A proteína TcExp02H08 apresenta a discreta assinatura do domínio zinc finger, tipo C2H2 (Figura 5.59). A estrutura da proteína apresenta um grande enriquecimento dos aminoácidos prolina e serina ao longo de sua seqüência primária. O mesmo enriquecimento pode ser visto nas seqüências protéicas de seus ortólogos. Outra característica que o alinhamento revela é a relativa baixa identidade entre os ortólogos próximos de tripanossomatídeos (Figura 5.60). É possível observar grandes regiões que o programa ClustalW não conseguiu alinhar nas seqüências.
Figura 5.59. Resultado da análise da proteína TcExp02H08 pelo banco de famílias protéicas PFAM. Description: descrição do domínio; Entry type: tipo de domínio encontrado; Sequence: tamanho das seqüências, HMM; região modelo usado peelo programa, Bits score e E-valeu: valores estatísticos que demonstram a chance do alinhamento ter ocorrido ao acaso.
O domínio zinc finger foi descrito primeiramente em 1984 por Ginsberg e colaboradores como elemento essencial no reconhecimento de sítios específicos no DNA. As proteínas do tipo zinc finger representam, provavelmente, o maior repertório de proteínas de interação a ácidos nucléicos nos eucariotos, sendo estimado que até 1% do genoma humano seja composto por proteínas que apresentam domínio zinc finger (Böhm et al, 1997).
Utilizando bancos de dados para busca de proteínas similares, os resultados apontam a proteína H08 como uma possível ortóloga da proteína de interação à DAZ. A proteína DAZ em humanos aparenta ser um fator com papel no desenvolvimento de células germinativas e na manutenção das populações germinativas, masculinas e femininas (Moore et al, 2004). Apesar disso, buscas pela proteína DAZ em T. cruzi não resultaram em ortólogos evidentes. Neste caso ou a proteína DAZ está realmente ausente em T. cruzi ou a sua seqüência divergiu muito tornando necessária uma busca mais minuciosa pelo genoma.
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Figura 5.60. Demonstração do alinhamento múltiplo realizado pelo ClustalW com seqüências de tripanossomatídeos evolutivamente próximos ao T.cruzi. Acima está representada a região N – terminal contendo o domínio. Ao final da figura está representada a região C – terminal apresentando o enriquecimento dos aminoácidos serina e prolina. Em vermelho: aminoácidos básicos; em roxo: aminoácidos ácidos; em amarelo: prolina; em azul: demais aminoácidos não polares; em laranja: glicina, em abóbora: cisteína; em verde: demais aminoácidos polares não carregados.
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Os padrões obtidos pelo microarranjo não confirmam os dados anteriores de que o gene H08 estaria sendo regulado (Figura 5.61).
Figura 5.61. Gráfico apresentando os valores em logaritmo (base 2) da expressão do mRNA do gene TcExp02H08 em ensaios por microarranjo. O experimento utilizou dados de quatro experimentos independentes. Epi1 a Epi4: epimastigota; Met1 a Met4: tripomastigota metacíclico; Trp1 a Trp4: tripomastigota sangüínea de cultura; Ama1 a Ama14: amastigota. Os valores de expressão partem do valor zero, representado pela média dos sinais de expressão. Ns: valores de teste t não significativos. Valor do teste F indicado no canto superior direito da figura.
A proteína recombinante H08 foi expressa com sucesso, migrando em gel de poliacrilamida numa faixa aproximada de 90 kDa. As purificações através de cromatografia de níquel não renderam quantidades suficientes para inoculação, portanto a proteína foi recortada de gel de poliacrilamida e eluída por eletroeluição (Figura 5.62)
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Figura 5.62. Imagem do gel de acrilamida contendo alíquotas do processo de expressão e fracionamento celular. M: marcador de tamanho Benchmark, NI: não induzido, FT: fração total do lisado celular, FI: fração contendo proteínas insolúveis, FS: fração contendo proteínas solúveis, W: Western blot da fração insolúvel utilizando soro anti histidina.
O Western blot demonstrando a expressão da proteína ao longo da metaciclogênese apresenta um padrão compatível com os padrões observados pelo microarranjo (Figura 5.63)
Figura 5.63. Padrão de expressão da proteína TcExp02H08 durante a metaciclogênese utilizando o soro anti-H08. E3: epimastigotas em 3 dias de cultura, E5: epimastigotas em 5 dias de cultura, S: células sob estresse nutritivo, A3, A6, A12, A18 e A24: células aderidas após 3, 6, 12, 18 e 24 horas de diferenciação, respectivamente; M: tripomastigotas metacíclicas. Gel carregado com 5 µg de cada extrato protéico. (Figura 4.7). Tamanho predito para TcExp02H08: 80,7 kDa.
Para a continuação dos estudos com a proteína H08 é necessário ainda realizar a localização celular e os estudos de proteômica através dos ensaios de imunoprecipitação para identificação dos complexos reconhecidos pelo soro. É de interesse também, a realização de ensaios para interação da proteína H08 com ácidos nucléicos em busca dos alvos de interação da proteína.
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TcExp02H09 – Provável Proteína p17, Subunidade da DNA Polimerase ε
A assinatura do domínio presente na proteína H09 (Figura 5.64) diz respeito ao fator de transcrição semelhante à histona (Histona-like transcription factor), entretanto buscas por proteínas similares apontam relativa identidade com proteínas de outros organismos, denominadas de proteína p17, subunidade do complexo DNA dependente DNA polimerase ε.Figura 5.64. Resultado da análise da proteína TcExp02H09 pelo banco de famílias protéicas PFAM. Description: descrição do domínio; Entry type: tipo de domínio encontrado; Sequence: tamanho das seqüências, HMM; região modelo usado peelo programa, Bits score e E-valeu: valores estatísticos que demonstram a chance do alinhamento ter ocorrido ao acaso.
O complexo DNA polimerase ε é um dos oito complexos DNA polimerase (Pol) cuja atividade fora identificada até o momento. De forma similar à δ, a DNA polimerase ε possui uma atividade exonuclease intrínseca, alta processividade e é ausente de atividade primase (Syvaoja et al., 1990). Diferentemente da Pol δ, a polimerase ε mantém sua alta processividade, mesmo na ausência da subunidade que confere processividade (proteína PCNA, proliferating cell nuclear antigen), e sua atividade a posiciona essencialmente como uma polimerase replicativa (Huang et al., 1999).
O complexo polimerase ε é composto pela união de 4 subunidades que em T. cruzi receberam transferência de anotação por homologia (o organismo de origem da anotação é desconhecido). Apenas as duas maiores subunidades foram corretamente anotadas; as duas menores, aparentemente mais divergentes, foram anotadas como ‘proteína hipotética’ (Figura 5.65).
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Figura 5.65. Evidência das anotações presentes nos bancos de dados e as respectivas identidades das subunidades da polimerase ε de T. cruzi comparadas com as subunidades de Homo sapiens. Id. Dos genes: Nome atribuído aos respectivos genes de H. sapiens e T. cruzi.
A figura 5.66 demonstra que o T.cruzi possui possíveis ortólogos da subunidade em questão. Percebe-se que a proteína possui uma variação muito grande na sua região N-terminal, mantendo a sua conservação entre os ortólogos na região onde se situa o domínio da proteína.
Figura 5.66. Demonstração do alinhamento múltiplo realizado pelo ClustalW com seqüências de tripanossomatídeos próximos ao T.cruzi. Em vermelho: aminoácidos básicos; em roxo: aminoácidos ácidos; em amarelo: prolina; em azul: demais aminoácidos não polares; em laranja: glicina, em abóbora: cisteína; em verde: demais aminoácidos polares não carregados.
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Os padrões de expressão de mRNA do gene H09 indicam-no como sendo mais um gene sem expressão diferencial entre os diferentes estádios do ciclo de vida (Figura 5.67).
Figura 5.67. Gráfico apresentando os valores em logaritmo (base 2) da expressão do mRNA do gene TcExp02H09 em ensaios por microarranjo. O experimento utilizou dados de quatro experimentos independentes. Epi1 a Epi4: epimastigota; Met1 a Met4: tripomastigota metacíclico; Trp1 a Trp4: tripomastigota sangüínea de cultura; Ama1 a Ama14: amastigota. Os valores de expressão partem do valor zero, representado pela média dos sinais de expressão. Ns: valores de teste t não significativos. Valor do teste F indicado no canto superior direito da figura.
Apesar da proteína H09 ter sido expressa (Figura 5.68), a sua purificação por cromatografia de afinidade não rendeu quantidade suficiente para inoculação em camundongos. Portanto a proteína foi expressa e purificada a partir da eletroluição da banda do gel de poliacrilamida.
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Figura 5.68. Imagem do gel de acrilamida contendo alíquotas do processo de expressão e fracionamento celular. M: marcador de tamanho Benchmark, FI: fração contendo proteínas insolúveis, FS: fração contendo proteínas solúveis, W1: Western blot da fração insolúvel utilizando soro anti histidina. Tamanho predito para TcExp02H09: 21,4 kDa.
A realização do Western blot do soro anti-H09 contra as amostras de proteína recombinante apresentou um padrão inesperado, gerando uma banda de tamanho 5 vezes maior do que o esperado (Figura 5.69, direita), apesar de o Western blot realizado com o anticorpo anti-histidina ter apresentado o resultado esperado. Esta diferença na forma como o anticorpo anti histidina e o soro reagem contra a proteína é um indício de que a resposta humoral do animal inoculado tenha se voltado contra outra(s) proteína(s) presente(s) na purificação. Este tipo de resultado reforça a necessidade de se utilizar mais de um processo de purificação de proteína.
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Figura 5.69. Padrões de reconhecimento da proteína TcExp02H09. H: Western blot da amostra de proteína recombinante purificada utilizando soro anti-histidina. S: Western blot da amostra de proteína recombinante purificada utilizando soro anti proteína H09 purificado, E: Western blot de extrato de epimastigota com 3 dias de cultura utilizando o soro anti proteína H09 purificado. Massa molecular predita para H09: 21,4 kDa.
O Western blot realizado com o soro anti-H09 e o extrato do parasita apresenta 4 bandas, todas acima do tamanho esperado para a proteína H09 (20 kDa). Por conta destes resultados inesperados, decidiu-se não prosseguir com os ensaios de localização celular até a obtenção de um antissoro de melhor qualidade.
Para o prosseguimento dos estudos da proteína H09 devem-se repetir as imunizações de cobaias com preparados purificados da proteína recombinante, buscando um padrão de reconhecimento compatível com as funções da proteína.
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