A proteína TcExp02H07 apresenta-se como sendo uma proteína pertencente à família de cochaperonas HSP40 ou DnaJ (Figura 5.45). As proteínas com domínio J fazem parte do grande grupo protéico das chaperonas que possuem o papel de manter a estrutura tridimensional de outras proteínas celulares.
Figura 5.45. Resultado da análise da proteína TcExp02H07 pelo banco de famílias protéicas PFAM. Description: descrição do domínio; Entry type: tipo de domínio encontrado; Sequence: tamanho das seqüências, HMM; região modelo usado peelo programa, Bits score e E-valeu: valores estatísticos que demonstram a chance do alinhamento ter ocorrido ao acaso.
Proteínas da família HSP40 atuam regulando a atividade ATPase de chaperonas da família HSP70 (Cheetham & Caplan, 1998). De forma geral, proteínas HSP70 (DnaK) possuem baixa taxa de hidrólise de ATP, e a conformação com capacidade de se ligar à ATP possui baixa afinidade a proteínas com problemas de dobramento. Porém, na presença de proteínas DnaJ estas condições se alteram e as chaperonas HSP70 atuam de forma eficaz. Por isso, o emprego do termo ‘co-chaperona’ na denominação das DnaJs.
O domínio J é uma região de aproximadamente 70 aminoácidos, encontrado primeiramente na proteína DnaJ em Escherichia coli (Bardwell et al., 1986). Esta região é responsável pela interação entre as chaperonas HSP40 e HSP70, sendo essencial a presença do motivo altamente conservado HPD (Qian et al., 1996; Walsh et al., 2004; Mayer et al., 2005). Mutantes para o motivo HPD perdem a capacidade de realizar interações com chaperonas HSP70 (Cheetham & Caplan, 1998).
Os projetos genomas da atualidade revelaram que muitos organismos, desde bactérias até seres humanos, possuem múltiplos genes para chaperonas HSP40 e HSP70. É curioso observar a grande expansão das duas famílias ao longo do tronco evolutivo. A grande representatividade destas famílias ao longo da evolução apenas sugere a importância que estas proteínas possam ter no metabolismo celular. A causa desse fenômeno de expansão é desconhecida. A figura 5.46 apresenta uma
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breve comparação entre o número de proteínas de família HSP40 encontradas em alguns organismos modelos.
Figura 5.46. Número de proteínas da família HSP40. No eixo Y estão listados organismos modelos. No eixo X a quantidade de proteínas da família HSP40 encontradas nos organismos (sem redundância). Adaptado de Miernyk, 2001 e Qiu et al, 2006.
A princípio percebe-se que não há aparentemente uma relação clara entre complexidade de um organismo e o número de co-chaperonas HSP40 em seu genoma. A grande presença destas proteínas provavelmente se deve a outros aspectos da biologia dos organismos. Um fator crucial a ser levado em conta é a forma como o complexo HSP40-HSP70 trabalha. Com intuito de descobrir como a relação entre as duas parceiras ocorre, recentes trabalhos demonstram que a parceria é específica, ou seja, cada HSP40 interage com um número determinado de HSP70 específicas, em vias metabólicas e compartimentos celulares diferentes (Hennessy et al, 2005). Aos pesquisadores envolvidos no esclarecimento de como as chaperonas atuam, emerge agora a trabalhosa necessidade de mapear as interações intra chaperonas.
A família de co-chaperonas HSP40 pode ser dividida em subgrupos com base na presença ou ausência de determinados domínios da proteína (Kelley et al, 1998; Cheetham & Caplan 1998). A DnaJ de E. coli possui 4 domínios; um domínio J, uma região rica em fenilalanina e glicina (acredita-se que seja uma região flexível entre o domínio J e o resto da proteína), um domínio tipo zinc-finger X-C-X(1-5)-C-X3-X5- X2-H-X(3-6)-[H/C] (onde X pode ser qualquer tipo de resíduo e o númeor entre
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colchetes indica a quantidade de resíduos) de interação com demais proteínas e uma região C- terminal não caracterizada.
As DnaJs de grupo I possuem todos os quatro domínios. DnaJs de grupo II possuem o domínio J e a região rica em fenilalanina e glicina ou a região zinc-finger; proteínas DnaJs de grupo III possuem apenas o domínio J e, por fim, proteínas DnaJ de grupo IV possuem apenas o domínio J, porém, sem o motivo HPD (acredita-se que sejam co-chaperonas exercendo alguma outra atividade diferente da interação com HSP70). A figura 5.47 apresenta a distribuição das proteínas de T.cruzi nas 4 famílias de HSP40.
Figura 5.47. Número de genes de cada subgrupo das HSP40. No eixo Y está representado a quantidade de genes encontrados. No eixo X estão listados os 4 subgrupos da família DnaJ.
Utilizando da nomenclatura proposta por Folgueira & Requena para as proteínas da família HSP40 em T. cruzi, o presente trabalho adotou a sigla ‘TcJ32’ para a classificação da proteína TcExp02H07 dentre as demais HSP40. (Folgueira & Requena, 2007). A proteína H07 apresenta na sua estrutura os 4 domínios necessários para caracterizá-la como proteína do grupo I, apresentando um alto grau de conservação entre os tripanossomatídeos analisados (Figura 5.48).
Os padrões vistos pelas sondas no microarranjo indicam que o gene H07 não possui uma expressão diferenciada durante a metaciclogênese (Figura 5.49).
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Figura 5.48. Demonstração do alinhamento múltiplo realizado pelo ClustalW com seqüências de tripanossomatídeos próximos ao T.cruzi. Em vermelho: aminoácidos básicos; em roxo: aminoácidos ácidos; em amarelo: prolina; em azul: demais aminoácidos não polares; em laranja: glicina, em abóbora: cisteína; em verde: demais aminoácidos polares não carregados.
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Figura 5.49. Gráfico apresentando os valores em logaritmo (base 2) da expressão do mRNA do gene TcExp02H07 em ensaios por microarranjo. O experimento utilizou dados de quatro experimentos independentes. Epi1 a Epi4: epimastigota; Met1 a Met4: tripomastigota metacíclico; Trp1 a Trp4: tripomastigota sangüínea de cultura; Ama1 a Ama14: amastigota. Os valores de expressão partem do valor zero, representado pela média dos sinais de expressão. Ns: valores de teste t não significativos. Valor do teste F indicado no canto superior direito da figura.
A expressão e a purificação da proteína recombinante ocorreram com sucesso e o antissoro purificado foi empregado em Western blots para análise da expressão durante a metaciclogênese (Figura 5.50).
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Figura 5.50. Esquerda: Imagem do gel de acrilamida contendo alíquotas do processo de expressão e fracionamento celular. Direita: Gel de acrilamida demonstrando a purificação da proteína H07 por cromatografia de Níquel. M: marcador de massa molecular Benchmark, NI: não induzido, FT: fração total do lisado celular, FI: fração contendo proteínas insolúveis, FS: fração contendo proteínas solúveis, W: Western blot da fração insolúvel utilizando soro anti-histidina, FL: fração de lavagem contendo proteínas não ligadas à resina de Níquel. Massa molecular predita para TcExp02H07: 42,9 kDa.
Figura 5.51. Padrão de expressão da proteína TcExp02H07 durante a metaciclogênese utilizando o soro anti-H07. E3: epimastigotas em 3 dias de cultura, E5: epimastigotas em 5 dias de cultura, S: células sob estresse nutritivo, A3, A6, A12, A18 e A24: células aderidas após 3, 6, 12, 18 e 24 horas de diferenciação, respectivamente, M: tripomastigotas metacíclicas. Gel carregado com 5 µg de cada extrato protéico (Figura 4.7). Tamanho predito para H07: 42,9 kDa.
Analisando a Figura 5.51, nota-se a presença de uma banda (50 kDa) presente em todos os estádios, estando sutilmente mais intensa em extratos de metacíclicos, uma segunda banda mais fraca logo abaixo da primeira, entre 40 e 50 kDa e uma terceira banda mais baixa (aproximadamente 35 kDa) que varia sua presença nos extratos de acordo com o estádio observado. O tamanho esperado para a proteína H07 seria de 43 kDa.
A fim de diminuir as reações cruzadas, possivelmente com algumas outras cochaperonas que possuíssem o domínio J altamente conservado, foi realizada a clonagem e expressão da proteína contendo uma deleção dos 70 aminoácidos iniciais, removendo assim o domínio J do peptídeo utilizado para imunização. A nova proteína utilizada, denominada de ∆TcExp02H07 (∆JH07) também foi clonada e expressa com sucesso (Figura 5.52). Por conta da alta titulação obtida e pela qualidade da reatividade (o soro não reage contra proteínas de E. coli), decidiu-se
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analisar os padrões de reconhecimento do soro obtido sem submetê-lo ao processo de purificação.
Figura 5.52. Esquerda: Imagem do gel de acrilamida contendo alíquotas do processo de expressão e fracionamento celular. Direita: Gel de acrilamida demonstrando a purificação da proteína ∆H07 por cromatografia de Níquel. M: marcador de tamanho Benchmark, NI: não induzido, FT: fração total do lisado celular, FI: fração contendo proteínas insolúveis, FS: fração contendo proteínas solúveis, W1: Western blot da fração insolúvel utilizando soro anti histidina, FL: fração de lavagem contendo proteínas não ligadas à resina de Níquel. Tamanho predito para TcExp02H07: 42,9 kDa.
O Western blot realizado com o soro anti-∆JH07 produziu um perfil de reconhecimento semelhante ao soro previamente utilizado e purificado (Figura 5.53). O padrão complexo observado nos dois casos é de difícil interpretação e necessita de uma abordagem direta utilizando de análises proteômica. É possível observar que uma das bandas, a de maior tamanho (50 kDa), mantém sua expressão estável ao longo da metaciclogênese, aumentando a sua expressão no extrato de tripomastigota metacíclico, enquanto que, da mesma forma, a proteína mais leve presente no Western, desaparece do extrato na fração metacíclica. Apesar dos padrões de reconhecimento, ambos os soros foram utilizados para ensaios de localização celular.
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Figura 5.53. Padrão de expressão da proteína TcExp02H07 durante a metaciclogênese utilizando o soro anti-∆JH07. E3: epimastigotas em 3 dias de cultura, E5: epimastigotas em 5 dias de cultura, S: células sob estresse nutritivo, A3, A6, A12, A18 e A24: células aderidas após 3, 6, 12, 18 e 24 horas de diferenciação, respectivamente, M: tripomastigotas metacíclicas. Gel carregado com 5 µg de cada extrato protéico. (Figura 4.7). Massa molecular predita para TcExp02H07: 42,9 kDa.
A Imagem obtida pela imunolocalização utilizando o soro anti-H07, vista na figura 5.54, indicam que o soro está reagindo contra alvos no citoplasma e na membrana celular, evidenciando uma leve marcação mais acentuada próxima à membrana plasmática.
Figura 5.54. Padrão de Imunolocalização da proteína TcExp02H07 em epimastigotas. Esquerda: Imagem de campo claro; Direita: Imagem de microscopia ótica de fluorescência. A marcação em verde representa proteínas reconhecidas pelo soro produzido contra proteína TcExp02H07; Marcação em azul demonstra a presença de DNA. Padrão de localização celular utilizando o soro anti-H07 purificado.
O soro produzido contra a proteína truncada possui uma reatividade diferente do primeiro indicando a presença da proteína (ou do complexo protéico evidenciado pelo Western blot) na região de tráfego de vesículas, estando mais presente na região anterior da célula, incluindo o flagelo (Figura 5.55).
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Figura 5.55. Padrão de Imunolocalização da proteína TcExp02H07 em epimastigotas. Esquerda: Imagem de campo claro; Direita: Imagem de microscopia ótica de fluorescência. A marcação em verde representa proteínas reconhecidas pelo soro produzido contra proteína TcExp02H07; Marcação em azul demonstra a presença de DNA. Padrão de localização celular utilizando o soro anti-∆JH07.
Ao utilizar o soro anti-H07 em ensaios de localização celular por microscopia eletrônica, as esferas de ouro apresentam-se concentradas na membrana plasmática e no flagelo.
Analisando os ensaios de microscopia, pode-se notar que ocorrem coincidências no reconhecimento pelos anticorpos marcados. O soro anti-H07, apresenta uma forma mais difusa de reconhecimento, resultando em células marcadas no seu citoplasma e subcompartimentos como a membrana plasmática e parte do flagelo. Como fora comentado anteriormente, o padrão difuso pode ser uma decorrência do reconhecimento dos dominios presentes na proteína, o que levaria ao reconhecimento de outras proteínas. O fragmento da proteína truncada produzida, utilizado nas imunizações das cobaias, direciona a produção dos anticorpos para regiões da proteína que não são compartilhadas com outras proteínas do parasita, produzindo ao final um padrão de reconhecimento parcialmente similar ao primeiro soro. Isto pode ser considerado como uma explicação pela ausência de marcação citoplasmática. De forma geral, os resultados dos soros utilizados indicam que a proteína H07 provavelmente seja uma co-chaperona de atividade associada à membrana celular e às proteínas de interação com o flagelo (Figura 5.56).
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Figura 5.56. Microscopia eletrônica de transmissão realizada em epimastigotas em fase logarítmica de crescimento utilizando o soro anti proteína TcExp02H07. As flechas pretas indicam a presença da proteína associada à membrana plasmática e na membrana do flagelo. N: núcleo celular; F: flagelo. Aumento de 82.000X.
A família das chaperonas possui uma diversificação muito grande de vias metabólicas em que atuam e compartimentos celulares em que estão presentes. Pesquisas realizadas sob o foco da interação entre o parasita e a célula hospedeira indicam que parasitas intracelulares modificam o interior do hospedeiro em busca de melhores condições de crescimento. No caso da infecção causada pelo Plasmodium falciparum, várias proteínas são secretadas, entre elas muitas são chaperonas (Botha et al, 2007). Em uma tentativa de analisar se a proteína H07 é secretada durante o processo de infecção, células VERO foram infectadas com tripomastigotas metacíclicos (Figuras 5.57 e 5.58), e a presença da proteína foi investigada utilizando ambos os soros produzidos (anti-H07 e anti-∆JH07).
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Figura 5.57: Imunolocalização da proteína TcExp02H07 durante o processo de infecção utilizando o soro anti-∆H07. No alto: É possível observar na imagem o parasita em diferentes estádios de desenvolvimento. Em baixo: Célula VERO aparentemente não infectada, a imagem demonstra a reatividade do soro contra proteínas mamíferas.
As imagens da Figura 5.57 indicam que o soro anti ∆JH07 é capaz de reconhecer a proteína em diferentes estádios celulares do parasita (amastigotas e tripomastigotas metacíclicas). Reconhece, também, proteínas presentes no hospedeiro, no citoplasma e no núcleo. Utilizando o soro anti-H07 a reação continua ocorrendo com as proteínas presentes no parasita. Entretanto o perfil de reação com a célula hospedeira é notadamente diferente, já que não reage com o núcleo da célula e sim com poucas proteínas solúveis no citoplasma (Figura 5.58).
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Figura 5.58: Imunolocalização da proteína TcExp02H07 durante o processo de infecção utilizando o soro anti-H07. É possível observar na imagem o parasita em diferentes estádios de desenvolvimento. O soro também reage fortemente com as proteínas do parasita, porém em menor grau com proteínas presentes na célula hospedeira.
Como todas as células da cultura utilizada para infecção apresentaram parasitas, não foi possível visualizar nenhuma célula VERO livre de parasitas para se descartar a possibilidade de reação do soro anti-proteína H07 contra proteínas de mamíferos. Para se concluir se a proteína H07 realmente está sendo secretada ao hospedeiro ou se o soro está mesmo reconhecendo alguma proteína do hospedeiro, resta-nos realizar a mesma imunofluorescência utilizando o soro anti H07 em células VERO não infectadas.
Com relação aos estudos sobre a proteína H07 ficam em aberto algumas questões a serem resolvidas. Primeiramente, deve-se buscar um melhor entendimento do padrão de reconhecimento protéico visualizado nos ensaios de Western blot. Em seguida é essencial o entendimento específico da função da proteína H07, principalmente sua rede de interações, como, por exemplo, a busca pela proteína HSP70 que possui sua função regulada pela H07. Para tal estudo, é necessária uma análise de interações utilizando os próprios soros gerados em ensaios de imunoprecipitação.
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