A proteína H10 possui um domínio em sua estrutura denominado Mov34, e a proteína em si possui maior semelhança com proteínas denominadas de CSN6 (Figura 5.70), subunidade de um complexo participante da via de degradação protéica, denominado de COP9 singalossoma (COP9 singalosome – CSN). Este complexo protéico fora descrito primeiramente em plantas, em estudos baseados em mutantes exibindo alterações fotomorfogênicas (Wei & Deng, 1992). A descoberta de que o complexo CSN possui atividade do tipo NEDD8 isopeptidase cria automaticamente uma ligação do CSN à família de proteínas tipo cullina-RING (culling-RING) de ubiquitinas ligase E3 (Cope et al, 2002). A proteína NEDD8 (neural precursor cell-expressed developmentally) é uma proteína do tipo ubiqüitina (ubiquitin-like) que pode ser conjugada às proteínas cullinas através de um processo de nedilação (neddylation). As etapas enzimáticas da nedilação são similares a ubiqüitinação, mas são catalizadas por um grupo específico de enzimas E1, E2 e E3.
Figura 5.70. Resultado Resultado da análise da proteína TcExp02H10 pelo banco de famílias protéicas PFAM. Description: descrição do domínio; Entry type: tipo de domínio encontrado; Sequence: tamanho das seqüências, HMM; região modelo usado peelo programa, Bits score e E-valeu: valores estatísticos que demonstram a chance do alinhamento ter ocorrido ao acaso.
Atualmente a função do complexo COP9 reside em importantes vias celulares como na resposta ao dano no DNA, controle do ciclo celular (regulação de ciclinas) e expressão gênica (Wei et al, 2008). O arquétipo do complexo COP9 (descrito em Arabidopsis thaliana) possui 8 subunidades, e o número de subunidades no complexo pode variar de acordo com o organismo. Seis subunidades possuem o domínio funcional PCI (subunidades 1,2,3,4,7 e 8), também conhecido como motivo PINT e as duas demais possuem o domínio MOV34, também conhecido como MPN (subunidade 5, com capacidade catalítica e a subunidade 6, possível ortóloga de H10). Ambos os domínios são pouco caracterizados funcionalmente, e é sabido apenas que ambos são encontrados em proteínas presentes em grandes complexos protéicos (Pfam).
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Os padrões de expressão de mRNA durante o ciclo de vida revelam que o gene H10 não aparenta possuir regulação alguma. O gene TcExpH10 é mais um exemplo dos cuidados necessários na interpretação de dados de expressão, e da necessidade de se obter réplicas biológicas para os ensaios. A combinação de padrões, se escolhidos individualmente, podem passar a impressão da ocorrência de regulação (ver padrões Epi1 e Met2 ou Epi2 e Met3 na figura 5.51). Levando em conta os padrões como um todo, não há indícios claros da existência de controle da expressão de H10 em algum ponto do ciclo de vida.
Figura 5.71. Gráfico apresentando os valores em logaritmo (base 2) da expressão do mRNA do gene TcExp02H10 em ensaios por microarranjo. O experimento utilizou dados de quatro experimentos independentes. Epi1 a Epi4: epimastigota; Met1 a Met4: tripomastigota metacíclico; Trp1 a Trp4: tripomastigota sangüínea de cultura; Ama1 a Ama14: amastigota. Os valores de expressão partem do valor zero, representado pela média dos sinais de expressão. Ns: valores de teste t não significativos. Valor do teste F indicado no canto superior direito da figura.
Observando o alinhamento múltiplo realizado pelo ClustalW na figura 5.72, vemos que a proteína H10 possui conservação relativamente alta em tripanosomatídeos, exceto em Leishmainas.
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Submetendo a seqüência protéica da proteína H10 ao programa BLASTP (NCBI) nota-se que não é possível observar seqüências de Leishmanias entre os melhores resultados. Esta observação somente poderia ser um indicativo de que possivelmente Leishmanias não possuem ortólogos de H10. Porém, ao analizarmos o conteúdo dos genomas de alguns tripanosomatídeos é possível observar que a região cromossômica onde o gene H10 está localizado possui uma organização estrutural muito semelhante, sendo um indicativo de sintenia, inclusive em Leishmania. A semelhança com que os genes estão organizados é um indício de que as Leishmanias possuam sim um ortólogo, mas de baixa similaridade.
Figura 5.72. Demonstração do alinhamento múltiplo realizado pelo ClustalW com seqüências de tripanossomatídeos próximos ao T.cruzi. Em vermelho: aminoácidos básicos; em roxo: aminoácidos ácidos; em amarelo: prolina; em azul: demais aminoácidos não polares; em laranja: glicina, em abóbora: cisteína; em verde: demais aminoácidos polares não carregados.
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A proteína H10 expressou na sua forma insolúvel (Figura 5.73), e as quantidades obtidas não foram suficientes para que fosse possível realizar a cromatografia por afinidade em resina de níquel. Portanto a purificação da proteína foi realizada em uma etapa apenas por eletroeluição de gel de poliacrilamida.
Figura 5.73. Imagem do gel de acrilamida contendo alíquotas do processo de expressão e fracionamento celular. M: marcador de masa molecular Benchmark, NI: não induzido, FT: fração total, FI: fração contendo proteínas insolúveis, FS: fração contendo proteínas solúveis, W: Western blot da fração insolúvel utilizando soro anti histidina. Massa molecular predita para TcExp02H10: 42,1 kDa.
Figura 5.74. Padrão de expressão da proteína TcExp02H10 durante a metaciclogênese utilizando o soro anti-H10. E3: epimastigotas em 3 dias de cultura, E5: epimastigotas em 5 dias de cultura, S: células sob estresse nutritivo, A3, A6, A12, A18 e A24: células aderidas após 3, 6, 12, 18 e 24 horas de diferenciação, respectivamente, M: tripomastigotas metacíclicas. Gel carregado com 5 µg de cada extrato protéico. (Figura 4.7). Massa molecular predita para H10: 42,1 kDa.
A realização da análise do padrão de expressão da proteína H10 durante a metaciclogênese (Figura 5.74) demonstra a existência de duas bandas que persistem pelos estádios ao longo da transformação da célula (50 e 60 kDa), e uma banda altamente reativa que surge apenas no estádio metacíclico, aparentando
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possuir 100 kDa. O motivo pelo qual o soro purificado produza este tipo de padrão e a natureza das proteínas reconhecidas pelo mesmo ainda é desconhecido e exige mais estudos.