A proteína TcExp02H01 apresenta em sua estrutura primária a assinatura de um domínio FSH1 (serina hidrolase), um domínio RWD de interação entre proteínas e dois domínios do tipo GTPase (Figura 5.4). Enquanto que o domínio FSH1 possui o provável sítio ativo que caracteriza a proteína em questão como uma protease, os demais domínios devem atuar no acoplamento de alvos e no reconhecimento de substratos específicos. Enzimas proteolíticas agem como efetoras positivas ou negativas de uma série de processos biológicos, atuando como um dos agentes reguladores da fisiologia celular (Neurath, 1984). A presença da região de interação a proteínas e das regiões específicas para quebra de GTP são mais um indício de que a proteína H01 possa ser uma protease.
Até o momento um grande número de vias metabólicas envolvendo peptidases já foi descrito, entretanto muito trabalho ainda falta para a correta descrição particular do papel de cada peptidase nas vias celulares. Atualmente são reconhecidas 5 classes de peptidases baseando-se nos seus mecanismos catalíticos: aspartato, cisteína, metalo, treonina e serina peptidase (Barret et al, 2003). Comparando a proteína TcExp02H01 contra o banco de dados de peptidases MEROPS (Rawlings & Barret, 2007), o resultado de maior identidade obtido indica maior semelhança com proteínas do clã SC, família S33 (Prolil aminopeptidases). As enzimas do clã SC são também conhecidas como enzimas de dobramento α/β (α/β
hydrolase-fold), por conta de sua estrutura de folhas β paralelas cercadas por α- hélices. A família S33 é basicamente constituída por exopeptidases que atuam no terminal amino de peptídeos, liberando geralmente, mas não exclusivamente, uma prolina da região terminal. A estrutura terciária resolvida de prolil aminopeptidases conhecidas demonstram que a protease é composta por dois domínios, com o sítio ativo localizado entre ambos. O domínio maior adota a conformação do tipo α/β, por isso a família pertence ao clã SC. Estudos genômicos em organismos modelos indicam que o número de peptidases pode varia de organismo para organismo,
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podendo ser em alguns casos, uma família com grande representatividade. Atualmente 18 famílias de peptidases S33 foram identificadas no genoma humano, entretanto muitas delas não exercem atividade peptidase, atuando, por exemplo, em vias de destoxificação celular (Arand et al, 2005).
A análise dos padrões de expressão de mRNA observados indica que a expressão do gene de H01 possui tendência a se manter estável durante o ciclo de vida, com alterações sutis, portanto conclui-se que o gene H01 não deve ser considerado como sendo diferencialmente expresso (Figura 5.5).
Figura 5.4. Resultado da análise da proteína TcExpH01 pelo banco de famílias protéicas PFAM. Description: descrição do domínio; Entry type: tipo de domínio encontrado; Sequence: tamanho das seqüências, HMM; região modelo usado pelo programa; Bits score e E-value: valor estatístico que demonstram a chance do alinhamento ter ocorrido ao acaso.
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Figura 5.5. Gráfico apresentando os valores em logaritmo (base 2) da expressão do mRNA do gene TcExp02H01 em ensaios por microarranjo. O experimento utilizou dados de quatro experimentos independentes. Epi1 a Epi4: epimastigota; Met1 a Met4: tripomastigota metacíclico; Trp1 a Trp4: tripomastigota de cultura de célula; Ama1 a Ama14: amastigota. O valor zero representa a média dos sinais de expressão das 16 amostras. ns: valores de teste t não significativos. Valor do teste F indicado no canto superior direito da figura.
A busca por outras proteínas com a mesma organização dos domínios de H01 em T. cruzi e em outros organismos revelou que apenas tripanossomatídeos possuem uma proteína com a exata combinação de domínios de H01, sugerindo que seja uma peptidase exclusiva destes organismos. Quando as seqüências das proteínas ortólogas de outros tripanossomatídeos são comparadas à H01, nota-se um alto grau de conservação entre as seqüências (Figura 5.6).
Para realizar as observações sobre a conservação das seqüências protéicas, foram utilizadas seqüências de tripanosomatídeos que já possuem informações sobre seus genomas disponíveis em servidores on-line.
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Figura 5.6. Demonstração do alinhamento múltiplo realizado pelo ClustalW com seqüências de tripanossomatídeos próximos ao T.cruzi. A imagem mostra o alinhamento da região N – terminal das proteínas. Em vermelho: aminoácidos básicos; em roxo: aminoácidos ácidos; em amarelo: prolina; em azul: demais aminoácidos não polares; em laranja: glicina, em abóbora: cisteína; em verde: demais aminoácidos polares não carregados.
A expressão de H01 foi identificada nas frações insolúveis, presente nos corpúsculos de inclusão, migrando em gel de poliacrilamida na altura próxima de 100 kDa, confirmado por Western blot (Figura 5.7). A proteína foi isolada com sucesso por cromatografia de afinidade e por diálise, sendo em seguida, concentrada para inoculação.
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Figura 5.7. Processo de expressão e confirmação da produção de TcExp02H01. Esquerda: Processo de expressão e confirmação por Western blot realizado com anti histidina em fração insolúvel. Direita: Gel de acrilamida demonstrando a purificação da proteína TcExp02H01 por cromatografia de Níquel. M: marcador de tamanho Benchmark; NI: não induzido; FT: fração total do lisado celular; FI: fração contendo proteínas insolúveis; FS: fração contendo proteínas solúveis; FL: fração de lavagem contendo proteínas não ligadas à resina de Níquel. Tamanho predito para TcExp02H01: 96,1 kDa.
Os soros dos dois animais inoculados foram purificados, e mesmo reconhecendo a proteína nativa na altura correta, o soro 1 apresenta uma reação muito forte contra uma segunda proteína, na altura aproximada de 50 kDa (Figura 5.8). Em ambos os casos, a expressão de H01 praticamente não sofre alterações no seu perfil de expressão quando analisados os extratos protéicos das populações de T. cruzi ao longo da metaciclogênese. A segunda proteína detectada pelo soro 1 aparenta ser expressa com grande intensidade no início da metaciclogênese, sofrendo leves decréscimos até o estádio metacíclico onde atinge níveis mínimos de expressão.
Figura 5.8. Padrão de expressão da proteína TcExp02H01 durante a metaciclogênese utilizando o soro anti-H01-1. E3: epimastigotas em 3 dias de cultura; E5: epimastigotas em 5 dias de cultura; S: células sob estresse nutritivo; A3h, A6h, A12h, A18h e A24h: células aderidas após 3, 6, 12, 18 e 24 horas de diferenciação; respectivamente; M: tripomastigotas metacíclicas. Gel carregado com 5 µg de cada extrato protéico (Figura 4.7). Tamanho predito para H01: 96,1 kDa.
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Figura 5.9. Padrão de expressão da proteína TcExp02H01 durante a metaciclogênese utilizando o soro anti-H01-2. E3: epimastigotas em 3 dias de cultura; E5: epimastigotas em 5 dias de cultura; S: células sob estresse nutritivo; A3h, A6h, A12h, A18h e A24h: células aderidas após 3, 6, 12, 18 e 24 horas de diferenciação; respectivamente; M: tripomastigotas metacíclicas. Gel carregado com 5 µg de cada extrato protéico (Figura 4.7). Tamanho predito para H01: 96,1 kDa.
As visíveis diferenças nos padrões encontrados utilizando ambos os soros pode ser resultado da especificidade do soro produzido contra os domínios da proteína H01. O soro 1 pode estar reconhecendo os domínios da proteína H01 em outras proteínas, resultando num soro contendo anticorpos para epítopos compartilhados, por exemplo.
Em seguida, após a confirmação da qualidade dos soros, foram realizados ensaios de imunolocalização. Foi decidido pela utilização do soro anti-H01-2 por não possuir a evidente reação apresentada pelo soro 1 contra a(s) proteína(s) de 50 kDa. A imunolocalização indica que a proteína H01 aparenta estar localizada de forma dispersa pelo citosol (Figura 5.10).
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Figura 5.10. Padrão de Imunolocalização da proteína TcExp02H01 em epimastigotas. Esquerda: Imagem de campo claro; Direita: Imagem de microscopia ótica de fluorescência. A marcação em verde representa proteínas reconhecidas pelo soro produzido contra proteína TcExp02H01; Marcação em azul demonstra a presença de DNA.
Com intuito de conhecer as interações moleculares que a proteína H01 é capaz de realizar, ensaios de coimunoprecipitação são essenciais. Foram realizados ensaios de imunoprecipitação para a proteína H01 e para as demais proteínas do presente projeto. A análise das proteínas capturadas ainda não foi realizada e aguarda, no momento, a aquisição da plataforma de análises proteômicas. Outra estratégia importante para o entendimento da natureza de H01 seria a expressão da proteína na sua conformação nativa, possibilitando assim estudos funcionais para confirmação de sua atividade proteolítica. Ambos os experimentos propiciarão respectivamente, o conhecimento dos possíveis substratos e agentes regulatórios da protease e permitirão realizar a confirmação bioquímica da sua atividade proteolítica.
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