A proposta levada em conta para o presente trabalho buscou avaliar quais as possibilidades de se desenvolver e aplicar um trabalho em média para larga escala de caracterização de genes e proteínas de função desconhecida. O trabalho em si foi desenvolvido sob a perspectiva de se poder realizar diversas etapas de estudos da natureza das proteínas e das suas funcionalidades como um projeto piloto. Para tal, alguns dos resultados observados ao longo do trabalho podem ser levados em conta como uma experiência positiva para futuros desafios.
A primeira observação a ser levantada é sobre o grupo gênico eleito para o trabalho. O fator de agrupamento dos genes a serem estudados desta forma é fator de extrema importância e influência ao longo do trabalho. Se o agrupamento é realizado baseando-se nos padrões de expressão diferencial, como foi realizado neste trabalho, é de se esperar que os genes possuam pouca ou nenhuma relação funcional direta entre si. Desta forma, uma caracterização minuciosa de cada um dos genes exige uma atenção maior para cada um deles individualmente, prestando
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atenção nas vias metabólicas às quais fazem parte, aos diferentes parceiros moleculares e as melhores formas de recuperá-los experimentalmente, sempre levando em conta a pesquisa da natureza íntima de cada uma das proteínas e seu pequeno universo de atividades na célula. Este cenário agrava-se com a inclusão de proteínas de função desconhecida ao grupo selecionado. A ausência de informações exige um cuidado maior ao se confiar em resultados nunca vistos, tornando esta prática num meticuloso balanço de vantagens e desvantagens. O estudo de genes desconexos metabolicamente e de proteínas hipotéticas exige um trabalho mais cuidadoso e árduo que, em caso de sucesso, apresenta-se ao final como de grande estima e valor, principalmente pela natureza das informações novas. O mesmo trabalho pode ser realizado com genes pertencentes a uma via metabólica ou a um complexo protéico em comum, e desta forma a caracterização se torna mais prática, uma vez que os genes e as proteínas podem ser estudados juntos, inclusive funcionalmente. Neste caso, mesmo na presença de proteínas de função desconhecida, a caracterização de uma pequena via ou complexo ainda se mantém mais fácil, uma vez que organismos próximos que mantém ortologia com as proteínas em questão podem servir de molde para comparação e preenchimento das vias metabólicas. Recentemente, com os atuais trabalhos de caracterização de organismos por métodos em larga escala, tem se tornado cada vez mais comum a observação de vias gênicas, protéicas ou metabólicas com participação mista de proteínas funcionalmente caracterizadas e de proteínas sem função atribuída.
Uma vez os genes estando selecionados, é de vital necessidade a implementação de um sistema de clonagem baseado em sistemas livres de digestão enzimática, como o caso da plataforma Gateway de clonagem por recombinação. A etapa de clonagem tradicional em si foi o maior obstáculo a ser vencido pelos entusiastas a desenvolverem os grandes projetos de clonagem e caracterização en masse de organismos modelos. O alívio surgiu com a aplicação de sistemas, como o Gateway, onde as clonagens podem ser realizadas de forma universal, através do uso de adaptadores, e de forma rápida e prática. De fato, os sistemas recombinatórios facilmente permitem ao usuário a capacidade de clonar e selecionar literalmente centenas de genes em espaços consideravelmente curtos de tempo. Para o presente trabalho, o grupo inteiro de genes foi amplificado e clonado com sucesso num espaço de 7 dias.
O processo de expressão das proteínas se torna inevitavelmente uma etapa mais lenta e trabalhosa. Como a fisiologia da célula bacteriana responde de forma
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singular para cada tipo de peptídeo heterólogo que é produzido, é necessária uma elaboração das condições utilizadas. No presente trabalho foi decidido que, primeiramente, todos os 10 clones transformantes seriam submetidos às mesmas condições de indução (com IPTG 1mM, por 2 horas de indução, a 37°C e 200 rpm). Após avaliação das expressões, as culturas que apresentaram proteína recombinante seguiam para a purificação. As culturas que não apresentaram proteínas expressas retornaram ao passo de indução sob condições diferentes, como temperaturas mais baixas ou mais altas, tempos de indução menor ou maior e adição de etanol, até que todas as proteínas tivessem sido expressas ou as condições testadas. A etapa de indução pode ser custosa em tempo e em recursos, portanto as expressões devem ser levadas em grupo e atenção especial deve ser dada apenas em casos especiais, onde existe a necessidade da obtenção da proteína. Recentemente, novas metodologias buscam amenizar a etapa de indução, numa tentativa de torná-la mais compatível com a filosofia de trabalho em larga- escala. Novas cepas de indução como a Bl21AI possuem o gene da RNA Polimerase T7 sobre controle do promotor araBAD (BL21-AI Competent Cells Invitrogen). Desta forma a indução ocorre com a adição de arabinose à cultura, tonando o processo de indução mais barato e mais eficiente (o sistema possui menos vazamento de expressão).
Outra etapa crítica ao trabalho e que exige muito tempo do pesquisador é a purificação das proteínas e imunização de cobaias para produção de soro policlonal. Uma purificação eficiente é de extrema importância para evitar que proteínas de E. coli, que podem ser altamente imunorreativas, estimule o sistema imune, provocando uma resposta cruzada. Portanto, é essencial inocular a menor quantidade de proteínas contaminantes possível. Neste ponto deve ser levada em conta uma série de detalhes que serão de interesse do pesquisador e do tipo de resposta desejado. Desde a escolha da cobaia, vias de inoculação, adjuvantes utilizados, tempo total do experimento até o método de coleta do sangue total são fatores influentes à quantidade e qualidade do soro obtido. Como a resposta imunológica é individual de cada espécie e pode até mesmo ser específica para cada cobaia, é essencial que haja etapas de teste com intuito de avaliar a melhor combinação de fatores para determinado tipo de animal utilizado.
Até o presente momento, a maior dificuldade no trabalho tem sido a produção de soros específicos com altos títulos. Os animais, quando separados e testados para os experimentos, antes das inoculações com as proteínas recombinantes, podem
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ocasionalmente apresentar uma resposta contra algum antígeno do extrato do parasita, muitas vezes impossibilitando o uso do animal no experimento. Este é um fenômeno que pode ser decorrente de uma série de questões, como o ambiente em que as cobaias são mantidas e a presença de parasitas intestinais, por exemplo. Da mesma forma, o soro retirado das cobaias pode apresentar hiper-reatividade frente a extratos protéicos de E. coli, uma vez que o processo de produção de proteínas recombinantes ocorre através da indução de culturas bacterianas. Por conta desse padrão de resposta inespecífica aos antígenos inoculados, surge a necessidade de purificar os soros antes de utilizá-los nos demais experimentos. Como foi demonstrado ao longo deste trabalho, é essencial a utilização de duas ou mais metodologias diferentes de purificação de proteínas recombinantes. A ausência de bandas contaminantes visualizadas em gel de poliacrilamida não significa que pequenas quantidades de proteínas bacterianas possam estar sendo copurificadas ao longo do processo. Pequenas quantidades de proteína de E coli com perfil imunodominante são suficientes para perturbar a resposta imunológica do animal, direcionando um efetivo maior de resposta ao peptídeo bacteriano (possível causa do ocorrido com a imunização da proteína H09, Figura 5.68)
Uma vez os soros purificados e testados, podem-se iniciar a série de ensaios necessários para a caracterização das proteínas. Nesta parte do trabalho, a quantidade e qualidade das informações obtidas é fator diretamente ligado à qualidade dos ensaios prévios, ou seja, o máximo de cuidado e dedicação deve ser prestado ao trabalho para que os resultados finais estejam de acordo e sejam confiantes. Sem ferramentas de qualidade, como bons soros e extratos bem preparados, os ensaios podem ser comprometidos.
Portanto, as recentes atualizações e melhorias de todo o processo necessário para caracterização de genes e proteínas, geraram um cenário atual onde é possível a caracterização e descrição de grandes quantidades de elementos biológicos em curtos períodos de tempo. O estabelecimento destas técnicas e, principalmente, a forma como os pesquisadores lidam com as atuais mudanças de paradigmas, são essenciais para o desenvolvimento de trabalhos com porte suficiente para que se possa estudar um organismo em larga escala.
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CONCLUSÕES
A forma como o presente trabalho se desenvolveu, como um piloto para projetos em média escala, apresentou-se eficaz e eficiente, principalmente pelas tecnologias adotadas, como a utilização do sistema de clonagem baseado em recombinação. O sistema ainda pode ser ampliado com a inclusão de novos vetores adaptados à plataforma, como o caso do vetor pTcPR-GFPN.
Analisando de forma geral os perfis comparados entre o mRNA e a expressão de cada proteína notamos que os padrões nem sempre parecem coincidir. Seja essa uma característica marcante de cinetoplastideos ou não, os fenômenos focados nas populações de RNA e de proteínas aparentam ser dissimilares em vários momentos, e algumas considerações devem ser ressaltadas frente a isto. Primeiramente, é evidente a necessidade de cada vez mais informações sobre os sistemas (organismos) com os quais trabalhamos, e é cada vez mais evidente como ressaltado na introdução deste trabalho, que a falta de informações pode levar o pesquisador a tomar decisões muitas vezes errôneas. Resta-nos a missão de agregar cada vez mais informações e dados sobre os sistemas em estudo, tornando assim a (inalcançável) verdade mais próxima de nós. Outro fato já historicamente demonstrado e que necessita ser ressaltado é a influência da biologia dos tripanosomatídeos sobre os fenômenos observados. A discrepância entre os achados transcritômicos e proteômicos, como demonstrado pelos padrões de Western blots e os gráficos de mRNA dos genes e proteínas do presente estudo, demostram que organismos como o Trypanosoma cruzi ainda são carentes de novas informações sobre sua regulação da expressão gênica.
Resumidamente, o presente estudo avaliou a existência e a qualidade das informações sobre genes de pouca ou nenhuma informação existente. Ainda, num esforço de buscar novos dados ao organismo, o grupo constituído por 10 genes distintos foi analisado, amplificado e clonado com sucesso em pouco tempo. Os 10 candidatos foram rapidamente clonados e assim inseridos numa plataforma de clonagem recombinatória. Dos 10 candidatos, 9 foram selecionados corretamente, tendo suas seqüências confirmadas. Todos os 9 clones foram propagados dentro da plataforma facilmente e submetidos à indução e expressão de proteínas recombinantes, sendo que 8 obtiveram sucesso no processo (sem contar aqui a isoforma de H07 que foi amplificada, clonada e induzida como os demais genes). Todas as proteínas produzidas foram purificadas e inoculadas em cobaias, gerando
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assim soros policlonais que, por sua vez, foram purificados e utilizados em imunoensaios.
Os soros obtidos foram utilizados em ensaios para obtenção dos padrões de expressão ao longo da metaciclogênese do parasita, sendo que foram gerados padrões para 7 das proteínas e ensaios de localização celular por microscopia ótica e eletrônica para 4 proteínas. Os dados de uma das proteínas estudadas puderam ser utilizados para determinação da estrutura tridimensional por homologia e uma proteína pôde ser averiguada através de ensaios de infecção de células mamíferas. Foram realizados também ensaios de transfecção para 8 proteínas e ensaios de imunoprecipitação para todas as 9 proteínas expressas.
O presente trabalho abre um leque de oportunidades de estudos para os genes e proteínas inicialmente caracterizados, gerando possibilidades para um universo de tarefas ainda a ser realizadas.
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