; GRAFF, 1996;
SCHLEMMER et al., 2009). Esse fenômeno pode ser observado pela diminuição da taxa de oxidação do ácido ascórbico em ácido deídroascórbico, bem como pela inibição da formação de malonaldeído durante a peroxidação lipídica em presença de Ins(1,2,3)P3 e Ins(1,2,3,6)P4 (PHILLIPPY; GRAFF, 1996). Outro estudo demonstrou que o ácido fítico não apresentou atividade antioxidante frente ao radical DPPH, porém após degradação por irradiação com raios gama, sua estrutura foi alterada e então passou a eliminar o radical livre (AHN et al., 2003). Por outro lado, o fitato apresentou importante papel na atividade antioxidante de feijões canadenses quando submetidos à teste ORAC (OOMAH; BLANCHARD; BALASUBRAMANIAN, 2008).
De qualquer forma, é evidente a ação antioxidante quando adicionada a enzima à solução de fitato, seja após hidrólise ou no controle. Uma explicação plausível pode ser a presença de compostos fenólicos produzidos durante a fermentação, bem como peptídeos, e que permaneceram no preparado enzimático mesmo após as etapas de purificação. Estudos têm demonstrado que o P. variotii produz tanase de forma concomitante com a fitase, e que esta é capaz de biotransformar o substrato utilizado na FES, liberando estes compostos tanto na
forma glicosilada como de agliconas, exibindo atividade antioxidante frente aos ensaios de DPPH e ORAC (MADEIRA et al., 2014; NAKAJIMA et al., 2016). Esses demais compostos podem ter encoberto uma possível ação antioxidante dos mioinositóis produzidos durante a desfosforilação do fitato.
Tabela 13: Potencial antioxidante do fitato hidrolisado com a enzima produzida por
P. variotii. Amostra ORAC DPPH Equivalente Trolox (µmol/mg) Concentração da amostra (mg/mL) R² Equivalente Trolox (µmol/mg) Fitato + preparado enzimático P. variotii (0h) 3295,7 ± 160,3a 0,5 – 2,5 0,99 138,1 ± 6,6a Fitato + preparado enzimático P. variotii (8h) 3819,2 ± 511,0a 0,5 – 2,5 0,98 135,4 ± 1,8a Fitato 0,0 ± 0,0 0,5 – 2,5 - 0,0 ± 0,0
*Letras iguais significam médias estatisticamente iguais.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho confirmou a produção de fitase e fosfatases pelo fungo P.
variotii em FES empregando substratos como farelo de arroz e trigo, sendo que
neste último, após otimização por planejamento fatorial pode-se aumentar em 2,5 vezes a produção de fosfatase, ao passo que de fitase manteve-se igual.
Pela primeira vez, o extrato enzimático bruto foi parcialmente purificado após precipitação em sulfato de amônio e duas etapas de cromatografia de troca aniônica em matriz Mono-Q. A caracterização demonstra que a enzima é estável em temperaturas de até 60°C e pH 2,0-8,0, e é pouco afetada por íons metálicos e mais ativa em 55°C e pH ácido (4,0-5,0). A enzima hidrolisou diversos substratos, apresentando maior atividade frente à AMP, podendo ser classificada como uma fosfatase do tipo ecto-5’-nucleotidase e que apresenta atividade de fitase. A análise dos mioinositóis produzidos pelo tratamento com o preparado enzimático revela a
existência de quatro vias de desfosforilação, sendo uma principal e as demais secundárias, com destaque para a hidrólise do fosfato na posição C-2.
Os ensaios ORAC e DPPH apontaram para um potencial antioxidante dos preparados enzimáticos e mistura de mioinositóis, contudo, essa ação parece estar relacionada muito mais ao preparado enzimático que, por estar parcialmente purificado, pode conter outros compostos como fenólicos ou peptídeos, do que aos mioinositóis propriamente ditos produzidos durante a hidrólise.
As características bioquímicas da enzima produzida por P. variotii tornam- na uma alternativa interessante para disponibilização de fosfato a partir de diferentes substratos, gerando variados mioinositóis e também para uma possível aplicação em rações para animais monogástricos, pois possui estabilidade suficiente para suportar os processos de produção. Contudo mais estudos devem ser realizados para comprovar sua eficácia, além de testes alergênicos e toxicológicos. Para uma purificação completa da fitase outros métodos cromatográficos podem ser empregados, piorém é possível que a enzima purificada, assim como as demais descritas na literatura, não seja capaz de degradar completamente o fitato.
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