Produção de fitases por processos fermentativos

Como discutido anteriormente, fitases são produzidas por variados micro- organismos, especialmente fungos filamentosos. Entre eles, os mais estudados para produção de fitase são os do gênero Aspergillus, em especial A. niger, entre outros. Inclusive, a primeira fitase comercial introduzida no mercado de rações em 1991, foi produzida por A. niger, sendo comercializada pela empresa BASF sob o nome de Natuphos (SELLE; RAVINDRAN, 2007). Fitases produzidas por bactérias também têm sido bastante estudadas, porém o fato de serem, em sua grande maioria, intracelulares ainda gera alguma dificuldade para produção em grande escala (SINGH; SATYANARAYANA, 2015). Outra possibilidade são as fitases heterólogas, sendo as leveduras os hospedeiros preferênciais por apresentarem características desejáveis como a termoresistência e estabilidade em condições gastrointestinais, além de serem facilmente manipuladas, sendo consideradas células grandes, robustas e nutricionalmente não-exigentes e altas taxas de expressão (SILVA, 1989; YANG; JOHNSON; MURTHY, 2012).

A fermentação para produção de enzimas pode ocorrer de duas formas distintas: fermentação submersa (FS), onde a maior parte do meio é composto por

água (até 95%) (SINGHANIA et al., 2010), e fermentação em estado sólido (FES), onde o micro-organismo cresce sobre a superfície de uma matriz sólida, na qual a água encontra-se totalmente adsorvida (CHEN, 2013; HANSEN et al., 2015). Recentemente, a FES tem ganhado uma maior importância na produção de enzimas, em especial para a produção de fitase, conforme pode ser observado na Tabela 1.

A FES apresenta algumas vantagens como facilidade de extração, obtenção do produto final mais concentrado, alto rendimento, menor gasto energético, possibilidade de uso de substratos mais baratos, menor produção de resíduos, baixa contaminação e ambiente mais próximo ao natural onde crescem os fungos filamentosos, favorecendo a manutenção de suas características intrínsecas. Contudo, alguns parâmetros ainda são de difícil controle como controle da temperatura, dificuldade nas medições de pH, O2 e CO2, escassez de biorreatores

automatizados, e complexidade em quantificar a biomassa microbiana, além da heterogeneidade do meio (CASTRO; SATO, 2015; BIANCHI; MORAES; CAPALBO, 2001, CHEN, 2013).

Por outro lado, a FS têm sido o método mais utilizado para produção de enzimas, entre elas a fitase, para leveduras e bactérias, embora seja possível encontrar alguns estudos de produção de fitase por bactérias em FES (JAIN; SAPNA; SINGH, 2016). Na indústria, o emprego da FS é amplamente difundido pela facilidade no controle de todo o processo, apesar de ainda existirem problemas a serem superados (CHEN, 2013; SINGHANIA et al., 2010). Entre as vantagens da FS detaca-se a praticidade no controle de parâmetros como temperatura, pH, aeração, agitação, formulação do meio, fácil recuperação da biomassa, adição contínua de nutrientes e produção em larga escala (HANSEN et al., 2015; SINGHANIA et al., 2010). Contudo, características inerentes à FS como produtos pouco concentrados, baixo rendimento, alta Aw favorecendo a contaminação, complexo processo de

extração e elevada geração de resíduo aquoso ainda são desafios a serem vencidos

Tabela 1. Produção de fitase por micro-organismos em diferentes meios de cultivo.

Micro-organismo Meio de cultivo Referência

Fungos filamentosos

Aspergillus sp. Amido de milho (FS). Shieh; Ware, 1968.

Aspergillus ficuum Farelo de trigo, tortas de soja e milho (FES). Han; Gallagher; Wilfred, 1987.

A. ficuum Farinha de canola (FES). Ebune; Al-Asheh; Duvnjak, 1995.

Aspergillus niger Meio sintético (FES), farelo de trigo, torta de soja (FES) Papagianni; Nokes; Filer, 1999.

Aspergillus oryzae Meio basal (FS), Koji (FES). Fujita et al., 2000 e 2003.

Mucor sp., Rhizopus sp. Tortas de canola, coco e gergelim, farelo de trigo, bagaço de milho,

resíduo de cerveja (FES).

Bogar et al., 2003.

Rhizopus oligosporus Amido de milho (FS). Casey; Walsh, 2004.

Rhizomucor pusillus Farelo de trigo (FES). Chadha et al., 2004.

Mucor racemosus Farelo de trigo, tortas de coco, amendoim, palmiste, oliva, gergelim (FES). Roopesh et al., 2006.

Sporotrichum termophile Tortas de gergelim, mostarda e farelo de trigo (FES). Singh; Satyanarayana, 2006.

A. niger Polpa cítrica (FES). Spier et al., 2009.

A. ficuum Resíduos de sorgo e milho usados para produzir vinagre (FES). Wang et al., 2010.

S. termophile Farelo de trigo, casca de arroz (FES). Javed et al., 2010.

Paecilomyces variotii Torta de mamona (FES). Madeira Jr; Macedo; Macedo,

2011.

Rhizopus oryzae Tortas de linhaça, mostarda, girassol, colza, farelo de trigo, casca de arroz

(FES).

Rani e Ghosh, 2011.

Penicillium funiculosum Feijões branco, vermelho e fradinho, soja, farelos de arroz e trigo, fava,

cevada (FES).

Awad; El-Nashar; Danial, 2011.

Paecilomyces variotii Bagaço de laranja (FES). Madeira Jr; Macedo; Macedo, 2012.

A. niger Amido e glicose (FS). Anita et al., 2012.

Penicillium purporogenum

Farelo trigo, espiga e farelo de milho, casca e talo de arroz, torta de gergelim (FES).

Awad et al., 2014.

Humicola nigrescens Farelos de trigo e arroz, bagaço de cana, torta de mostarda, cascas de

frutas cítricas (FES).

Bala et al., 2014.

Rhizopus microsporus Meio Vogel (FS). Sato et al., 2014.

Micro-organismo Meio de cultivo Referência

Ganoderma australe Meio mineral + fitato. Spier et al., 2015.

R. oligosporus Meio mineral (FS). Suresh; Rhada, 2016.

Leveduras

Kodamaea ohmeri Aveia (FS). Li; Liu; Chi, 2008.

Candida melibiosa Meio mineral + fosfato (FS). Stanchev; Georgiev; Garcova,

2010. Saccharomyces

cerevisiae

Meio basal + sacarose + fitato (FS). Ries; Macedo, 2011.

Pichia anomala Melaço de cana (FS). Vohra; Kaur; Satyanarayana, 2011.

Bactérias

Escherichia coli Luria-Bertani. Greiner; Konietzny; Jany, 1993.

Klebisiella terrígena Meio mineral + peptona + fitato. Greiner et al., 1997.

Lactobacillus sanfranciscensis

Sabouraud Dextrose. Angelis et al., 2003.

Pantoea agglomerans Luria-Bertani. Greiner, 2004.

Bacillus cereus, Staphylococcus lentus

Luria-Bertani, meios minerais (FS). Hussin et al., 2007.

Bacillus laevolacticus Sacarose, farinha de ervilha (FS). Gulati; Chadha; Saini, 2007.

Pseudomonas sp. Meio orgânico complexo (FS). Hosseinkhani; Emtiazi; Nahvi,

2009.

Pseudomonas sp. Tortas de amendoim, gergelim e resíduo de mandioca (FES). Esakkiraj et al., 2010.

Nocardia sp. Farelo de trigo (FS). Bajaj; Wani, 2011.

Mitsuokella jalaludinii Meio mineral (FS). Lan et al., 2011.

Klebsiella sp. Meio mineral + fitato (FS). Mittal et al., 2011.

Klebsiella pneumoniae Meio mineral + fitato (FS). Escobin-Mopera et al., 2012.

Bacillus subtilis Farelo de trigo (FS e FES). Kammoun et al., 2012

Streptomyces sp. Meios minerais (FS). Ghorbani et al., 2012.

Micro-organismo Meio de cultivo Referência

Enterobacter sazakii Luria-Bertani (FS) + farelo de arroz. Hussin; Farouk; Greiner, 2012.

Pantoea vagans Luria-Bertani (FS). Suleimanova et al., 2013.

Bacillus nealsonii Meio mineral (FS). Yu; Chen, 2013.

Burkholderia sp. Meio mineral + fitato (FS). Graminho et al., 2015.

Streptomyces luteogriseus

LB + farelo de trigo (FS). Aly et al., 2015.

Expressão heteróloga* E. coli (Enterobacter

cloacae)

Meio TBY. Herter et al., 2006.

Pichia pastoris (E. coli) Resíduo da produção glutamato monossódico (FS). Bai et al., 2009.

P. pastoris e E. coli (pólen Lilium sp.)

Extrato de levedura, peptona e dextrose (YPD) e Luria-Bertani, respectivamente (FS).

Yang; Johnson; Murthy, 2012. E. coli e B. subtillis

(Enterococcus faecalis)

Meio basal (FS). Farhat-Khemakhem et al., 2012.

P. pastoris (B. subtilis) Meio SM (FS). Sayari et al., 2014.

*Espécie entre parênteses se refere ao doador do gene que expressa a fitase, enquanto que a outra espécie é o micro-organismo receptor do gene e

Para uma produção mais eficiente de fitases, geralmente o ácido fítico é adicionado ao meio de fermentação em pequenas quantidades como indutor, entretanto, uma série de estudos tem demonstrado que o uso de substratos como farelo de trigo e arroz e tortas de soja e mamona, entre outros, suplementados com quantidade adequada de água e sais minerais têm sido suficientes para produção de altas quantidades da enzima, devido ao conteúdo de fitato presente nestes resíduos (HAN; GALLAGHER; WILFRED, 1987; MADEIRA JR; MACEDO; MACEDO, 2011). Assim, é necessário avaliar todo o processo fermentativo, suas vantagens e desvantagens, bem como o micro-organismo envolvido, a fim de definir as melhores condições para obter máximo rendimento durante a produção da fitase.